５０・ 检验医学２０１２年１月第２７卷第１ 文章编号：１６７３－８６４Ｏ（２０１２）０１－ｏ０５Ｏ－ｏ７ 中图分类号：Ｑ５１３ 文献标志码：Ａ 运用双向荧光差异凝胶电泳分析ＶＬＤＬ致 ＴＨＰ・１来源泡沫细胞的形成 鲁艳军 ， 田俊 ， 狄勇 ， 宗义强 （１．华中科技大学同济医学院附属同济医院检验科，湖北武汉４３００３０； ２．华中科技大学同济医学院生物化学与分子生物学系，湖北武汉４３００３０） 摘要：目的运用双向荧光差异凝胶电泳结合质谱技术寻找极低密度脂蛋白（ＶＬＤＬ）致诱导分化的ＴＨＰ．１ ＴＨＰ一１细胞经佛波醇脂（ＰＭＡ）诱导 细胞形成泡沫细胞中的关键蛋白质，以期揭示其致泡沫细胞的机制。方法分化为巨噬细胞，以磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）孵育为空白对照组、ＶＬＤＬ孵育为实验组。提取细胞总蛋白后分别用荧 光染料ＣＹ３和ＣＹ５标记，以所有样本等量混合作为“内标”，用ＣＹ２标记，然后将实验组、空白对照组及内标混 合后进行二维电泳，扫描图像后经分析的差异蛋白做基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（ＭＡＬＤＩ—Ｔ０Ｆ—ＭＳ）。 采用逆转录一聚合酶链反应（ＲＴ—ＣＰＲ）分析３种蛋白质（脂肪分化相关蛋白、烯醇化酶１、磷酸甘油酸变位酶１） ｍＲＮＡ的变化。结果实验组与空白对照组比较，表达量上调蛋白点在１．２倍以上有３４个，表达量下调１．２倍 以上有４８个。通过软件筛选其中１４个有差异的蛋白点做ＭＡＬＤＩ—ＴＯＦ—ＭＳ，其中脂肪分化相关蛋白、热休克蛋白 ２７、人电子转移味蛋白三维结构一链Ａ、ｓｌＯ０钙结合蛋白、人过氧化物酶。３．异构体Ｃ、辅酶．细胞色素Ｃ还原酶核心 蛋白Ｉ、过氧化物酶烯酰辅酶Ａ水合酶样蛋白、富马酸合酶一异构体ｄ表达增高，烯醇化酶１、磷酸甘油酸变位酶 １、环孢素Ａ结合双肽甘氨酸一脯氨酸复合物、ＤＭＧＤＨ蛋白、核内不均一核糖核蛋白Ｌ一异构体ａ、果糖胺３激酶一异 构体ｂ表达降低。脂肪分化相关蛋白ｍＲＮＡ表达明显上调，烯醇化酶１、磷酸甘油酸变位酶１ ｍＲＮＡ表达明显下 调，与蛋白水平变化一致。结论成泡沫细胞的机制奠定了基础。 关键词：极低密度脂蛋白；双向荧光差异凝胶电泳；泡沫细胞；蛋白质组 荧光差异凝胶电泳能在整体上揭示ＶＬＤＬ在致泡沫细胞形成过程中蛋白质水 平的变化，经鉴定的蛋白质可能在ＶＬＤＬ致泡沫细胞的形成中发挥重要的作用，为阐明ＶＬＤＬ作用巨噬细胞形 Ｔｗｏ—ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｉｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ＶＬＤＬ・ｉｎｄｕｃｅｄ ＴＨＰ－１ ｆｏａｍ ｃｅｌｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＬＵ Ｙａｎｊｕｎ ，ＴＩＡＮ Ｊｕｎ ，ＤＩ Ｙｏｎｇ２，ＺＯＮＧ Ｙｉｑｉａｎｇ２． （１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｔｏｎｇｉｉ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｔｏｎ￣ｉｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈｕｂｅｉ Ｗｕｈａｎ ４３００３０，Ｃｈｉｎａ；２． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｔｏｎｇｆｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ｕｎｗｅ￣ｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈｕｂｅｉ Ｗｕｈａｎ ４３００３０，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：０ｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｔｈｅ ｋｅｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ＴＨＰ一１ ｆｏａｍ ｃｅｌｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｖｅｒｙ ｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＶＬＤＬ）ｔｈｒｏｕｇｈ ｕｓｉｎｇ ｔｗｏ—ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＤＩＧＥ） ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｏａｍ ｃｅｌｆ１．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ＴＨＰ一１ ｃｅｌｌｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｐｈｏｒｂｏｌ ｅｓｔｅｒ（ＰＭＡ），ｉｎｃｕｂａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ＰＢＳ）ａｓ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｉｎｃｕｂａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＶＬＤＬ ａｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｇｒｏｕｐ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｔｌ ｃｅｌａｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌａｂｅｌｅｄ ｗｉｔｈ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｄｙｅ ＣＹ３ ａｎｄ ＣＹ５， ｔｈｅ ｍｉｘｔｕｒｅ ｏｆ ａｌｌ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｅｑｕａｌｌｅｄ ａｓ ａｎ”ｉｎｔｅｒｎａｌ ｓｔａｎｄａｒｄ”。ｌａｂｅｌｅｄ ｗｉｔｈ ＣＹ２．Ｔｈｅ ｍｉｘｔｕｒｅ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｌ ａｇｒｏｕｐ，ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｓｔａｎｄａｒｄ ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ＤＩＧＥ ａｎｄ ｍａｔｒｉｘ—ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｆ ｌｆｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｙ（ＭＡＬＤＩｒ．ＴＯＦ．ＭＳ）．Ｔｈｅ ３ ｐｒｏｔｅｉｎ（ａｄｉｐｏｓｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ—ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｅｎｏｌａｓｅ １ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｍｕｔａｓｅ １、ｍＲＮＡ ｃｈａｎｇｅｓ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｗｉｔｈ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ—ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ— ＰＣＲ ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｇｒｏｕｐ ｗｉｔｈ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ３４ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｐｏｔｓ ｕｐ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ＞１・２ ｔｉｍｅｓ，ａｎｄ ４８ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｐｏｒｓ ｄｏｗｎ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ＞１．２ ｔｉｍｅｓ．Ａ ｔｏｔａｌ ｏｆ １４ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｐｏｔｓ ｄｅｆｉｎｅｄ ａｓ”ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ ｓｐｏｔｓ”ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉ矗ｅｄ ｂｖ ＭＡＬＤＩ．ＴＯＦ—ＭＳ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ ａｄｉｐｏｓｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ—ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ２７ｋＤａ ｐｒｏｔｅｉｎ １， 作者简介：鲁艳军，男，１９８１年生，博士，住院医师，主要从事动脉粥样硬化的蛋白组学研究。 检验医学２０１２年１月第２７卷第ｌ期Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊａｎ ！ ， ！：Ｎ０ ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｆｌａｖｏｐｒｏｔｅｉｎ ｔｏ ２．１ Ａ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ—Ｃｈａｉｎ Ａ，Ｓ１００ ｃａｌｃｉｕｍ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｌ ｌ，ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ ３－ｉｓｏｆｏｎｎ ＣＲＡｃ，ｕｂｉｑｕｉｎｏｌ—ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉ，ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ ｅｎｏｙｌ— ——ｎｃｒｅａｓｅｄ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ ｅｎｏｌａｓｅ ｌ， ｅｏｅｎｚｙｍｅ Ａ ｈｙｄｒａｔａｓｅ—ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｆｕｍａｒａｔｅ ｈｙｄｒａｔａｓｅ—ｉｓｏｆｏｒｍ ＣＲＡｄ ｗｅｒｅ ｉｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｍｕｔａｓｅ １，ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ Ａ ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ Ｇｌｙ—Ｐｒｏ，ＤＭＧＤＨ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｕｃｔｏｓａｍｉｎｅ ３ ｋｉｎａｓｅ—ｉｓｏｆｏｒｍ ＣＲＡｂ ｗｅｒｅ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ．Ｔｈｅ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒ０ｔｅｉｎ Ｌ—ｉｓｏｆｏｒｍ ＣＲＡａ ａｎｄ ｆ——ａｄｉｐｏｓｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ—ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ，ａｎｄ ｔｈｅ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ ｅｎｏｌａｓｅ １ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｍｕｔａｓｅ １ ｗｅｒｅ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ ＤＩＧＥ ｈａｓ ｒｅｖｅＮｅｄ ａ ｗｈｏｌｅ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ＶＬＤＬ—ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｏａｍ ｃｅｌｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｄｅｎｔｉｉｅｄ ｍａｙ ｐｌａｙ ａｎ ｉｆｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ，ｗｈｉｃｈ ａｓ ｔｈｅ ｇｒｏｕｎｄ ｗｏｒｋ ｆｏｒ ｃｌａｒｉｆｙｉｎｇ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ＶＬＤＬ—ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｏａｍ ｃｅｌｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｖｅｒｙ ｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ；Ｔｗｏ—ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ；Ｆｏａｍ ｃｅｌｌ； Ｐｒｏｔｅ．ｏｍｉｃｓ 有研究 表明，在高甘油三酯（ＴＧ）血症的人 群中，动脉粥样硬化的发生与血浆中增高的极低 密度脂蛋白（ＶＬＤＬ）及ＶＬＤＬ来源的残余脂质颗 粒成正相关。ＶＬＤＬ能够进入血管内皮下导致细 泡沫细胞过程中某些关键蛋白表达的改变，以探 讨对泡沫细胞形成的作用影响。 材料和方法 一胞内脂质的堆积 』，体外实验也表明ＶＬＤＬ能诱 导泡沫细胞形成 Ｊ。然而，富含ＴＧ的ＶＬＤＬ与 、ＶＬＤＬ的制备 取１００ ｍＬ人新鲜血浆，１８ ０００×ｇ离 ｔ￣，４０ ｍｉｎ 富含胆固醇的低密度脂蛋白（ＬＤＬ）在致泡沫细胞 形成乃至动脉粥样硬化的机制不尽相同。ＬＤＬ经 修饰后主要通过ＣＤ３６介导的胞吞作用而引起脂 去除乳糜微粒，然后按每毫升血浆加０．２２６ ｇ溴化 钠（ＮａＢｒ）调整血浆密度至１．２＃ｍＬ。于离心管中 依次加入密度为１．００６ ｇ／ｍＬ的氯化钠（ＮａＣ１）、 １．０６３ ｇ／ｍＬ的ＮａＢｒ和１．２ ｇ／ＨｌＬ的血浆。采用 Ｌ８—８０型超速低温离心机（美国贝克曼公司）以 ３００ ０００×ｇ超速离心５ ｈ。取离心管中顶层ＶＬＤＬ 液体（密度＜１．００６ ｇ／ｍＥ），经ＰＢＳ透析后于４℃避 质堆积，而富含ＴＧ的ＶＬＤＬ导致胞内脂质的堆积 有２种方式。一种是与细胞表面的脂肪酶（ＬＰＬ） 作用，经ＬＰＬ的脂解，生成的游离脂肪酸直接进 入胞内酯化为ＴＧ储存起来。另一种方式是经过 极低密度脂蛋白受体（ＶＬＤＬＲ）介导的胞吞作 用 Ｊ。２种脂蛋白进入细胞后激活不同的核受体 而影响胞内脂质堆积，氧化的ＬＤＬ主要通过激活 光保存，保存不超过２周。 二、细胞培养 ＴＨＰ—ｌ细胞［购自美国模式培养物集存库 （ＡＴＣＣ）］用含１０％胎牛血清的１６４０培养基在 过氧化物酶体增殖物激活受体＾ｙ（ＰＰＡＲ．＾ｙ）而调 节ＡＴＰ结合盒转运子Ａ１（ＡＢＣＡ１）及清道夫受体 （ＳＲ）等来改变脂质对细胞的堆积，而ＶＬＤＬ主要 激活氧化物酶体增殖物激活受体８（ＰＰＡＲ．６），上 调肉碱脂酰转移酶－１（ＣＰＴ一１），而影响胞内脂质 ３７ ｃ【＝、５％ＣＯ 的环境中培养，待细胞密度达１× １０。／ｍＬ，加入２００ ｎｍｏｌ／Ｌ ＰＭＡ诱导２４ ｈ后更换 不含血清的１６４０培养基培养２４ ｈ，然后加入 ５０ ｐ．ｇ／ｍＬ ＶＬＤＬ孵育４８ ｈ。 堆积 Ｊ。目前关于富含胆固醇的脂蛋白ＬＤＬ、氧 化低密度脂蛋白（ＯＸ—ＬＤＬ）作用的巨噬细胞形成 三、细胞总蛋白的提取 将孵育后的细胞经ＰＢＳ洗涤去除培养基，然 后用细胞刮刮下细胞，加２００ ＩｘＬ细胞裂解液 ［３０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＴｒｉｓＣ、７ ｍｏｌ／Ｌ尿素，２ ｍｏｌ／Ｌ硫脲、 泡沫细胞机制比较深入，但由富含ＴＧ的脂蛋白 ＶＬＤＬ作用而形成泡沫细胞的机制还鲜见报道。 我们拟通过双向荧光差异凝胶电泳（２Ｄ． ＤＩＧＥ）得到ＶＬＤＬ孵育的经佛波醇酯（ＰＭＡ）诱导 ４％３－（３－胆胺丙基）二甲氨基．１．丙磺酸 （ＣＨＡＰＳ），ｐＨ值８．５］冰浴３０ ｍｉｎ，期间不停震 荡。然后用超声细胞破碎仪冰浴中每次超声 １０ ｓ，共５次。以５ ０００×ｇ离心７０ ｍｉｎ，收集上清 后用２－ＤＱｕａｎｔＫｉｔ试剂盒进行蛋白定量。 四、荧光染料标记 的ＴＨＰ一１细胞与经磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）孵育的空 白对照细胞的蛋白质图谱，并用相应的软件分析 其差异，以探讨ＶＬＤＬ致泡沫细胞形成过程中特 定蛋白表达量发生的变化。初步观察ＶＬＤＬ在致 检验医学２０１２年１月第２７卷第１期Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊａｎｕａｒｙ ２０１２，Ｖｏｌ ２７．Ｎｏ １ 制备的样本经精确定量后按５０ ｇ蛋白样 本／４００ ｐｍｏｌ荧光染料（Ｃｙ３或Ｃｙ５）（购自美国通 用电气医疗集团）冰上避光反应３０ ｍｉｎ，然后加 入１０ ｍｍｏｌ／Ｌ赖氨酸１ 终止反应。将Ｃｙ３标 记的样本、Ｃｙ５标记的样本以及Ｃｙ２标记的内标 混合后，加等体积２×ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ［７ ｍｏｌ／Ｌ尿 素、２ ｍｏｌ／Ｌ硫脲，２０ ｍｇ／ｍＬ二硫苏糖醇（ＤＴＹ）、 ４％ＣＨＡＰＳ］混匀，冰上静置１０ ｍｉｎ，用水化液 （８ ｍｏｌｆＬ尿素、４％ＣＨＡＰＳ，０．５％ＩＰＧ３．１０ ｂｕｆｆｅｒ、 １０ ｍｇ／ｍＬ Ｄｒｒｒ）补至３５０ Ｌ，准备双向电泳。 五、双向电泳及图象扫描 将含有样本的水化液均匀涂布在胶条槽两电 极之间，将ＩＰＧ干胶条（ｐＨ值３～ｌ０，１８ ｃｍ）胶面 向下，覆盖一层ＩＰＧ ｓｔｒｉｐ ｃｏｖｅｒ ｆｌｕｉｄ，盖上胶条槽 盖，设置等点聚焦电泳（ＩＥＦ）程序为：３０ Ｖ １２ ｈ、 ２００ Ｖ １ ｈ、５００ Ｖ １ ｈ、１ ０００ Ｖ １ ｈ、８ ０００ Ｖ ５０ ０００ ｖｈｓ。ＩＥＦ结束后的胶条放在１０ ｍＬ含ｌ％ ＤＴ／＇的十二烷基磺酸钠（ＳＤＳ）平衡液中平衡 １５ ｍｉｎ，然后放在１０ ｍＬ含４％碘代乙酰胺的平衡 液中平衡１５ ｍｉｎ，平衡后置于胶浓度为１２．５％的 聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ．ＰＡＧＥ）胶中，放人 Ｅｔｔａｎ ＤＡＬＴ ｓｉｘ垂直电泳系统中电泳，电泳参数为 ２ Ｗ／胶、１ ｈＥ胶、１５Ｗ／胶，直至溴芬蓝跑至胶底 缘。电泳结束后置Ｔｙｐｈｏｏｎ９４１０多功能扫描成像 系统上扫描，扫描参数为ｃｙ２ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｆｉｌｔｅｒ／ｌａｓｅｒ， 波长比为５２０／４８８ ｎｍ、Ｃｙ３为５８０／５３２ ｎｍ、Ｃｙ５为 ６７０／６３３ ｎｍ。扫描后获取图像。所使用仪器及试 剂均购自美国通用电气医疗集团。 六、二维电泳胶染色、结果分析 电泳结束后，将制备胶放在含０．１％Ｒ一３５０、 １０％冰乙酸、１０％甲醇的染色液过夜，用含１０％冰乙 酸、１０％甲醇的脱色液脱色，直至背景干净。将胶放 在Ｉｍａｇｅｓｅａｎｅｒ扫描仪（美国通用电气医疗集团）上 扫描，扫描参数为３００ ｄｐｉ、ｂｌａｎｋｆｉｈｅｒ、ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｖｅ。 七、质谱鉴定 在制备胶上挖取差异蛋白点经胶内胰酶酶解 ２０ ｈ，然后抽提酶解肽段，经微量层析柱（ＺｉｐＴｉｐ） 脱盐、基质辅助激光解吸电离飞行时间（ＭＡＬＤＩ＿ ＴＯＦ）／ＭＡＬＤＩ．ＴＯＦ／ＴＯＦ质谱（ＭＡＬＤＩ—ＴＯＦ—ＭＳ） 和软件分析数据鉴定蛋白质。 八、逆转录．聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）分析 孵育后的细胞经ＰＢＳ洗涤去除培养基后，通 过Ｔｒｉｚｏｌ提取液提取总ＲＮＡ，定量后取８ ｇ ＲＮＡ 作逆转录合成ｃＤＮＡ，进行ＰＣＲ。脂肪分化相关蛋 白上游引物：５ ．ＡＧＧＧｏＣＴＡＧＡＣＡＧＧ 岍ＧＡＧＧＡ． ３ ，下游引物：５ ．ＴＩＴＦＣＴＡＣＧＣＣＡＣＴＧＣＴＣＡＣＧ．３ ； 烯醇化酶上游引物：５ ．ＣＧＣＡ１ＴｒＧＧＡＧＣＡＧＡＧＧ ｒｒＩＴＡＣ－３ ，下游引物：５ 一ＧＣＡＧＴＦＧＣＡＧＧＡＣＴＩ＇Ｃ ＴＣＧ，ＩＴ－３ ；磷酸甘油酸变位酶１上游引物：５ ． ＧＡＧＣＣＣＧＡＣＣＡＴＣＣＴＩ￣ＣＴＡＣＡ－３ ，下游引物： ＣＡＧＴＣＧＧＣＡＧＧ１－ｒＣＡＧＣ．．３。Ｂ．ａｃｔｉｎ上游引物：５ ． ＴＧＡＧＡＣＣＴｒＣＡＡＣＡＣＣＣＣＡＧ－－３，下游引物：５ ． ＧＣＣＡＴＣＴＣ１ＴＩ’ＧＣＴＣＧＡＡＧＴＣ－－３。扩增条件如下： ９５℃５ ｍｉｎ，９５ ｏＣ ４５ Ｓ，５５ ｃｃ ４５ ｓ，７２℃４５ Ｓ，共 ３０个循环。ＰＣＲ产物经含溴化乙锭的２％琼脂糖 胶电泳，并在紫外灯下成像。试剂购自美国伯乐生 命医学产品有限公司。 结 果 一、油红染色观察泡沫细胞的形成 为了观察ＶＬＤＬ孵育ＴＨＰ．１源性巨噬细胞后 是否形成泡沫细胞，通过油红Ｏ染色比较ＶＬＤＬ 孵育的细胞（实验组）和ＰＢＳ孵育的细胞（空白对 照组）。ＴＨＰ一１源性巨噬细胞经ＰＭＡ诱导２４ ｈ 后加脂蛋白孵育４８ ｈ，用０．３％油红Ｏ染色，光镜 下观察。结果显示相对于空白对照组，实验组孵 育的细胞胞内脂质明显增多。见图１。 二、２Ｄ—ＤＩＧＥ的图谱 孵育后的细胞提取细胞总蛋白，按５０ ｇ蛋 白样Ｙｑｋ／４００ ｐｍｏｌ荧光染料（Ｃｙ３或Ｃｙ５）标记，所 有样本混合用Ｃｙ２标记，将不同染料标记的样本 混合后于同一胶上做二维电泳，电泳结束后，置 Ｔｙｐｈｏｏｎ９４１０多功能扫描成像系统上扫描捕获图 像。图２中的４幅图是一块胶扫描所得，每块胶 有３种样本，分别为空白对照、实验组及内标，每 种样本为５０ ｇ，由３种不同的荧光染料标记，内 标始终为Ｃｙ２标记。 三、ＭＡＬＤＩ．ＴＯＦ．ＭＳ鉴定差异蛋白 每张胶上平均有２ ４００个蛋白点。实验组与 空白对照组比较，表达量上调蛋白点在１．２倍以 上有３４个，表达量下调１．２倍以上有４８个。通 过软件分析筛选其中１４个蛋白点作ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ。 ＭＳ。见图３、表１。 检验医学２０１２年１月第２７卷第１期Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊａｎｕａｒｙ ２０１２，Ｖｏｌ ２７．Ｊ ｌ 空白对照组实验组 酶被鉴定在ＶＬＤＬ致泡沫细胞的过程中下调。磷 ｌ—ｌ｜＿脂肪分化相关蛋白 Ｂ．ａｃｔｉｎ 酸甘油酸变位酶催化３－磷酸甘油酸转变为２一磷酸 甘油酸，烯醇化酶催化２．磷酸甘油酸转变为磷酸烯 醇式丙酮酸。虽然并未发现糖酵解的关键激酶，但 这些酶的表达下调从机体代谢角度提示胞内糖的 利用减少。Ｓｕｋｈａｎｏ等 的研究显示在氧化ＬＤＬ 孵育的人主动脉平滑肌细胞内糖利用率减少 中表达下调 。可见胞内糖的利用与脂质含量密 烯醇化酶 Ｂ—ａｅｔｉｎ 虽＝ 磷酸甘油酸变位酶１ ６５％，且这２种酶在高脂喂食的鼠的白色脂肪组织 切相关，而已知细胞内游离脂肪酸通过线粒体代谢 Ｂ－ａｄｉｎ 图４ ＲＴ—ＰＣＲ分析３种鉴定蛋白ｍＲＮＡ水平的变化 讨 论 目前已有大量实验表明富含ＴＧ的ＶＬＤＬ在 动脉粥样硬化形成中发挥作用。ＶＬＤＬ可以引起 巨噬细胞脂质堆积形成泡沫细胞，而泡沫细胞形 成已被视为动脉粥样硬化形成早期的重要事件。 与ＬＤＬ相比，ＶＬＤＬ中的载脂蛋白主要是载脂蛋 白Ｅ（ａｐｏ Ｅ），主要脂质成分是ＴＧ。因而ＶＬＤＬ 在致泡沫细胞的形成过程是否存在独特的机制？ 目前鲜有报道。２Ｄ—ＤＩＧＥ是二维电泳（２－ＤＥ）的 新方法，其灵敏度更高（ｐｇ）、所需上样量更少 （５０ ｇ）、得到的结果更稳定可靠（线性范围在５ 个数量级）。由于将不同样本在同一胶上分离， 所需胶的数量更少，重复性更好。本研究运用 ２Ｄ—ＤＩＧＥ结合质谱技术，发现数种可能在ＶＬＤＬ 致泡沫细胞形成中的发挥较重要作用的相关蛋 白，如脂肪分化相关蛋白、糖酵解磷酸甘油酸变位 酶１、烯醇化酶等。 脂肪分化相关蛋白早期被发现参与脂肪细胞 的分化，近来发现其与细胞内脂滴的形成密切相 关。脂肪分化相关蛋白的过量表达可以增加长链 脂肪酸的吸收 。有研究显示脂肪分化相关蛋 白在动脉粥样硬化斑块中的表达比同一血管正常 部位高，脂肪分化相关蛋白的高表达可能是引起 巨噬细胞脂质堆积的重要因素 。另有报道 显示这种蛋白的升高可以抑制ＴＧ经线粒体氧化 途径而促进脂质在细胞内的沉积，因而其升高与 ＴＧ代谢密切相关。而ＶＬＤＬ可以通过激活 ＰＰＡＲ一８来上调其表达，且这种上调发生在转录 水平 。 参与糖酵解的磷酸甘油酸变位酶１和烯醇化 的中间产物抑制糖酵解。因而这２种酶的改变可 能通过影响糖代谢而促进脂质负荷的细胞泡沫化。 辅酶．细胞色素Ｃ还原酶核心蛋白Ｉ和人电 子转移味蛋白三维结构．链Ａ这２种蛋白属于线 粒体电子传递链的一部分，其上调反映细胞线粒 体能量代谢活跃。然而线粒体是超氧阴离子产生 的重要场所，而活性氧的增加及随后产生的氧化 应激已被视为动脉粥样硬化的危险因素¨¨。另 本研究发现位于线粒体膜上的人过氧化物酶一３一 异构体Ｃ也表达上调。人过氧化物酶．３一异构体Ｃ 的主要功能是阻止线粒体活性氧的产生。因而推 测ＶＬＤＬ致泡沫细胞形成过程中胞内由线粒体生 成的活性氧增多，且主要由于ＶＬＤＬ中大量ＴＧ所 致。而Ａｒｏｎｉ等 已经报道经ＴＧ处理过的 Ｊ７７４．２巨噬细胞其胞内活性氧显著升高，且主要 通过线粒体复合物１的电子转移链，这进一步支 持本研究的推测。 ＶＬＤＬ致泡沫细胞中筛选的蛋白质多与脂肪 酸代谢相关，而文献 报道ＯＸ—ＬＤＬ致泡沫细胞 中信号分子丝裂素活化蛋白激酶（ＭＡＰＫ）、电压 依赖性阴离子通道１（ＶＤＡＣ１）及抗氧化酶（过氧 化氢酶、前列腺素氧化环化酶）表达改变。另本 研究仅筛选出热休克蛋白２７的表达上调，而Ｙｕ 等＿ｌ 通过二维电泳发现ＯＸ—ＬＤＬ孵育的巨噬细胞 Ｕ９３７中多种热休克蛋白（热休克蛋白２７、６０、７０） 表达上调。推测上述差异是由２种脂蛋白的组成 不同而引起胞内信号途径变化所致。本研究鉴定 与ＴＧ代谢密切相关的蛋白，进一步将从动脉粥 样斑块组织验证是否也有类似变化，以期为动脉 粥样硬化形成提供新的可能标志物。 参考文献 ［１］Ｈｏｋａｎｓｏｎ ＪＥ，Ａｕｓｔｉｎ ＭＡ．Ｐｌａｓｍａ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｌｅｖｅ１ 检验医学２０１２年１月第２７卷第１期ｉｓ ａ ｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒ ｆｏｒ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｆ ｈｉｇｈ—ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｌｅｖｅｌ：ａ ｍｅｔａ— Ｌａｂｏｒａｔｏ ｌⅥ！ ｉｃｉ ！｛ ！ ！！ ！： ［８］ Ｌａｒｉｇａｕｄｅｒｉｅ Ｇ，Ｃｕａｚ—Ｐ￣ｒｏｌｉｎ Ｃ，Ｙｏｕｎｅｓ ＡＢ，ｅｔ ａ１． Ａｄｉｐｏｐｈｉｌｉｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｔｉｇｌｒｙｃｅｒｉｄｅ ｓｔｏｒａｇｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ—ｂａｓｅｄ ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｓｔｕｄｉｅｓ［Ｊ］． Ｊ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｒｉｓｋ，１９９６，３（２）：２１３—２１９． ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｂｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｂｅｔａ—ｏｘｉｄａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＦＥＢＳ Ｊ，２００６，２７３ （１５）：３４９８—３５１０． ［２］ Ｎｏｒｄｅｓｔｇａａｒｄ ＢＧ，Ｗｏｏｔｔｏｎ Ｒ，Ｌｅｗｉｓ Ｂ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ＶＬＤＬ，ＩＤＬ，ａｎｄ ＬＤＬ ｉｎ ｔｈｅ ａｒｔｅｒｉａｌ ｉｎｔｉｍａ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉｃ ｒａｂｂｉｔｓ ｉｎ ｖｉｖｏ． ［９］ Ｓｕｋｈａｎｏｖ Ｓ，Ｈｉｇａｓｈｉ Ｙ，Ｓｈａｉ ＳＹ，ｅｔ ａ１．Ｎｏｖｅｌ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｏｘｉｄｉｚｅｄ ｌｏｗ—ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ：ｃｅｌｌｕｌａｒ ＡＴＰ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｉｚｅ ａｓ ａ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ ｏｆ ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ ｌｏｓｓ ｆｒｏｍ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｖｉａ ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－－３－－ ｔｈｅ ｉｎｔｉｍａ—ｉｎｎｅｒ ｍｅｄｉａ『Ｊ］．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ［Ｊ］．Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ，２００６，９９ （２）：１９１—２００． Ｓｃｈｍｉｄ ＧＭ，Ｃｏｎｖｅｒｓｅｔ Ｖ，Ｗａｌｔｅｒ Ｎ，ｅｔ ａ１．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｈｉｇｈ—ｆａｔ ｄｉｅｔ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｍｕｓｃｌｅ， Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ，１９９５，１５（４）：５３４—５４２． ［３］ Ｒａｐｐ ＪＨ，Ｌｅｓｐｉｎｅ Ａ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＲＬ，ｅｔ ａ１．Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ— ｒｉｃｈ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｂｙ ｓｅｌｅｃｔｅｄ－－ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｔｉ＿‘ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｐｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ［１０］ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅｓ，ａｎｄ ｌｉｖｅｒ ｏｆ Ｃ５７ＢＬ／６ ｍｉｃｅ［Ｊ］． Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２００４，４（８）：２２７０￣２８２． Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ＲＷ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ａｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ ｒｅｄｏｘ— ａｔｈｅｒｏｓｅｌｅｒｏｔｉｅ ｐｌａｑｕｅ［Ｊ］．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ， １９９４，１４（１１）：１７６７—１７７４． ［４］ Ａｒｇｍａｎｎ ＣＡ，Ｖａｎ Ｄｅｎ Ｄｉｅｐｓｔｒａｔｅｎ ＣＨ，Ｓａｗｙｅｚ ＣＧ， ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｇｅｎｅｓ［Ｊ］．Ｔｒａｎｓ Ａｍ Ｃｌｉｎ Ｃｌｉｍａｔｏｌ Ａｓｓｏｃ， １９９８，１０９：１２９—１４５． Ａｒｏｎｉｓ Ａ，Ｍａｄａｒ Ｚ，Ｔｉｒｏｓｈ Ｏ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｌｉｐｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｏｆ ｅｔ ａ１．Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ—ｂｅｔａ １ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ ｅｓｔｅｒ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ［１２］ ｂｙ ｎａｔｉｖｅ ａｎｄ ｏｘｉｄｉｚｅｄ ＶＬＤＬ ｒｅｍｎａｎｔｓ［Ｊ］． Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ，２００１，２１（１２）： ２０１１—２０１８． Ｊ７７４．２ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｔｏ ｔｒｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌｓ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ［５］ Ｃｈａｗｌａ Ａ，Ｌｅｅ ＣＨ，Ｂａｒａｋ Ｙ，ｅｔ ａ１．ＰＰＡＲ ｄｅｌｔａ ｉｓ ａ ｖｅｒｙ ｌｏｗ—ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｎｓｏｒ ｉｎ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ［Ｊ］．Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ，２００５，３８ （９）：１２２１—１２３０． Ｋａｎｇ ＪＨ，Ｋｉｍ ＨＴ，Ｃｈｏｉ ＭＳ，ｅｔ ａ１．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ０ｆ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ ＴＨＰ．１ ｃｅｌｌｓ ｐｒｉｍｅｄ ｗｉｔｈ ｏｘｉｄｉｚｅｄ 『Ｊ］．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００３，１００（３）： １２６８—１２７３． ［１３］ ［６］ Ｉｍａｍｕｒａ Ｍ，Ｉｎｏｇｕｃｈｉ Ｔ，Ｉｋｕｙａｍａ Ｓ，ｅｔ ａ１．ＡＤＲＰ ｌｏｗ—ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２００６，６ （４）：１２６１—１２７３． ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｌｉｐｉｄ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｉｐｉｄ ｄｒｏｐｌｅｔ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ［Ｊ］．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ，２００２，２８３（４）：Ｅ７７５一Ｅ７８３． Ｘ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ［７］ Ｗａｎｇ Ｘ，Ｒｅａｐｅ ＴＪ，Ｌｉｏｆ ａｄｉｐｏｐｈｉｌｉｎ ｍＲＮＡ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ［１４］ Ｙｕ ＹＬ，Ｙａｎｇ ＰＹ，Ｆａｎ ＨＺ，ｅｔ ａ１．Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｉｎ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ—ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｏａｍ ｃｅｌｌｓ：ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ ｔｗｏ—ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ［Ｊ］． Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｉｎ，２００３，２４（９）：８７３－８７７． ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｏｘｉｄｉｚｅｄ ｌｏｗ—ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ （收稿日期：２０１１－０９－０２） （本文编辑：龚晓霖） ｉｎ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ ｌｅｓｉｏｎｓ［Ｊ］．ＦＥＢＳ ｅｔＬｔ，１９９９，４６２ （１—２）：１４５—１５０． 健 康 给生命带来光和热