重叠PCR—overlap PCR
1.简介
重叠PCR也是基本的PCR原理：变性-退火-延伸。不同的是在重叠PCR过程是两个或者几个片段重叠延伸之后，再进行指数扩增的PCR过程。
2.基本原理
第一步：PCR产生两个或者几个片段，这几个片段之间必须有重叠区。
第二步：以两个片段为例，见上图，第一步产生的两个片段，A D链之间有互补，B C链之间也有互补，但只有A D链互补重叠延伸产生所需要的重叠片段。
第三步：第二步产生的重叠产物，在上下游引物的存在下，即可进行PCR扩增过程。
请仔细看清楚原理，特别是第二步。
3.实际操作注意点
a.第一步PCR之后的产物，可以纯化，也可以吸取几μL作为重叠PCR的模板。
b.第二步和第三步一起称为重叠PCR，实际发生过程分为两个步骤。
c.Taq酶会在末端加A，高保真酶有3’— 5’的外切活性，基于重叠PCR原理和酶的性质，第一步和重叠PCR步骤至少有一步使用高保真酶（或者如Taq Plus、Es Taq之类的，有3’— 5’的外切活性），如果第一步和重叠PCR都使用普通Taq可能重叠PCR会失败。
d.基于重叠PCR原理，上图中第二步A D 链直接的退火很关键，所以有些protocol会建议重叠PCR分两个程序进行也是基于以上原理。重叠区的Tm很关键，或者说退火温度很重要。
4.重叠PCR几个应用场景
a.片段中间引入突变
b.片段中间引入缺失
C.片段中间引入插入片段
d.片段拼接(如不同结构域DNA片段拼接)
e.长片段分段扩增，再重叠PCR拼接。
f.从基因组扩增出外显子，再拼接出完整的CDS区。
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