实验四 根系活力的测定

实验四 根系活力的测定

一、意义

根系是植物对水分和矿质营养的主要吸收器官，同时又是植物体中重要物质如氨基酸、激素等物质合成、同化、转化的器官，因此根的生长情况和活动能力直接影响植物个体的生长情况、营养水平和产量水平等具有重要的实际意义。

在科学研究中常把根系的呼吸强度、阳离子代还量（CEC）、对有色物质的吸附量和ATP酶的活性等作为作物根系活力的指标。 二、测定原理

TTC（2，3，5－氯化三苯基四氮唑）的氧化态是无色的，可被氢还原成不溶性的红色三苯基甲月朁（TTF）。具有活力的组织和细胞在呼吸作用中，脱氢酶催化底物氧化脱氢产生NADH、NADPH 等还原性物质，当TTC渗入组织或细胞时呼吸过程产生的还原物质可将其还原成TTF（红色），组织或细胞被染成红色。死细胞无呼吸，不发生这样的氧化还原反应。应用这一原理，可根据组织或细胞染色情况来检测种子、花粉、根系等的活力。

植物根引起的TTC还原，可因加入琥珀酸、延胡索酸、苹果酸得到加强；而被丙二酸、碘乙酸所严重抑制。还原强度（即根系活力强弱）可用TTF的生成量来表示。TTF在485 nm 处有吸收峰，用乙酸乙酯提取后测定OD485，通过标准曲线计算TTF的生成量，用单位时间 内单位根重产生的TTF表示根系的活力。 三、仪器设备

1. 分光光度计；

2. 分析天平（感量0.1mg）；

3. 托盘天平（感量0.1 g）；

4. 温箱；

5. 研钵：1套；

6．4 cm漏斗：2 个；

7. 量筒10 mL：1 个；

8. 刻度移液管：0.5 mL、2 mL、5 mL；

9．10 mL容量瓶（或10 mL具塞刻度试管）：8个； 10．试管架：1 个；

11. 石英砂适量；

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12. 高型称量瓶（30×60 mm）：2 个。

四、试剂

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1. 乙酸乙酯（分析纯）；

2. 连二亚硫酸钠（Na2S2O4），分析纯，粉末；

3．1 %TTC溶液：准确称取TTC 1.0000 g，溶于少量水中，定容到100 mL，用时稀释至需要浓度；

4．0.1 mol ·L -1 pH 7.5磷酸缓冲液；

5．1 mol ·L -1 硫酸：用量筒取比重1.84的浓硫酸55 mL，边搅拌边加入盛有500 mL蒸馏水的烧杯中，冷却后稀释至1000 mL；

6．0.4 mol ·L -1琥珀酸：称取琥珀酸4.72 g，溶于水中，定容至100 mL。 五、材料

种子萌发后用Hoagland营养液进行培养，采用水培或砂培的方法培养植物材料。生长一定时间后取根系作为实验材料。 六、方法步骤

1. 定性测定

（1） 配制反应液：把1 %的TTC溶液，0.4％ mol ·L -1的琥珀酸和0.1 mol ·L -1 pH 7.5磷

酸缓冲液按1∶5∶4的比例混合。

（2） 将根仔细洗净，把地上部分从茎基切除。然后将根放入带盖的称量瓶中，倒入反 应

液，以浸没根为度。置37 ℃暗箱中1 h，以观察着色情况。新根尖端几毫米以及侧根部分明显地变成红色，表明该处具有活跃的脱氢酶存在。

2. 定量测定

（1） TTC标准曲线的制作：吸取0.1 mLTTC标准液（含TTC 10 mg ·mL -1）放入10 mL容

量瓶，加少许Na2S2O4粉末，摇匀后即产生红色的甲月朁。再用乙酸乙酯定容至刻度，摇匀。然后分别取此液0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 mL置10 mL容量瓶中，以乙酸乙酯定容至刻度， 即得到含甲月朁0.025、0.05、0.10、0.15、0.20 mg的标准比色系列。以空白作参比，在485 nm 波长下测定吸光度（OD485），以甲月朁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

（2） 取根尖1cm切段0.5 g，放入称量瓶，加入1 % TTC溶液和0.1 mol ·L -1磷酸缓冲液的

等量混合液10 mL，把根充分浸没在溶液内，在37 ℃下保温1 h。加入1 mol · L -1硫酸2 mL， 以终止反应。

（3） 取出根尖，擦干水分后与3～5 mL乙酸乙酯和少量石英砂一起在研钵内研碎，以提

取甲月朁。把红色浸提液滤入试管，并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤2～3次，滤入试管，最后

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用乙酸乙酯定容10 mL。在波长485 nm下比色，以空白试验（先加入硫酸再加入根样品，其他步骤同上）作参比读取吸光度。

七、结果计算

查标准曲线，即可求出TTC还原量。

TTC还原量（g） TTC还原强度＝ 根重（g）时间（h）

八、注意事项

在对材料根系的操作中切忌对根的损伤，以免对实验结果带来影响。

九、思考题

试分析活力测定中根系着色深浅不同的原因。

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