细胞松弛素B对水牛体细胞核移植效果的影响

细胞松弛素B对水牛体细胞核移植效果的影响

陆凤花,覃琦丽,黄　华,罗　婵,成俊萍,石德顺3,韦英明　(广西大学动物繁殖研究所,广西南宁530005)

摘要:以水牛耳皮成纤维细胞为供体细胞,采用电融合方法,探讨细胞松弛素B(CB)对水牛体细胞核移植效果的影响。体外成熟培养22～24h的水牛卵母细胞去核后,将经0.1mg/LAphidicolin(APD)+0.5%FBS培养2～9d的水牛耳皮成纤维细胞注射到卵周隙中再经电融合(100V/mm,15μs,电脉冲3次)构建核移植重构胚。重构胚经化学激活后(5μmol/L)离子霉素5min,2mmol/L62DMAP3h)培养,7～9d评定其胚胎发育能力。结果显示,在含CB(3mg/L)的融合液中进行电融合后,核移植的融合率、重组胚的存活率、卵裂率和囊胚率与对照组(不含CB)相比均无显著差异(P>0.05);核移植重组胚激活前用含CB(6mg/L)的培养液培养1h,其激活后的存活率(97.52%)和体外囊胚发育率(22.09%)均显著地高于未经CB处理的重组胚的存活率(93.87%)和囊胚率(13.25%,P<0.05);重组胚经离子霉素激活5min后,在62DMAP+CB中培养3h的分裂率明显低于放在62DMAP中培养3h的分裂率(65.37%vs78.92%,P<0.05),但囊胚发育率无显著差异(11.19%vs10.96%,P>0.05)。这表明水牛体细胞核移植电融合时,融合液中不添加CB,而核移植重组胚激活前经CB培养处理后,有利

于胚胎的进一步发育,但激活后用CB培养处理会降低胚胎的发育率。关键词:水牛;体细胞;核移植;电融合;细胞松弛素B

中图分类号:S823183　　　文献标识码:A　　　文章编号:100524545(2009)0120106204

EffectofthecytochalasinBonthedevelopmentofbuffalosomaticcellnuclear

transferembryos

　　LUFeng2hua,QINQi2li,HUANGHua,LUOChan,CHENGJun2ping,SHIDe2shun3,WEIYing2

ming　(AnimalReproductionInstitute,GuangxiUniversity,Nanning530005,China)

　　Abstract:EffectofthecytochalasinB(CB)onthedevelopmentofbuffalosomaticcellnucleartransfer(NT)em2

bryoswereinvestigatedinthisstudy.Buffalooocytesobtainedfromovariesatslaughterwerematuredinvitrofor22224handthenenucleatedinmanipulationmediumcontaining5mg/LcytochalasinB.FibroblastsinDMEM+10%FBSweretreatedwith0.1mg/Laphidicolin(APD)for1dayand0.5%FBSfor229daysweretransferredintoenu2cleatedoocytesbyelectronicfusion(100V/mm,15μsand3pulses).Thereconstructedembryoswereactivatedbyexposuringthemto5μmol/Lionomycinfor5minandthenculturingin2mM62DMAPfor3h.Afteractivation,em2bryoswereculturedin30μLdropofgranulosacellmonolayersfor729days,toevaluatetheembryonicdevelopment.AdditionofCB3mg/Ltoelectrofusionmanipulationmedium,therewasnosignificantdifferenceinthefusionrate,survivalrate,cleavagerateandblastocystdevelopmentofthenucleartransferembryosascomparedwiththecontrolgroup(P>0.05).Treatmentofreconstructedembryoswith6mg/LCBfor1hbeforeactivationresultedinmoreembryossurvivedanddevelopedtoblastocysts,buttherewasasignificantdecreaseinthecleavageratewhentreatedthemwith6mg/LCBfor3hafteractivation.Inconclusions,additionofCBtoelectrofusionmediumhasnoprofoundeffectonthedevelopmentofbuffaloNTembryosandtherewasNotabeneficialeffectontheirdevelopmentwhentreatedbuffaloNTembryoswithCBafteractivation,buttreatedthemwithCBbeforeactivationcanimprovetheirdevelopment.

　　Keywords:buffalo;somaticcells;nucleartransfer;electrofusion;cytochalasinB3Correspondingauthor,E2mail:ardsshi@gxu.edu.cn

　　收稿日期:2007204209

　　基金项目:国家“863”高科技研究发展计划项目(2002AA206651);广西科学基金(桂科青0640004);广西大学博士启动基金项目

(X041109)

　　作者简介:陆凤花(19732),副教授,博士。

3通讯作者,E2mail:ardsshi@gxu.edu.cn

　中国兽医学报　2009年1月　第29卷　第1期　ChinJVetSci　Jan.2009　Vol.29　No.1　　　哺乳动物体细胞核移植是通过特殊的人工手段(显微操作、电融合等方法)将供体细胞注入去核的成熟卵母细胞中,形成一个新的核质重构体,经过发育程序重编、细胞分裂并通过胚胎移植,使重构胚在母体内发育成一个新的个体,以达到扩繁同基因型哺乳动物种群的目的[1]。利用细胞核移植技术生产遗传上完全相同的动物,不但可以迅速扩大优良品种的数量,加速品种改良的进程,挽救濒危物种,而且为细胞分化、核质互作等基础理论的研究开辟了新的途径。哺乳动物体细胞核移植的成功,是近年来人类在细胞生物学及发育生物学领域取得的重要成就之一。随着体细胞核移植技术的发展,不断有新的克隆动物面世,包括绵羊[2]、小鼠[3]、牛[4]、猪[5]、山羊[6]、兔[7]和水牛[8]等十几种体细胞核移植动物相继获得成功,标志着哺乳动物体细胞核移植研究已经进入一个崭新的阶段。但是体细胞核移植技术是一项十分复杂的系统工程,目前这一技术本身还不够完善,成功率低,其中在显微操作过程中对受体胞质的损伤,严重影响着核移植胚胎的进一步发育。可见,降低在细胞核移植过程中对受体胞质的损伤,是提高核移植效率的途径之一。而细胞松弛素B(CytochalasinB,CB)是一种细胞骨架抑制剂,能抑制细胞内微管和微丝的形成,使得卵母细胞内细胞骨架松弛,增加了细胞的柔韧性,可降低显微操作对卵母细胞的机械损伤,有利于显微操作。因此,本研究采用水牛耳皮成纤维细胞作为供体细胞,探讨CB对水牛体细胞核移植效果的影响,以便为核移植技术程序的进一步完善,提高核移植成功率提供科学依据。

107

单层并相互汇合后,用0.1m/L蚜栖菌素(Aphidi2colin,APD)培养处理24h,再用0.5%FBS饥饿培养2～9d,即可用作核移植供体细胞。

1.3　卵母细胞的去核、注核及融合　将体外成熟培

养22～24h具有第一极体的MⅡ期卵母细胞放在含有5mg/L细胞松弛素B的操作液中,采用Spin2dle2View系统在Nikon倒置显微操作仪下进行去核。注核时用注核管吸取已准备好的供体细胞并沿去核时在透明带留下的孔进去,先回吸少量细胞质,再将细胞质连同供体细胞一起注入卵周隙中,使供体细胞与卵膜紧贴在一起,以便有利于融合。

本研究所用的电融合仪为ECM22001,电极为2根自制的安装在显微操作仪上的可活动的铂金丝。融合时,将注核卵母细胞移到电极间的融合滴中,用其中一根电极手动将其摆正,使待融合的两质膜平面与电场方向垂直,然后施加2.0V交流电波后,再用100V/mm直流电波、15μs、脉冲3次,诱导体细胞与卵母细胞质融合。1.4　核移植重组胚的激活及体外培养　融合后的重组胚用5μmol/L的离子霉素激活处理5min,再用2mmol/L的62DMAP培养3h。激活处理后的重组胚

置于颗粒细胞单层微滴中,在38.5℃、5%CO2培养箱中培养7～9d。培养液每隔48h更换1次,培养48h后检查分裂率,7d后记录发育的囊胚率。1.5　试验设计

试验1　本试验目的是比较融合液中添加CB与否的核移植效果。将水牛成纤维细胞移入去核后的卵母细胞卵周隙后,随机分为2组,分别在含有3mg/LCB的融合液或不添加CB的融合液中进行电融合,通过评定胚胎的早期发育能力,观察其核移植效果。

试验2　本试验主要研究核移植重组胚激活前用CB培养处理对核移植效果的影响。来自水牛耳皮成纤维细胞构建的重组胚随机分为2组,分别在含有或不含CB的培养液中培养1h后再激活,评定其核移植胚胎的发育情况。

试验3　本试验主要探讨重组胚激活后CB培养处理对水牛核移植胚胎体外发育的影响。融合后的核移植胚胎在培养液中放置2h后,用离子霉素激活5min,然后随机分为2组,分别在62DMAP和62DMAP+CB的培养液中培养3h,再放到颗粒细胞单层中进行培养,通过评定胚胎的早期发育能力,观察其核移植效果。

2)1.6　统计分析　所得试验数据结果均用卡方(χ进行统计分析,确定差异的显著性。

1　材料与方法

1.1　卵母细胞的收集及体外成熟　从屠宰场收集

的水牛卵巢上抽取2～6mm卵泡的卵母细胞,挑选

出细胞质均匀、并带有完整卵丘细胞层的卵母细胞,放入TCM2199+5%发情牛血清(OCS)+0.1mg/L促卵泡素(FSH)的成熟培养液中,在38.5℃、5%CO2和最大饱和湿度的培养箱中培养22～24h。1.2　供体细胞的制备　水牛耳皮组织块经70%酒精消毒,洗净后去掉毛和软骨,将剩余的皮肤剪碎至2mm左右小块,用0.25%胰蛋白酶消化30min,再用0.2%胶原酶消化45min分离细胞,细胞最终悬浮在含有10%胎牛血清(FBS)的Dulbecco限制性培养液(DMEM)中,以1×106个细胞/mL的浓度接种于培养瓶里进行原代培养。用于核移植的供体细胞为培养2～5代的成纤维细胞。细胞生长形成

108　中国兽医学报　2009年1月　第29卷　第1期　ChinJVetSci　Jan.2009　Vol.29　No.1　

2　结果

2.1　融合液中添加CB对水牛核移植效果的影响

　如表1所示,在含有CB(3mg/L)的融合液中进

3　讨论

3.1　融合液中添加CB对水牛体细胞核移植效果

行电融合后,核移植的融合率、重组胚的存活率、卵裂率和囊胚率与对照组(不含CB)相比均无显著差异(P>0.05)。表明在水牛体细胞核移植时融合液中没有必要添加CB。

表1　融合液中添加CB对水牛体细胞核

移植效果的影响

CB+-NT

个

分裂卵数及(%)

囊胚发育数及(%)

融合卵数及(%)

融合后存活卵数及(%)

处理卵数

456422(92.54)326(77.25)234(71.78)30(12.82)347321(92.51)240(74.77)193(80.42)13(6.74)

　　注:n=16(n为试验重复次数)

2.2　核移植重组胚激活前CB培养处理对水牛核

移植效果的影响　如表2所示,重组胚激活前用含

CB(6mg/L)的培养液培养1h,其激活后的存活率(97.52%)和体外囊胚发育率(22.09%)均显著地高于没有经CB处理的重组胚的存活率(93.87%)和囊胚率(13.25%,P<0.05),但两者的分裂率无显著差异(P>0.05)。由此说明,激活前重组胚在CB中培养1h,对胚胎的进一步发育有利。

表2　核移植重组胚激活前CB培养处理

对核移植效果的影响

CB处理NT卵数+-444522

个

囊胚发育数及(%)

74(22.09)a51(13.25)b

激活后存活卵数及(%)

433(97.52)

a

分裂卵数及(%)

335(77.37)385(78.57)

490(93.87)b

　　注:ab列内具不同上标的值差异显著(P<0.05);n=22(n为试

验重复次数)

2.3　激活后CB培养处理对水牛核移植胚胎体外

发育的影响　如表3所示,重组胚经离子霉素激活5min后,在62DMAP+CB中培养3h的分裂率明显低

于放在62DMAP中培养3h的分裂率(65.37%vs78.92%,P<0.05),但囊胚发育率无显著差异(11.19%vs10.96%,P>0.05)。由此表明激活后CB处理不利于水牛核移植胚胎的体外发育。

表3　激活后CB培养处理对水牛核移植

胚胎体外发育的影响

激活后培养处理

62DMAP

62DMAP+CB

NT

个

囊胚发育数及(%)

a

激活后存活卵数及(%)

分裂卵数及(%)

卵数

188216

185(98.40)146(78.92)16(10.96)205(94.91)134(65.37)b15(11.19)

　　注:ab列内具不同上标的值差异显著(P<0.05);n=8(n为试

验重复次数)

的影响　由于CB对细胞骨架的独特作用,目前已

被广泛用于核移植研究中。Smith等[9]的研究表明,对于施加交流电或采用体积小的供体细胞进行电融合时,添加CB能提高其融合率。Li等[10]在兔的成纤维细胞核移植中,融合液中添加有7.5mg/LCB的核移植融合率(75.9%)显著高于融合液中没有添加CB的对照组的融合率(57.4%),但囊胚发育率无显著差异(40%vs37.1%),表明融合液中添加CB可显著提高核移植的融合率。本试验1在融合液中添加3mg/L的CB,其融合率及融合后胚胎的存活率、卵裂率和囊胚率与对照组均没有显著差异,表明融合液中添加CB对水牛体细胞核移植并非必要。这一结果与以上报道的结果不一致。原因可能有:(1)CB对不同物种的核移植效果是不一样的;(2)本试验所添加的CB质量浓度为3mg/L,低于别人报道的质量浓度(7.5mg/L)。但在本试验的预试验中,当使用的CB质量浓度大于3mg/L时,在电融合操作过程中,施加电脉冲时,受体卵母细胞质就发生严重的收缩,质膜与供体细胞膜分开,就很难进行融合,只能添加3mg/L。因此,在水牛成纤维细胞核移植时,融合液中没有必要添加CB。3.2　激活前CB培养处理对水牛体细胞核移植效果的影响　CB对细胞骨架有保护作用,同时可防止细胞质分裂。Smith等[9]的研究发现,绵羊的核移植胚胎放在CB中孵育1h后再进行电激活处理,可提高重组胚的桑椹胚和囊胚的发育率,尤其对于体积较小的供体细胞效果更明显,例如分别来源于162细胞期和ICM细胞作供核的重组胚于CB中放置1h后再激活,其桑/囊率得到明显提高(11%vs35%和0%vs56%)。后来在兔[11213]及猪[14]的核移植研究中也证明了这一结果。究其原因,是由于在CB的作用下,降低了16～64细胞期的染色体断裂,从而提高重组胚的发育率;同时也表明了在卵母细胞激活时细胞骨架变化机制影响着外源核的发育潜力;如果没有一些细胞骨架抑制剂(如CB)的作用,激活时诱发的微丝依赖性机制会影响供体核的染色体倍数,很可能会引起核移植重组胚形成单倍体,从而引起早期胚胎的发育阻断[9,10,15]。本试验2的结果显示,水牛体细胞核移植重组胚激活前用CB培养处理1h,可显著提高重组胚的存活率和囊胚率,与以上报道的结果一致。但是,在牛的核移植研究中却发现,融合胚在CB内培养与否不影响核移植胚的发育率。

　中国兽医学报　2009年1月　第29卷　第1期　ChinJVetSci　Jan.2009　Vol.29　No.1　刘林等[16]将融合后的兔核移植重组胚置于CB中温育1h后再进行激活,其激活率和分裂率均未有明显变化。这可能是由于不同的试验条件所致。3.3　激活后CB培养处理对水牛核移植胚胎体外

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发育的影响　在猪的体细胞核移植研究中发现,重组胚激活后,用含有CB的62DMAP培养液培养,重组胚卵裂率高于在无CB的62DMAP培养液内培养的重组胚,但不影响囊胚的发育率;而牛的重组胚无论是在62DMAP+CB中培养与否,重组胚的卵裂率和囊胚发育率均无显著差异。本试验3的结果显示,水牛核移植重组胚激活后CB培养处理3h对囊胚率无显著影响,与以上报道的结果基本一致;但显著降低重组胚的卵裂率。造成这种差异的原因可能是因为:(1)CB的作用防止了重组胚的胞质发生分裂;(2)CB对激活发挥的作用与卵母细胞基础激活率的高低有关[19];(3)与去核时显微操作液中所含的CB对卵母细胞的持续作用有关;(4)与不同种类的动物对CB反应不一样以及不同的试验条件有关。参考文献:

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