miRNA的作用机制及功能研究进展
王娟
（德州学院生物系，山东德州 253023）
摘要 microRNA (miRNA)是内源性的大小在20-25nt的一类非编码RNAs，具有调节基因表达活性的功能，广泛存在于真核生物体内，并在进化中保守。miRNA的广泛存在与进化上的保守性，暗示它在生命活动中具有必不可少的调节作用，他们参与动植物生长发育、细胞分化、细胞增殖与调亡、激素分泌、肿瘤形成等各种过程。本文总结了近几年来在miRNA的特征、生物发生、作用机制及功能意义上的研究进展。miRNA无论在数量上还是功能上，可能都远远超过目前的发现，对其进行深入的研究，将有助于我们对生物体的各种生理病理机制的理解，并最终为疾病的诊断和治疗提供新的思路和理论基础。 关键词 siRNA； microRNA； piRNA; 微处理器; 核糖核酸内切酶Ⅲ; 基因调控; 生长发育； 肿瘤治疗
前言
2006年，Andrew Fire 和Craig Mello 由于在RNAi（RNA interference，RNAi）及基因沉默现象研究领域的杰出贡献而获得诺贝尔医学奖，这再次将人们的注意力拉到siRNA这样一种小分子RNA上。
小分子RNA包括一个大家族，并在真核生物中具有广泛的调节功能。目前已经有至少两种小分子RNA被描述：来源于发夹状前体的miRNAs (microRNAs)和由长的dsRNAs加工而来的siRNAs (small interfering RNAs)。研究发现，miRNA与siRNA有很多相似之处，但也有很大的不同，二者的区别将在以下文中进行论述。
最近又有文章报道了一种新的小分子RNA的发现[25]——piRNAs (piwi-interacting RNAs),他们特异地在小鼠的生精细胞中大量表达。这些RNAs比以前发现的大多数小RNAs较大，约26–31nt(nucleotides)，并与Argonaute蛋白家族的Piwi亚枝(Piwi-subclade)成员相联系。
Argonaute 蛋白大约100KD，具有PAZ (Piwi Argonaut and Zwille)和PIWI结构域。一种小RNA分子引导Argonaute蛋白识别靶分子并介导基因沉默。Argonaute家族被分为Ago和Piwi两个亚枝。一般，Ago成员广泛存在并与miRNAs 和siRNAs有关，而Piwi成员则限制在种系细胞和干细胞中表达。
克隆的piRNAs 在染色体中表现出极不均匀的分布，大多数piRNAs簇集于染色体中相对较小的基因座位，大小约1 kb到100 kb包含10–4500个小RNAs。尽管目前对这些RNAs的生物发生和功能还不清楚，但这些发现为小RNA生物学和种系细胞生物学增加了新的内容。
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本文将重点论述miRNA的最新研究进展，miRNA自被发现，迅速成为近几年生命科学领域的研究热点。对它的研究将会对转录后基因调节领域的发展产生深远影响。
miRNA是一类长度约为22nt的小分子非编码单链miRNA，由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体（pre-miRNA）加工而来，能够和互补或部分互补的靶mRNA的3＇末端非翻译区(3′untranslationalregion,3′UTR)结合，使mRNA降解或介导其翻译抑制。miRNA家族的成员是在研究秀丽线虫的发育转变过程中作为小分子短暂RNA（stRNA）被发现的。研究发现，miRNA是stRNA中的一个大家族，并且在线虫、果蝇、植物、哺乳动物、甚至病毒中均有发现。这类小RNA在表达上具有组织和时间的特异性，是调节其他功能基因表达的重要调节分子，在生物体的各种生命活动过程中发挥着重要作用。
1 miRNA的发现及命名
早在1993年Lee等[20]利用遗传分析的方法已经在线虫中发现一个22nt的小分子非编码RNA:lin-4。Lee等注意到，lin-4或lin-14突变后造成线虫发育差时表型(heterochronic phenotype)，在线虫发育早期起作用的lin-4基因的突变使线虫中应该在早期出现的发育事件延迟发生，而lin-14基因的缺失突变却造成了完全相反的结果。后来证明，这种lin-4基因编码的约22个核苷酸的单链RNA通过不完全互补的方式结合到靶mRNA(target mRNA)lin-14的3＇末端非翻译区(3′untranslationalregion，3′UTR)，短暂下调lin-14蛋白的水平，促使线虫从L1期向L2期的过渡，但并不影响mRNA的水平。2000年Reinhart等[22]发现了另一个类似的具有转录后调节功能的小分子RNA:let-7。第二个miRNA let-7的发现掀起了寻找miRNA的热潮，拟南芥、线虫、果蝇、小鼠、以及人类等各种生物及病毒中都相继有miRNA的报道,且主要以模式生物为主。miRNA种类的普遍性及多样性预示着它在生物界中具有更广泛的功能。
miRNA的命名，除最早发现的几种miRNA（如：lin-4 和let-7等）以外，其他发现的都用“miR-#”来表示
[12]
，“#”为阿拉伯数字（如miR-1，miR-2），对应的基因也用
这三个字母后缀加数字命名，具体根据不同物种的命名习惯采用连字符、斜体或大写（如线虫和果蝇中的mir-1，水稻和拟南芥中的MIR-156）。
2 miRNA的特征及与siRNA的比较
2.1 miRNA的特征
2.1.1 结构特征 长度为~22nt是miRNA一个最基本的特征, 且具有能形成分子内
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茎环结构的前体。在动物中,前体的长度一般在70～90nt,而在植物中前体的长度可变性很大,可以从几十到数百nt。
2.1.2 miRNA的存在形式 miRNA基因常以单拷贝、多拷贝或基因簇等多种形式存在于基因组中, 在基因组中有固定的基因座位，70％~90％位于蛋白基因的基因间隔区(intergenic region,IGR)，其余在内含子，还有个别在编码区的互补链，说明它们的转录独立于其他的基因,具有本身的转录调控机制。最近有研究[21]发现，25%的人类已知miRNA位于蛋白质编码基因的基因内区域(intronic regions)，其中大约50%定位于内含子(introns)中,这些miRNA都具有独立的转录单元，可以作用于其主基因(host gene)的非翻译区(untranslated region，UTR)下调其蛋白质编码基因的表达水平，并且还可以作为重要的负反馈调节子。
2.1.3 保守性 miRNA不仅在结构上保守而且在物种间具有高度的进化保守。结构上，miRNA 在颈部的保守性较强，而环部可以容纳较多的突变位点的存在。种系上，有些miRNA在一些物种中是高度保守的。约12％的miRNA在线虫、果蝇、哺乳动物和植物中呈现保守性，经序列比较发现，这些保守片断的碱基差异仅为1~2 nt；miR-1、miR-34、miR-87在非脊椎动物和脊椎动物中高度保守。在线虫中,发现85 %的miRNA 在C. briggsaze 基因组序列中是有同源物的[18]。
最具有miRNA保守性的是let-7 RNA,let-7在C. elegans和人类中完全保守；大约40％的C. elegans中的miRNA在人类中也是保守的。线虫C.elegans中的let-7 miRNA可以在果蝇基因组,人的第9、11和22条染色体上各找到一个与之完全一致序列,另外在人的第9条染色体上还有一个仅差1个核苷酸的序列[10]。
2.1.4 时空特异性 目前研究较清楚的lin-4与let-7呈时间特异性表达。在C.elegans中，lin-4只在幼虫的第一期和第二期存在;let-7却存在第三、第四期及成虫期,在第一和第二期并不存在；在拟南芥中，miR157在幼苗中高表达，miR171则在花中高表达[23]。同时,miRNAs的表达具有组织特异性。例如，mir-290~mir-295只在鼠胚胎干细胞中表达，而在成体组织主要在胸腺和骨髓中表达[14]。最近一项研究[28]发现，miRNA靶目标在成熟小鼠和果蝇组织中的表达水平要比在胚胎中低，同时，miRNA更倾向于靶向广泛表达的而不是组织特异性表达的基因，这项结果表明了miRNA广泛地参与胚胎发育及成体组织特性的维持。
2.2 miRNA与siRNA的比较
miRNA与siRNA 的根本区别是他们来源不同，而二者的作用机制相通。首先，miRNA
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与siRNA之间有许多相同之处：1.二者的长度都约在22nt左右。2.二者都依赖Dicer酶的加工，是Dicer的产物，所以具有Dicer产物的特点: 5＇端磷酸，3＇端均有2个游离核苷酸。3. miRNA和siRNA合成都是由双链的RNA或RNA前体形成的。4. 二者都是RISC(RNA induced silencing complex)组分，都具有组成RISC复合体的Argonaute蛋白家族，其功能界限已变得不清晰，如二者在介导沉默机制上有重叠。
miRNA和siRNA也有区别。1.根本区别是miRNA是内源的，在基因组中有固定的基因座位；siRNA可以是人工体外合成的，也可以是基因组的转录片断，降解片断和转座片断，病毒基因组转录片断等，关键在于siRNA没有固定的基因座位，本身不是基因组的功能片断，是随机产生的，即加工位点不是保守的。2.二者结构上没有本质区别，功能分子都是单链RNA，miRNA转录出来时必然是发夹状的，siRNA可以由完全互补的双链切断而来，也可以从发夹来。3.本质区别在于作用位点上，miRNA作用于固定的靶基因，有特定的作用位点，一般在靶基因3′-UTR区，而siRNA由于是随机产生的或者人工设计的，因此作用位点可以设计或改变，可作用于mRNA的任何部位。4.在作用方式上，没有本质区别，是否降解或翻译抑制取决于互补程度，siRNA也可抑制靶标基因的翻译。5.miRNA的生理功能在于调控发育分化和调亡，适时调节内源基因表达，而siRNA是生物抵抗外来核酸片断入侵的一种方式，原始作用是抑制转座子活性和病毒感染。
miRNA与siRNA 的区别总结于表1[2]。
表1 miRNA和siRNA的区别
特性 miRNA siRNA
来源 内源转录本 转基因、病毒RNA
大小 约22nt 约22nt
前体 茎环状的pre-miRNA 双链结构的dsRNA 催化酶 Drosha、Dicer或类似 Dicer
Dicer的酶复合体
RISC复合体 含Argonaute蛋白家族 含Argonaute蛋白家族 匹配方式 不完全互补（动物）或 完全互补 完全互补（大多数植物）
作用目标的专一性 相对较低 高 (特异性)
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续表1
特性 miRNA siRNA 作用点 蛋白质合成水平 转录后水平 靶基因的命运 抑制转录或者被降解 被降解
功能 发育过程中调节 抑制转录活性、病毒 内源基因的表达 感染、表型遗传
3 miRNA的生物发生
目前，关于miRNA的生物发生的研究已经取得较大进展。动物(尤其是人) miRNA 的生物合成过程已经初步得到了诠释。miRNA的生物发生过程如图1[4]所示。
图1 miRNA的生物发生过程
3.1细胞核中miRNA基因的转录与加工
大多数miRNA是由基因间DNA序列编码的,转录方向与相邻的基因往往相反,被认为是与基因表达不同的独立单位。基因组DNA在RNA聚合酶Ⅱ的作用下产生原始miRNA转录本(primary transcripts, Pri-miRNA)。Pri-miRNA在5′端具有甲基化的鸟嘌呤,而3′端具有多聚腺嘌呤碱基。另外一类miRNA是位于基因的内含子中,并会随着信使RNA(mRNA)转录,包含在mRNA的前体中。这一类miRNA的转录方向是和对应的mRNA转录
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方向一致的,因此一般认为此类miRNA的表达和对应的mRNA一样具有组织特异性[11]。
pri-miRNA在一种叫做微处理器的复合体的作用下，剪切为约70个核苷酸长度，一端5＇磷酸，一端3＇端两个悬垂，且具有茎环结构的miRNA 前体(precusor of miRNA,pre-miRNA)。细胞核中的微处理器在不同的生物体中，所包含的成分不尽相同。在线虫、果蝇及哺乳动物体内，该复合体至少包含有两种蛋白质成分，分别为Drosha和Pasha(Partner of Drosha)。
Drosha的主要作用是剪切pri-miRNA形成3＇端2nt悬垂的pre-miRNA，Pasha为dsRNA结合蛋白，参与Drosha对底物的识别[6]。在人类，Pasha又称为DiGeorge综合征关键区域基因8(DGCR8)。对DGCR8的研究结果显示, DGCR8是由染色体22q11. 2的一个基因编码,对miRNA在发育过程中有重要调节作用。
3.2 pre-miRNA的出核转运
在最初的剪切后，pre-miRNA在Ran-GTP 依赖的核质/细胞质转运蛋白Exportin 5 的作用下，从核内运输到细胞质中。Exportin 5与Ran-GTP 以及pre-miRNA形成异三聚体，通过核孔到达胞浆，然后，Ran-GTP转变为Ran-GDP，释放pre-miRNA。
3.3 细胞质中miRNA的成熟
一旦pre-miRNA被运送到细胞质中,第二种RNA内切酶Ⅲ,称为Dicer(双链RNA专一性RNA内切酶),对茎环前体一端5＇磷酸，一端3＇端两个悬垂的结构有特殊亲和力，在Dicer进一步的作用下，miRNA前体被剪切成21~25个核苷酸长度的双链miRNA。起初，成熟miRNA 与其互补序列互相结合成所谓miRNA:miRNA* 双螺旋结构(miRNA* 是miRNA 的互补序列); 随后，在解旋酶的作用下，双螺旋解旋，其中一条结合到RNA诱导的基因沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)中，形成非对称RISC复合物(asymmetric RISC assembly)。该复合物会结合到目标靶mRNA上，从而引起靶 mRNA 的降解或者翻译抑制。
在miRNA miRNA*双螺旋中，只有其中一条单链可以选择性结合到RISC上去而成为成熟miRNA，然后另一条立即被降解。尽管从理论上来说成熟miRNA的产生是随机选择的结果，但由于两条链的稳定性有所不同，导致机会的不等。如图2[3]所示miRNA miRNA*双螺旋结构中两条链的3＇端均有2个游离核苷酸。此外，它的两条链是不完全对称的：miRNA链上靠近5＇端有一个不与miRNA*链相应位置配对的小突起。这个小突起显著地减弱了miRNA 5＇端的稳定性。由于成熟的miRNA产生总是趋向于选择更不稳定的5＇
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端，因此miRNA链被选中的机会要大大多于miRNA*链(大约100倍)。结果往往是双链解开后miRNA链结合到RISC中以做靶识别,而miRNA*则被迅速降解。这样极度不对称的选择性的好处是，不会因为miRNA*链结合到RISC中的比例过多而显著降低miRNA对翻译的抑制效率[3]。
图2 miRNA miRNA*双螺旋结构示意图
由上可知，miRNA成熟过程中的连续加工，需要至少两种核糖核酸内切酶-Ⅲ（RNAaseⅢ）：Drosha和Dicer催化，两者都是特定dsRNA的RNA内切酶。近年来对核糖核酸内切酶-Ⅲ[8]的研究也有了一定进展。
核糖核酸内切酶Ⅲ家族依据其蛋白结构域的组成不同，可以分为3个种类。第一类包括一个保守的核糖核酸内切酶Ⅲ结构域(RNaseⅢdomain,RⅢD)和一个dsRNA结合结构域(dsRNA binding domain,dsRBD)，在细菌和酵母中有发现。如E.coli中的核糖核酸内切酶-Ⅲ。第一类除了参与rRNA前体的加工成熟过程以外,还参与mRNA、tRNA前体的加工成熟过程。体内外实验都证明,无论是外源性还是内源性的dsRNA,均可以被机体的核糖核酸内切酶Ⅲ识别并且进行切割,产生约为12~15个核苷酸长度的siRNA。此siRNA的特点是5＇端有磷酸基团,3＇端有羟基基团,并且3＇端突出2~3个核苷酸长度, 5＇端凹陷。由核糖核酸内切酶Ⅲ产生的siRNA与机体内的一些酶等辅助因子形成蛋白质-RNA复合物,即为RNA引导的沉默复合物(RISC)。在RISC的指导下,siRNA中的反义链寻找与其同源的mRNA区域,并且在RISC内的核酸内切酶的作用下降解同源mRNA,使相应基因封闭。第二类包括2个RⅢD(RⅢa和RⅢb)和1个dsRBD，如Drosha及其同源物，仅在动物细胞中有发现。Drosha定位于细胞核内,可以识别核内的pri-miRNA并将其切割成发夹样结构,约含有70个核苷酸长度的miRNA前体(pre-miRNA),然后通过转运蛋白exportin-5,结合形成exportin-5、Drosha、pre-miRNA的蛋白-RNA复合物,将pre-miRNA 由细胞核转运至细胞质。第三类如Dicer及其同源物，广泛存在于原核、真核及植物当中,由多个结构域组成，除了有2个RⅢD(RⅢa和RⅢb)和1个dsRBD外，还有1个长的N末端，此末端中含有1个DExH RNA螺旋酶/ATP酶结构域、DUF283结构域和PAZ结构域, 这种酶可以和含有PP结构域(PAZ Piwi domain,PPD)的蛋白质相互作用。这种核糖核酸内切酶-Ⅲ在真核细胞内定位于细胞质中,分散地分布于核糖体上,并且参与miRNA
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的加工成熟过程。它可以识别具有茎-环样结构约含有70个核苷酸长度的pre-miRNA,并且对其进行切割产生成熟miRNA。
4 miRNA的作用机制
miRNA在发挥作用之前，需要同细胞内一些协同因子结合形成蛋白质- RNA复合物（miRNA-containing ribonucleoprotin，miRNP），在miRNP的作用下指导其识别同源mRNA。在Hela细胞裂解液中发现这类核糖核酸蛋白复合物的大小在15S左右，其主要成分为Germin3、Germin4和Argonaute蛋白家族成员eIF2C2因子,后两种蛋白质与运动神经元的存活(survival of motor neurons,SMN)有关[10]。研究认为，miRNP即为RISC.
miRNA与靶mRNA作用的典型方式主要有两种(如图3，图4[16])：
在大多数情况下(例如在动物中)，复合物中的单链miRNA 与靶mRNA的3' UTR不完全互补配对，阻断该基因的翻译过程，从而调节基因表达。这种方式只影响蛋白表达水平，并不影响mRNA的稳定性。目前，该翻译抑制的详细机理尚不清楚。最近有研究对此提出质疑，他们[24]认为，正常衰退途径引起的mRNA降解速度的升高也会导致蛋白质表达水平的下降，且miRNA不仅能作用于翻译起始后的延长阶段，还能够抑制翻译的起始。被抑制的靶mRNAs和miRNAs共同聚集于胞浆中被称为P-bodies的区域，这个区域还浓缩了许多参与mRNA降解的酶类。然而，P-bodies可能是作为未翻译mRNA进行暂时的可逆储存的容器，并且，减少一些特定P-body组成蛋白的表达能够缓和miRNA介导的基因表达抑制。
P bodies[13] 是胞浆中的一定区域(如图3)，它包含参与多种转录后过程的蛋白质，例如：mRNA降解(mRNA degradation)、无义介导mRNA衰退(nonsense-mediated mRNA decay ,NMD)，转录抑制及RNA介导的基因沉默(RNA-mediated gene silencing)。尽管P bodies不是介导基因沉默所必需的，但阻断siRNA或miRNA基因沉默途径的任何一步都会阻碍P-body的形成，这表明P-body是基因沉默的结果。因此，尽管P-body成分在mRNA沉默及衰退中起重要作用，但P-body中的这种聚集并不是介导基因沉默机制所必需的，而只能作为他们活动的结果。
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图3 P bodies的作用机制
另一种作用方式是，当miRNA与mRNA完全互补配对时，引起目的mRNA在互补区的特异性断裂，从而导致基因沉默，这种作用方式与 siRNA类似。如大多数植物在可读框(ORF)中与它的靶位点几乎完全配对。这种mi/siRNA介导的基因沉默机制已得到了相关的阐释。以siRNA参与的RNAi为例进行说明，siRNA可与RISC结合,作为模板识别mRNA靶子，通过碱基互补配对原则，mRNA与siRNA中的反义链结合，置换出正义链。双链mRNA在Dicer酶、ATP和解旋酶共同作用下产生22nt左右的siRNA，siRNA继续同RISC形成复合体，与siRNA互补的mRNA结合，使mRNA被RNA酶裂解。这个过程也称为转录后基因沉默(PTGS)。
miRNA以何种方式与目的基因作用和miRNA与目的基因的配对程度有关。MiRNA与目的基因配对不完全时，miRNA就以抑制目的基因的表达方式作用；miRNA与目的基因
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德州学院 生物系 2007届 生物科学专业 毕业论文（设计）某段序列配对完全时，就可能引起目的基因在互补区断裂而导致基因沉默。
图4 miRNA的两种作用机制
这两种作用机制是最早被发现和熟知的，除此之外，近期，PNAS刊载一项最新的发现：快速脱腺苷酸化(accelerated deadenylation)是 miRNA 抑制基因表达的新机制[26]。Wu 等以miR-125b 和 let-7 两种代表性的miRNA为研究对象，在哺乳动物细胞中发现
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它们能够促进mRNA 聚腺苷酸尾巴 (polyA tail)的去除。他们认为miRNA去除聚腺苷酸尾巴的能力不是由于降低翻译水平或需要poly(A)为存在的翻译抑制。为证明这点，Wu 等用 3′组蛋白茎-环结构取代聚腺苷酸尾巴，结果发现不但可以消除 miR-125b 对 mRNA 含量的影响，还可以降低对蛋白质合成的作用。由此可知，miRNA 通过降低翻译效率和聚腺苷酸化 mRNA 的浓度来抑制基因表达远比阻遏翻译强而全面，而且，不像翻译阻遏那样导致 mRNA 的解体是不可逆转。总之，miRNA 与靶mRNA 不完全互补后有两种转录后作用机制，除了阻遏翻译外还可引起mRNA 快速脱腺苷酸化而被降解以抑制基因表达。
对 miRNA作用机制的不断深入研究不仅在理论上丰富了我们对基因调控的认识，miRNA应该具有潜在的多种调节基因表达方式，这还有待于实验技术的进步和人们的进一步发现。
5 miRNA 的功能及意义
高等真核细胞中，miRNA基因占已知基因的~1%，目前估计哺乳动物细胞中有600多个miRNA，30%的基因要受到miRNA的调节。miRNA的多样性与进化保守性决定了其在生理生化功能上的重要性与普遍性。然而只有少数miRNA的已经明确，许多miRNA的功能还尚待深入研究。表2[1]列出了几种已知功能的miRNA，现在已经认识到这类小分子miRNA在生物体发育、细胞增值与分化、激素分泌、肿瘤形成等过程中扮演者重要角色。
表2 已知功能的miRNA
miRNA名称 物种 生物学功能 靶基因
lin-4 线虫 发育时序调节 lin-14,lin-28 let-7 线虫 发育时序调节 lin-41,hbl-1 lsy-6 线虫 神经细胞化学感受器 cog-1 不对称性调节
miR-273 线虫 神经细胞化学感受器 die-1 不对称性调节
miR-165/166 拟南芥 叶子近轴与离轴细胞的分化 PHV/PHB miR-172 拟南芥 花朵发育 APETALA2(AP2) Bantam 果蝇 调节细胞增殖和凋亡 hid miR-14 果蝇 调节细胞凋亡和脂类代谢 caspase Ice?
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续表2
miR-15a/ 哺乳动物 B细胞慢性淋巴细胞白血病 Bcl-2 miR-16-1 （B－CLLs）
miR-196 哺乳动物 脊椎动物发育 Hox-B8 miR-143 哺乳动物 脂肪细胞分化 erk5 miR-375 哺乳动物 胰岛素分泌调节 mtpn miR-1 哺乳动物 心脏细胞的生长和分化 Hand2 5.1 miRNA与生物体的发育分化
在动物中，针对数种模式生物(人、小鼠、果蝇、线虫)的miRNA所做的研究已经非常深入。在线虫中除了最早发现的lin-4、let-7参与线虫的形态转换,还发现两个与神经模式发生有关的miRNA:lsy-6和mir-273, 证据已经表明,lsy-6和mir-273能影响左右神经系统内某一特定化学感受器受体的水平,这部分解释了神经系统功能的非对称性
[7]
。另外，研究发现另一种重要的发育相关基因miR-196和靶基因Hox-B8匹配的非常完
美，并导致靶mRNA的降解。
在植物中，大多数的miRNA 介导其靶mRNA的降解。植物中的miRNA与相应的靶mRNA近似完全配对，并且互补区域散布在靶mRNA的转录区域内而非仅仅局限在3' UTR，使得miRNA会结合到包括编码区域在内的多个位点上去，从而直接降解mRNA而非抑制其翻译。例如mir-172[3]，它在拟南芥的花朵发育中介导翻译抑制。与动物miRNA不同的是，mir-172的互补位点与其靶基因APETALA2(AP2)的互补位点落在编码区域而非3 'UTR。因此，植物中的miRNA功能与siRNA 的功能非常相似。
5.2 miRNA与细胞分化
在鼠骨髓、胸腺的B淋巴细胞中miR-181特异表达,参与增强哺乳动物B淋巴细胞分化， miR-181过表达引起B淋巴细胞减少,T淋巴细胞增加,但目前miR-181作用的靶mRNA还未发现。此外,有人鉴定了干细胞和已分化细胞的miRNA,发现有些miRNA是干细胞特有的,例如,小鼠干细胞特异表达miR290~295,人干细胞特异表达miR371~373,推测是维持细胞全能性所必需的并参与细胞分化过程。一些miRNA呈组织特异性表达,似乎表明它们与维持分化细胞的功能有关[7]。
近期有研究表明:miRNAs在心脏细胞的生长和分化过程中,也扮演着极为重要的平衡角色。miR-1家族包括miR-1-1和miR-1-2,在心肌、骨骼肌中特异表达, miR-1能够
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靶向Hand2基因的mRNA,而Hand2基因是心脏形成的一种关键调节因子, miR-1能适时关闭Hand2蛋白制造,以促使心脏正常发育[27]。因为Hand2蛋白是一种重要的调节因子，所以发现这种miR-1对控制Hand2及其他蛋白具有重要意义。
5.3 miRNA与细胞增殖和调亡
果蝇中的bantam与细胞凋亡和生长控制有关, 这是第一个被鉴定的与增殖相关的miRNA基因。bantam的靶基因hid，hid已被证实是一种调亡诱导基因，bantam与hid mRNA的3' UTR互补结合，阻止hid mRNA的翻译，抑制蛋白的表达，最终表现为促进细胞增殖的作用。相反，如果敲除bantam，hid的表达水平将上调，诱导调亡的发生，抑制细胞增殖。似乎，bantam扮演了一种癌基因的角色[1]。
Xu等在果蝇体内发现了另一种调亡抑制miRNA：miR-14，它通过调节调亡效应因子半胱天冬酶Drice而参与细胞调亡和脂肪代谢。目前还不清楚miR-14的靶基因，但发现miR-14的突变，会导致调亡效应因子caspase Ice水平的增高，这可能是miR-14的作用靶点[1，7]。
2002 年,Calin 等首先发现，miR－15a 和 miR-16-1在约65%的B细胞慢性淋巴细胞白血病（B－CLLs）病人中表达下调。随后不久，Cimmino等[15]又发现，在B－CLLs 细胞中 miR－15a和miR-16-1直接与BCL2的3′－UTR序列相互作用调控BCL2蛋白的表达，并与之成负相关，而BCL2是作为抗凋亡基因参与细胞凋亡过程的,这里miR－15a和miR-16-1发挥了类似抑癌基因的作用，而且miR－15a和miR-16-1还可能激活外源性APAF－1—胱天蛋白酶－9(caspase-9)-PARP凋亡途径，参与凋亡过程。
5.4 miRNA与激素分泌
美国洛克菲洛大学的研究人员从糖诱导的鼠胰岛β及α细胞系的RNA中克隆出大量长度为21~23个核苷酸长度的RNA，其中，miR-375含量最多，研究发现，miR-375能够抑制β细胞系分泌胰岛素，进一步研究结果表明，miR-375通过与靶基因mtpn 的mRNA3' UTR不完全互补配对，转录后水平抑制了靶蛋白的表达，从而抑制了胰岛素分泌的出胞过程[1]。这一研究发现为机体如何调节胰岛素分泌过程开辟了新路，同时也为一些疾病（如糖尿病）的治疗奠定了基础。组织特异性miRNAs，如miR-375，将可能成为一些疾病治疗药物新的作用靶点。
5.5 miRNA与肿瘤发生及治疗
近几年，miRNAs与人类肿瘤的关系逐渐引起了人们的广泛注意，并不断有肿瘤发生
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与miRNAs的表达有关的例子的报道。研究表明,miRNA的表达水平在许多肿瘤中发生改变,它们可能起到原癌基因和抑癌基因的作用。
Calin 等[5]发现 miR- 15a 和 miR- 16- 1 定位于染色体 13q14, 而这一区域在一半以上的 B- CLLs 病人中缺失。而且这一缺失在约 50%的外套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma, MCL), 16%～40%的多发性骨髓瘤和 60%的前列腺癌中出现。推测他们可能起着肿瘤抑制基因的角色。随后，Calin等又惊奇地发现，超过一半的miRNA位于和肿瘤发生相关的区域和脆性位点、杂合型丢失区(minimal regions of loss of heterozygosity)、扩增区[minimal regions of amplication (minimal amplicons)]或断裂点区(common breakpoint region)。；
此外，Iorio和Michael等发现，miR-143，miR-145 在结、直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌和淋巴瘤中的表达下调，这两个基因位于 5q32-33。 He等研究发现，miR-221, -222, -146在乳头状甲状腺癌中显著上调。Ciafre SA和Chan 等发现，miR-21 可作为一种抗凋亡因子，在恶性胶质瘤和乳腺癌中的表达是上调的。Metzler等在儿童的Burkitt淋巴瘤中发现 miR-155/BIC 的前体高表达。Johnson SM 等发现肺癌let-7的表达常是降低的，let-7的靶点是Ras癌基因，RAS 信号通路在哺乳动物中调控细胞的正常生长和恶性增殖, RAS 蛋白过表达会引起细胞的恶性增殖，let-7表达的降低可致其靶点癌基因Ras表达的增加和促进肿瘤生长[5，9]。
可见, miRNA 表达水平的变化, 导致了肿瘤基因或抑癌基因转录后的异常调控, 从而导致肿瘤的发生。若miRNA的靶基因是癌基因,此miRNA的表达低于正常水平,也意味着它对癌基因的抑制作用减小,引起癌基因编码的蛋白增加,导致肿瘤发生;反之,若miRNA的靶基因是抑癌基因,此miRNA的表达高于正常水平,也意味着它对抑癌基因的抑制作用增加,引起抑癌基因编码的蛋白减少,也会导致肿瘤发生[11]。从这种意义上理解,一些miRNA可能是潜在的癌基因或者抑癌基因,通过寻找具有癌基因和抑癌基因性质的miRNA,可以为肿瘤的诊断和生物治疗提供新的靶标。
许多miRNA的异常表达都与癌症或其他一些疾病有关, 最新有研究[17]发现，miRNA 成熟过程的总体抑制促进了细胞转化和肿瘤形成，但目前对调节miRNA表达的因子却知之甚少。Lee J等[19]在miRNA基因上游鉴定了大量调节元件，这些元件可能在miRNA的转录及转录后水平的调节上起重要作用。研究中他们提出了一种可能，认为一些与疾病有关的蛋白质编码基因的转录因子(transcription factors ，TFs)导致了疾病（如肿瘤）中miRNA的异常表达。经进一步研究分析并提出假设，包括c-Myb、 NF-Y、Sp-1、
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MTF-1和AP-2alpha在内的转录因子(TFs)是miRNA表达的主调节子(master-regulators)。因此，对调节miRNA的转录因子的研究将为miRNA关联疾病的治疗提供有效帮助。
关于miRNA功能的研究也正在进行中，寻找下游靶基因是发现miRNA功能的一个直接手段。植物miRNA与靶基因几乎完全配对结合，而且像小的干扰RNA一样可以结合于mRNA的任何区域，所以植物miRNA靶标基因的鉴定相对直接而容易。研究表明，植物miRNA大部分作用于与发育过程相关的转录因子，尤其与模式建立和细胞分化有关。与植物相比，由于miRNA与靶基因的不完全配对，在动物基因组中直接寻找就显得有些困难，但也有研究尝试依据其他特征用生物信息学查找，但总的来说仍需要实验检验。从仅有的例子来看，一个miRNA可调控细胞中与某一种物质代谢或信号转导途径相关的几种mRNA，这样更能有效地发挥作用。寻找miRNA的靶基因是目前功能研究的热点之一，因为这为揭示每一个miRNA的功能提供了必不可少的线索，从而为全面了解miRNA在细胞中的功能打下基础。
6 小结
由于miRNA这类小分子在生命活动中具有广泛的调节功能, 自被发现以来,miRNA即成为生命科学的研究热点。无论在理论上和应用上，miRNA为非编码RNA参与基因调控提供了一个范例，miRNA是对中心法则中RNA作为中介角色的重要补充,促使生物学家重新思考细胞遗传调控等方面的问题。
miRNA作为新的研究切入点，为功能基因组学，基因治疗，转录调控机制提供了一条有效途径。近年来对miRNA的研究已经取得了突破性进展,并且有大量的miRNA被鉴定,但是总体来说对miRNA的研究还处在理论水平上,关于miRNA的应用的例子还较少。miRNA作为体内正常表达的基因,与人类疾病（特别是肿瘤）和植物培育的关系还有待进一步研究。
尽管目前miRNA应用于基因治疗的尝试才刚刚开始,但已经在药物设计及疾病治疗等实际应用中显现了巨大的应用潜力, 相信随着对这种特殊分子研究的不断深入,以miRNA为靶点或者以miRNA为治疗手段的设想,以后可能会成为焦点，并且将为肿瘤和其它疾病的治疗带来新的希望。相信这些研究成果必将促进整个生物界研究领域的进步与发展。
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Advances in mechanisms and functions of miRNA
Wang juan
(Biology of Department, Dezhou University, Dezhou, 253023, China)
Abstract: MicroRNAs (miRNAs) are about 20~25nt nucleotides endogenous noncoding RNAs, which is closely related with the regulation of gene expression. They are distributed among eukaryotes, and conserved during evolution. The distribution and conservation of miRNAs indicate that they play important roles in life activity, such as physical development, differentiation and proliferation of cells, hormone secretion and carcinogenesis. This paper reviews the advances in the research of the characteristics, biogenesis, molecular mechanisms and functional significance of miRNAs action to provide important insight into the roles of microRNAs in the physiological and pathological process in eukaryotes.
Key words: small interfering RNA; microRNA; Piwi-interacting RNA; microprocessor; RNaseⅢ; gene expression regulation; development time; cancer biotherapy
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谢 辞
经过大学四年紧张而充实的学习生活，我觉得自己在各方面都收获了很多。毕业论文是大学期间的最后一个作业，也是检验自己学习成果的总结，所以我特别用心地对待。经过两个多月的努力，我终于顺利完成了毕业论文，这与许多老师的悉心教导是分不开的，在这里向在学习中给予我大力支持和指导的老师表示深深地感谢！
感谢我的论文指导老师魏振林老师，魏老师治学严谨，学识渊博，在论文的选题、 资料查询、开题、撰写及修改的每一个环节都给予了悉心的指导和帮助。在此向魏老师 表示衷心的感谢！
感谢在大学期间教我课程的所有任课老师及班主任张红梅老师，感谢老师们在学习和生活中给我的关心和帮助，
感谢德州学院，学校严谨的教学环境为我的学习提供了一种良好的精神氛围，使我在学习及生活方面都受益匪浅，在学院的这四年将会对我的一生都产生深远影响。
感谢我的家人，他们含辛茹苦供我上学，让我有机会获得良好的教育，在生活上及学习上给予了极大的支持和鼓励。
时光如水，日月穿梭，四年的学习一晃而过。今后，我愿意更加努力的学习来报答曾经关心我的老师、同学及朋友。
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德州学院 生物系 2007届 生物科学专业 毕业论文（设计）附 录: 英文译文：
原文：Shivdasani RA. MicroRNAs:regulators of gene expression and cell differentiation. Blood, 2006,108(12):3646~3653.
译文： MicroRNA：基因表达和细胞分化的调节子
Ramesh A.Shivdasani
近来，一类具有调节作用的RNA分子的存在和作用成为一大热点。MicroRNAs(microRNAs)是一类小的(大约22nt）的非编码RNAs，它通过识别同源mRNAs上与其不完全配对的靶序列，使这些mRNAs不稳定或抑制蛋白质翻译。尽管miRNAs生物发生的机制已经被详细阐述，但对他们的生物学功能还所知有限。已报道的例子都典型的聚焦于miRNA调节的单一组织限制性转录物，通常，每一转录物编码一个转录因子，该转录因子控制发育、细胞分化或生理上得一个特定方面。然而，计算公式预测，对应于每个miRNA有达上百个假定靶目标，而每一转录物由多个miRNA调节，miRNA可能通过消除靶目标表达或微调转录物和蛋白质水平起作用。理论上的考虑和早期试验结果表明了miRNA的多种不同作用。一个吸引人的可能是，miRNA消除不需要基因的低水平表达从而完善单系基因表达，这种可能也需特别适用于解释血细胞生成模型。这篇评论总结了对miRNA作用机制的现代理解，并列出了一些突出的重要问题，描述了一些试图在血细胞生成中定义miRNA功能而进行的研究。 miRNA，（基因）沉默之声
MicroRNAs(microRNAs)是一类小的，通常种系上保守的非蛋白质编码RNAs，他们通过抑制蛋白质翻译或使靶目标不稳定介导转录后基因抑制。miRNAs识别靶位点，通常与同源mRNA的3′非翻译区(UTRs)不完全配对结合，在序列配对中有一个或多个非配对碱基。已知miRNAs能过调节一系列不同的生物过程，并且对他们的遗传趋同、生化核结构的研究使得对他们的生物合成和分子机制的理解迅速增加。相对而言，对这些大约22nt的RNA产物的详细生物功能还了解甚少。到目前为止，仅有少数研究提供了脊椎动物中一些特定miRNA功能的具体证据，尽管这些功能也许是普遍存在的。现在所知的局限性进反映了这一领域的最初级阶段，我们完全可以预测miRNA在功能研究上将有巨大发展，而这些功能研究将完善对每一miRNA功能的理解。
miRNA的研究历史和一般特性在不同的文章中已被广泛评述，这里，在探讨对miRNAs在细胞分化特别是血细胞生成中的作用的所知之前，我先简单回顾一下miRNA的生物发生和作用机制。许多普遍的和生化方面的见解来源于在昆虫和蝴蝶中进行的实验，并在适当的时候对这些实验研究进行讨论。尽管对非脊椎动物的调查研究也能提供许多功能发面的洞察点，本篇评述则聚焦于脊椎动物中miRNA的功能。
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第一个被发现的miRNAs,lin-4和let-7，相隔七年分别被确认，是基于前期对秀丽新杆线虫突变表性的基因扫描。两个实体通过抑制各自靶目标的翻译控制发育时期，这些靶目标是基因lin-14和lin-41的蛋白质编码mRNA产物。尽管小调节RNAs介导的转录后基因沉默最初被认为是生物契机，这也许只是针对某些低等生物而言的，我们现在已知的许多细胞有机体表达上百个miRNAs，并在不同的细胞和组织中有很大变化。miRNAs发现于多细胞动物和植物而不是例如酵母一类的单细胞有机体。通过定义可知，miRNAs相当于小克隆RNAs，像lin-4和let-7产物，miRNAs由基因转录的茎环前体而不是他们调节的前体加工而来。内源性的不符合这些标准并被共认为siRNA的小RNAs来源于长的双链RNA(dsRNA)前体，在有些物种中，这些前体可由重复元件、异染色质或转座子转录而来。两类小调节RNA主要区别为他们的来源而不是功能，尽管siRNA一般与他们的靶RNA完全配对，他们可以在RNAi这种作用下进行分组。 miRNA的功能的重要观念
在斑马鱼的发育过程中，miRNA表达活力是目前最显著的特征，大多数miRNA在胚胎发育过程中出现相对较晚并表现出组织特异性分布。在一些哺乳动物器官（包括骨髓）中，一批组织特异性miRNA倾向于控制miRNA的表达轮廓。在对小鼠miRNA的一个有限的分析中，同一种组织的miRNA表达轮廓和成体不同，同最初辨认的线虫miRNA，这些发现形成了一种观点，miRNA的主要功能是控制细胞分化和发育。确实，小鼠胚胎干细胞失去合成miRNA的能力仍然可育但不能分化，不能产生成熟miRNA的斑马鱼胚胎，起初发育正常，但在原肠胚形成和器官形成过程中表现出形态缺陷。特定主要miRNA的功能部分通过miR-196在脊椎动物肢体发育过程中的作用得到证明；通过miR-1簇在心肌细胞分化中的作用和miR-181在保持循环中T和B淋巴细胞的平衡中的作用得到证明。然而，miRNAs是广泛表达于发育中和成体组织中的，他们的功能可能是广泛的、多样的。
在研究的最好的例子线虫和哺乳动物中，miRNAs通过抑制某个或若干个靶mRNA关键发育过程。然而，正如我们将要看到的，典型miRNA能够潜在调控十几个或几十个基因，并且大多数靶目标含有独立的miRNA识别位点，而这些识别位点对于完全的基因沉默也许是不充分的。这些思考促使Bartel和Chen提出：存在对许多基因的选择性压力以避免不需要miRNA的干扰，这些miRNAs广泛存在并具有有限互补需求。Stark及其同事最近报道，似乎避免miRNA调节（“抗靶“）的基因倾向于在所有细胞中普遍存在的过程中起作用，然而假定的靶目标在发育过程中特别是器官行程中更加复杂。一些在果蝇胚胎中测试的结果表明，miRNAs和一些预期目标确实在非重叠相邻的分布区中表达，然而，miRNAs和抗靶基因是共同表达的，Farh等发现尽管在他们的分析中预期靶基因在含有同源miRNAs的组织中低水平表达，不会全部排除，但哺乳动物的miRNAs的靶基因和抗靶基因表达具有类似结果。更进一步，在一个临时的对小鼠肌管分化的分析中，他们展示了组织特异性miR-1和
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miR-133的预期靶目标在这些miRNAs积累之前是高表达的，随后，这些靶目标被下调了。同样，这些发现增强了一种可能：一些转录物是经前处理存在的，它们存在于不需要它们或它们具有潜在危害性的区域；miRNA也许已进化，来微调基因表达程序并且比内源性衰退更快的消除基因产物。这种特殊作用也许尤其与血细胞形成中一致。在一个被称为多系基因飞沫的过程中，成熟的血祖细胞开始时激活一个渗漏的广泛的转录计划；正如细胞遵守一个被限定的命运，单系基因表达被强化了而具有供选择血细胞类型的转录物消失了。可以试图推测miRNAs驱动了后期，这项推测还未经实验证实。
动物基因组不但编码大量组织限制性miRNAs，而且，这些miRNAs能够大量高效的表达，估计在秀丽线虫每个细胞中有800到5000个。MiRNAs存在于小的非编码基因上，也许是被理想定位以调节组织特异性表达。因为后者功能是细胞分化的核心，可推测在所有的多细胞物种中miRNA作为一个种类在产生和维持不同的细胞系中起重要作用。然而，之前对线虫和果蝇的基因扫描只产生很少miRNAs，这也许反映了编码单元是很小的，主要在表型突变个体中，并行当程度地功能多余。然而，现在的miRNAs大多由cDNA克隆获得。在2006年5月，一个联合数据库（miR库）在人和小鼠中分别识别了462和340个miRNAs。为所有物种miRNAs的命名和注释也集中进行，用miR之后加一个识别数字命名。相同的miRNAs无论在何种器官都用相同的数字，就如同用预测的近乎一致的序列代替传统miRNAs，同一物种中高度类似的miRNA也命名以相同的数字，后用字母附以他们不同的基因。
MiRNA的生物发生和转录后基因抑制的机理
成熟的miRNAs长约18-26nt，具有5′磷酸基和3′羟基。他们的前体pre-miRNA是典型的茎环结构，长60-80bp，在3′端有两个未配对的核苷酸悬垂。而pre-miRNA来自于长的初始miRNA转录物(pri-miRNAs)，pri-miRNAs可超过1kb，是RNA聚合酶II活动的产物。大多数pri-miRNAs是独立的转录单元，尽管许多哺乳动物miRNAs编码于mRNA内含子并且共用相同的初始转录物作为他们的蛋白质编码基因。MicroRNA在茎部高度保守，在环部具有变动多样性。尽管miRNA发夹旁侧序列的保守性迅速下降，然而这些区域是初始转录物的核处理所必需的。
pri-miRNA首先在细胞核中被微处理器复合物及其相关因子处理成50-80碱基的pre-miRNA茎环结构，微处理器包括RNaseIII: Drosha和他的搭档DGCR8/Pasha。pre-miRNA通过Ran-GTP依赖性因子exportin-5被运输到胞浆中，在胞浆中，第二个RNaseIII类似的核酸酶Dicer，将他们进一步处理成双链，长20-24nt的成熟miRNA和发夹另一臂类似大小的序列。新生的miRNA可能存在于茎环前体的任一臂，但每一pre-miRNA只产生一个成熟的miRNA。pre-miRNA二级结构中的沟、凸起和非配对性区域减少了他们的稳定性并影响了他们被处理成成熟miRNAs的效率。当被解螺旋后，
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双链中的一条链非对称地进入RNA诱导的沉默复合物(RISC)，这条链倾向于是5′端不完全与其互补序列配对的一条链，由此前体物两条链的功能元件即被确定。
类似热力学上的考虑也应用于成熟miRNAs和他们的蛋白质编码RNA靶标之间的相互作用。因此，miRNA抑制同源mRNA的能力大部分由与5′端2-8个核苷酸结合的自由能决定，而miRNA 3′端的实际贡献则很小。5′端2-8个核苷酸因此被认为是miRNA靶目标识别的“钥匙”，互补的进化保守性和这些相对较小的区域成为信息学上对靶基因进行预测的关键基础。保守的腺苷残基倾向位于互补区域的侧区，这暗示着初始序列决定元件和碱基配对共同使靶目标识别具体化。
在大小和化学特性上，miRNAs类似siRNAs，无脊椎动物中siRNAs通过精确互补识别其靶目标并诱发其衰退。正如图1中描述的，这两类小的非编码RNAs来自不同的短暂前体：siRNA前体是长的（几百到几千bp）双链分子，miRNA前体是较短的（60-80核苷酸）pre-miRNA茎环产物。然而，这些多样的小RNAs的产物和功能都需要许多共同的因子：特异性裂解双链RNA的核酸内切酶，如Dicer和Argonaute家族的小RNA结合蛋白，后者指导靶分子进入RISC核糖核复合物。更进一步，包括RISC的mRNA降解设备定位于胞浆中，不相关联的加工体(“processing”or“P”bodies ),也被称为GW bodies，在这里，miRNAs靶向的转录物最近被证明是以miRNA依赖的方式集中的。因此，像siRNA诱导的mRNA降解，miRNA明显的翻译抑制也涉及转录物向P-bodies的运输，而这种P-bodies缺少核糖体成分；这种重新定位可能是抑制蛋白质翻译的结果或作为其基础。
早期工作表明，siRNAs可减少它们的靶mRNAs而miRNAs通常保持靶转录物的水平而阻止蛋白质翻译。siRNAs和miRNAs之间的区别已渐渐模糊了，miRNAs被认为同时具有翻译抑制和mRNAs降解两种作用机制。P-bodies中RISC的定位也许能帮助理解二者明显的不同点，miRNA介导的转录物降解也许代表了P-bodies内汇集的第二级结果。稳态水平的转录物有一个高的内源性衰退率可明显地揭示一种可观的下降，而内源性稳定的mRNAs可继续存在于细胞中；然而，来年各种转录物也可平等的接受转录后抑制。
最近，一向深入的研究阐释了几个与这篇评论有关的几个问题。当把miR-124转移到Hela细胞中后，lin及其同事观察到脑发育轮廓的转变，位点是内源性的miR-124最丰富的地方；类似地，miR-1转染改变了肌肉发育轮廓，miR-1也是高表达的。假定真如那样，即使没有一个清楚的分子机制，这些结果也表明了选择性miRNAs参与细胞个性形成中重要的基因调节。值得注意的是，在每一个事件中，几十个转录物的水平在12小时内下降，并且被影响的mRNA的3′-UTRs为了与同源miRNAs的5′端序列互补而变得丰富了。因此，一些负调转录物也许是miRNA介导的直接降解的靶目标，这不同于miRNA在抑制蛋白质翻译方面的作用。进一步，至少miR-1和miR-124或其他组织特异性miRNAs，似乎是直接调节大量的转录物。因此，可以相信的是，细胞个性的建立和维持部分依赖于
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少量关键miRNAs对种系特异性基因表达的微调节。
基本的分化机制传统上归因于种系限制性转录因子(TFs)，TFs本身或者他们的特异性产量或二因素共同成为miRNA进行直接调节的继承者。这样看来，有趣的是尽管目前对假定miRNA靶目标的预测占据可分子功能研究的较大部分，但TF编码基因的调节点丰富了，并且合理的miRNAs功能的例子同样强调了他们在调节组织限制性TFs如NF-1,Hand2和HoxB8等中的作用。然而，这些例子反映了一种研究上的障碍，如果miRNAs作为一类能影响几百个或几千个基因的分子的话，miRNA的功能就明显超出TF转录物靶目标的范围。一个研究得很好的反例是：进化上保守的胰岛细胞特异性miR-375，它似乎是靶向肌营养信息而抑制葡萄糖诱导的胰岛素的分泌，从而对胰岛素的胞泌产生影响。
独立于miRNAs在抑制TF基本上可能的广泛作用之外，TFs和miRNAs作为分子调节者在功能上的相似之处也是值得注意的，正如我们看到miR-1和miR-124一样，单独的TFs或miRNAs可以调节许多不同的基因。TFs和miRNAs也可以合作对它们的靶基因起作用，这典型地含有多种转录活性所需的DNA顺式作用元件和多于一个的用于mRNA负调节的假定miRNA识别位点。因此，TFs和miRNAs都可产生组合密码指导细胞个性和表型的形成。理解这些相互作用的假定网络是研究细胞分化中miRNA功能的重要挑战。 多少miRNAs？多少靶目标？
在感叹miRNA功能广泛的同时，拥有对一个物种的miRNA基因总数的精确估计是有用的。在开始克隆100多个miRNAs之后，当再度鉴别之前的克隆物种时，这很快达到了一个饱和点。然而，低表达的miRNA只存在于器官中的少数细胞中调节发育，抗克隆的miRNAs在一般的研究策略中也许会不被探测到。同样，即便是最灵敏的公式在预测miRNA基因时也做假设以增强计算机搜索的严谨性。然而，综合克隆技术与计算机预测技术的联合已大大扩充了动物miRNAs的数量。大多数克隆miRNA在亲缘较近的物种中表现出序列保守性并且经长期进化仍然保守；在已鉴别的人和鼠miRNAs中，一多半已在鱼中鉴别出其同系物，在蝴蝶和虫子中也发现其大约一半的同系物。正是这些进化上的保守性和茎环结构为几百个miRNAs的计算机预测提供了重要基础。在一个综合运用生物信息学预测、微列阵分析和序列指导的克隆技术的全面的手段中，Bentwich及其同事识别了近100个新的miRNAs，并预测了至少800个miRNAs的存在。然而，miRNA潜在调节的范围仍然不确定，预测的miRNA应当被谨慎对待直到它们被实验证实。
较困难的事，miRNAs只与它们的靶mRNAs有限序列互补，因此每一个miRNA可以与几十个基因作用；相反，一个基因能在一个或多个潜在3′-UTRs含多种miRNA识别位点。发表的关于脊椎动物
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的研究论文把关注放在了生物信息学预测的结果上，但脱离计算机提供的线索，任何哺乳动物靶目标还没有被确认。这种公式预测miRNA靶目的方式常运用建立在序列互补上的得分方案，形成的RNA双螺旋的自由能计算及系统发育保守性。在一个4个基因组3′-UTRs的分析中，Lewis等用Target ScanS algorithm识别了在4个物种保守的13000个假定调节关系，并暗示了超过5000个作为后继miRNA靶目标的人类基因（被测基因的30%）。运用独立的PicTar algorithm，Krek等在哺乳动物中得到了保守miRNA范围的类似结论，其预测与Target ScanS分析有很大重叠。相比而言，John等已预测了大约2000个人类基因靶目标，并很少与Target ScanS和PicTar重叠。Lewis等在开放阅读框探测到另外的靶目标并推论说，人类基因超过三分之一处于选择性压力中以维持与miRNA配对。更进一步，现在，有越来越多的实验和计算机上的证据证明存在着大量非保守靶目标。然而，每一个对miRNA靶目标大预测都应被认为是暂时的，在进行生物调查的尝试之前都应对假定miRNA靶目标组合用实验证实其有效性。
一个miRNA可以靶向多种转录物，一个转录物可能接受多种miRNAs的调节，这种可能扩大了假定miRNA调节的潜在的深不可测的领域。这些思考所呈现的观念上或生物信息学上的问题是令人畏惧的，并可以与紧随基因组规模蛋白质互作的辨认所出现的问题相对比，然而，在后一个例子中，图示出的基因表达的区域减少了挑战的程度。因为蛋白质只有在共同表达时才能相互作用。相比之下，miRNAs可以与它们的靶目标共同表达以抑制基因表达，或当miRNA在消除靶基因表达时，二者共同出现在互补区。潜在问题的解决办法需要严谨的实验和对低表达miRNA及mRNA产物的置信评估。另外，并不是所有的miRNAs功能类似，其中一些可能确实调节一个基因，而其它的可能对某一发育或生理状态下基因表达程度有一个广泛影响。（图3）
在评述我们对白细胞发生中miRNA的影响所知之少之前，值得我们去学习从少数报道的哺乳动物miRNA功能的例子中得到的教训。鼠miR-196编码哺乳动物A、B和C Hox基因簇的三个平行进化同源区，抑制HoxB8 mRNA及下游Sonic hedgehog信号发送，这些信号因子决定发育成前肢还是后肢。在一个不同的情况下，miR-1基因成为肌肉分化转录因子，如血清应答因子MyoD和Mef2的直接转录靶目标，并且它们的miRNA产物调节Hand2的水平，Hand2是在心室中促使心肌细胞膨胀的转录因子；发育中心脏的miR-1过表达减少了增值心肌细胞库的大小。除了在下一部分“血细胞发生中miRNA的表达和功能”中将要描述的第三个例子外，这些例子只有一些共同的指导性特点。首先，在每一事件中，被详细调查的miRNA以一种允许产生有说服力的可测验的假说的方式表现出明显的差别表达。miR-1在心肌和骨骼肌前体中很丰富，而miR-196在后肢芽的表达量是在前肢芽的20多倍。其次，相关联点是在每一事件中，对研究中的组织已有可观的信息，因此，调查者可测试其一致性并依赖被证实合理的实验系统。第三，miRNA靶目标的鉴别仍然很大程度地计算机预测，
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并加上前期知识以帮助聚焦于合理的后继者。这些特点将继续指导miRNA功能的进一步研究工作并进入可向前发展的未来。当然，这些例子证明了少数几个具有有限TF3靶目标的因子的初期作用。这种情况很可能是个例外而不是一般miRNA功能的规则。它需要新的实验规范已能够深入调查更多事件，在这些事件中少数或许多miRNAs联合作用于无数的靶目标来微调生物过程。 血细胞发生中miRNA的表达和功能
血细胞并不包括在早期报道的鉴定组织特异性miRNAs的工作中。随后，Chen及其同事从小鼠骨髓中克隆了大约100个miRNA，然而许多已经在非血组织中被鉴定，一少部分，包括miR-142，miR-181a和miR-223在血细胞和有限数量的其它位点中较好地表达。miR-223和miR-142表现出最强的限制性分布，事实上局限于骨髓和脾；一些miR-142也在胸腺中表达，而这里miR-181a尤其丰富。其它从miR微列阵和对配位血细胞（主要是淋巴细胞）群的Northern分析的结果表明极少数miRNAs是真正在分布上被限定的。确实，报道的miRNA表达的组织专一性大体反映了其富集，也许是可观的，在一定细胞中并不一定排除在所有其它位点之外。然而，一些miRNAs可明显应答于细胞操控：在T辅助因子1(Th1)或Th2存在的条件下，miR-150对T细胞的刺激作用很快被下调，而miR-146在有Th1淋巴细胞时被选择性的增加。在一个最近的对取自CD34骨髓细胞的核细胞集落刺激因子培养物的表达分析中，Garzon及其同事鉴定了19个减少2-50倍数的miRNAs，而没有与核细胞集落刺激因子一起增加。尽管这些miRNAs中的两个：miR-10a和miR-130a被认为是分别靶向转录因子基因HoxA1和MAFB，大多数miRNA差异表达及在血细胞发生中引起的变化的真正意义仍未知。
为了弄清血细胞发生中miRNA的功能，Chen等将他们鉴定的血细胞特异性miRNA引导进入鼠的血祖细胞，随后进行体外分化或移植到致死辐射的宿主中。在体外miR-181a的过表达引起B淋巴细胞数目两倍增加而不影响T淋巴细胞系，尽管在鼠中移植的研究导致循环中T淋巴细胞两倍减少和CD8亚群约90%的下降。相比之下，miR-142和miR-223仅在体外被研究，适度的增加了T细胞而不是B细胞的数量；miR-30不能很好在血细胞中表达，它不像通过谱系标准参照物的流式细胞术所判断的那样影响血细胞的发生。而miR-181a似乎能够调节淋巴细胞谱系，需要强调的是这些结论依靠对miRNAs过表达的研究。确实，实验上的局限性限制了通过功能缺失而迅速判断miRNA功能的能力，并且在任何事件中，似乎miRNA的调节包含大量的多余。
相比少数miRNAs的特别要求，造血器官中miRNAs的一般要求已经在鼠中被评价，通过胸腺中
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dcr-1(Dicer)基因的选择性删除。这些小鼠表现出外周CD8+T细胞发育上的严重阻碍并减少了CD4+T
淋巴细胞的数目，这些CD4T淋巴细胞较差地增殖并在兴奋剂刺激后很快凋亡。Dicer缺陷的T细胞能很好的表达干扰素-γ，是隶属于Th1系的细胞因子。这些观察现象代表了miRNA缺失的网络效应
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和其他可能未知的Dicer功能，也许包括siRNA加工过程。相应地，仍然不清楚的是它们是否反映了一个关键miRNA或控制有限靶mRNA的少数调节子的组织特异性消失，或一个包含许多miRNAs的复杂途径的功能输出，每一个miRNA都有限定的作用。确实，miR-181过表达和Dicer基因删除研究的根本局限性是初始mRNA靶目标的身份和活性仍未知。靶目标预测公式确认了不少于340个保守的miR-181a候选靶目标，其中几十个具有平衡置信度。因此，解析其调节路径提出了一个巨大的挑战。相比之下，miRanda公式预测的靶目标与其它方法很少有重复，它暗示了人类HOXA5基因作为miR-181候选靶目标,这个假定的靶目标在造血细胞中表达。在这里，它在先前调节髓样细胞和红细胞样细胞前体的平衡时就已经被揭示。然而，后一个研究没有报道淋巴细胞的比例；miR-181a过表达不影响红细胞的分化；miR-181a和HOXA5的相互作用最多仍然是推测性的。
miR-223是另一个血细胞限制性miRNA，在CD34骨髓细胞中达最高水平，在T或B淋巴细胞中不存在，它通过转录激活因子C/EBPα被髓样细胞前体的视黄酸诱导。C/EBPα在髓样细胞发生中很重要，因为它调节许多髓样细胞特异性基因并以牺牲双潜能前体中单核细胞的分化程序为代价促进了有粒白细胞特异性基因，C/EBPα敲出的小鼠表现了神经营养细胞和嗜酸性粒细胞分化的选择性失败。为分化的NB4细胞系中miR-223的过表达诱导了成熟过程一致的形态变化和CD11b与粒细胞克隆刺激因子受体的表达。相反，在少数例子中，脊椎动物miRNA的功能通过实验上其水平的减少来评价，这些例子中的一个，被互补密封核苷寡核苷酸miR-223在miR-223和CD11b的数量上都引起下降。这些miR-223效应部分通过翻译抑制编码TF NFI-A的miRNA得到调解。NFI-A和C/EBPα竞争与miR-223基因启动子的部分重叠DNA序列结合，只要NFI-A存在，这个miR基因就失活。随着发生于视黄酸诱导的有粒白细胞的分化中C/EBPα的出现，miR-223表达被激活，导致了它的靶mRNA NFI-A的抑制。因此，miR-223似乎是一个简单的控制粒细胞发生的TFs的调节路径的关键角色，并帮助稳定由C/EBPα诱导的神经营养细胞表型。（图4）正如NFI-A mRNA只是几百个miR-223可能的靶目标中的一个，这里描述的路径也许仅代表了全部分子效应的一个方面。原则上，miR-223可以负调许多基因，这些基因将在多潜能前体或非粒细胞中表达并因此以帮助完善神经营养细胞特异性基因表程序。尽管这个假说仍需验证，但它与这个领域浮现的概念及特定miRNA能够影响血细胞发生的不连续方面的证明相一致。
在一个类似的例子中，Felli及其同事发现miR-221和miR-222在取自人脊髓的CD34造血细胞前体中的高表达；培养物中这些细胞的单系细胞样细胞分化导致这两种miRNA水平的下降，这两种miRNA在靶配对的种子区具有实际一致的序列。生物信息学分析表明，c-kit作为一个可能的靶目标转录物，并且在培养细胞中，c-kit mRNA水平与miR-221及miR-222水平成反比。这些miRNA在TF-1红白血病细胞中或在红细胞样细胞培养物CD34脊髓血细胞中的强迫表达使细胞生长下降并伴随
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c-kit蛋白水平的下降。尽管这些结果没有表明X连锁的miR-221/miR-222簇在体内的真正功能，但作者的方法和发现的内部一致性强调了目前的实验范例把特异的组织限制性miRNA与候选靶mRNA联系起来。将来，这种研究需要在两种互补的道路上延伸：miRNA基因的靶向干扰和假定miRNA在候选靶目标3′-UTR的结合位点的靶向突变。因为miRNA调节者的繁多可能会限制这些试验的力度，对miRNA功能的全面理解只能从对互补结果的整合分析中得出。目前，揭示的miRNAs在造血方面的功能总结于表1。
白血病中miRNA的表达和功能
自然情况下，人们对miRNA和癌之间的关系已有很大兴趣，包括白血病。MiR-15a/miR-16基因座位于人类13号染色体的一个区域内，这个座位也是B细胞中慢性淋巴白血病(CLL)和外套细胞淋巴瘤中最通常的发生结构异常的基因座位；在近2/3的CLL样本中两种miRNAs均被删除或下调。其它的miRNA基因也被频繁地定位在染色体的脆性位点、失去杂和性和扩增性的最小区域和先前在一系列人类恶性肿瘤中鉴定的一般断裂点区域。Calin及其同事鉴定了75个CLL病人中有11人的42个序列miRNA中的5个为种系或体细胞突变，160个无癌症被测试者无此突变。然而这些发现激起了对miRNA在白血病发生中的直接功能的推测，其它有进展的发现聚焦于病理环境下miRNA表达的一般特点，混系白血病(MLL)1转录调节子结合于无数的转录起始位点，包括30%的已测miRNA座位，它表明mRNA和miRNA表达的大面积调节异常可能会促使白血病表型的形成。Lu及其伙伴报道：肿瘤相比它们的正常组有大量的miRNAs被下调，多如其他人在克隆标本中发现的特定miRNA水平的减少。在一项研究中，区分的分化较差的肿瘤中miRNA表达轮廓要比mRNA成功。更进一步，一个包括13个miRNA基因的表达轮廓能够区分具有特殊分子参照物的CLL和临床结果。MiRNA在区分肿瘤或促使疾病发生中的广泛作用仍需鉴定并可能成为一个被深入调查的领域。 总结评论
miRNA的研究进展近来似乎比其他生物领域都有较快的发展。这个领域从对一大类调节分子的无知到对miRNA生物发生的机理，几种物种（包括人）中miRNAs及其靶目标的数量的合理深入的理解。目前面临的一系列的挑战已经很明显：miRNA基因转录是如何被控制的？是否miRNA更通常地通过一个关键靶转录物起作用，正如目前报道的例子中所暗示的那样；还是通过对多种靶目标的微小效应调节一个基因表达的广大程序，正如进化上的考虑和一些实验结果所标明的那样？miRNA在人类疾病中更大的作用是什么？他们提供新的治疗机会吗？当这些问题开始引起调查者注意的时候，值得我们回忆血细胞学者的初始贡献和他们在解决基因、细胞分化和生化方面的问题时的特殊模型。尽可能多的miRNAs也许会控制细胞分化的分子方面，血细胞生成提供了一个理想的模型。在
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这里，关于miRNA作用机制和功能的想法可进行内部测试。同时，miRNA调节的明显领域已经打破了对血细胞发生和血液紊乱中后继调节子的简单传统的观点。毫无疑问这个领域将迅速包含新的生物学和为理解miRNA如何及达到何种程度来影响血细胞更新和特异化的不同方面。当这些问题都被解决的时候，我们能够期望有其它的发现，这些发现也许会告诉我们大量既不编码蛋白质也不编码其它已知调节分子如miRNAs的基因组的功能。
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