实验六 食品中志贺氏菌的检验

一、实验目的要求

1、了解食品的质量与志贺氏菌检验的意义。 2、掌握志贺氏菌的生物学特性。

3、掌握志贺氏菌检验的生化试验的操作方法和结果的判断。 4、掌握志贺氏菌属血清学试方法。 5、掌握食品中志贺氏菌检验的方法和技术。

二、原理

志贺氏菌属（Shigella） 的细菌（通称痢疾杆菌），是细菌性痢疾的病原菌。临床上能引起痢疾症状的病原生物很多，有志贺氏菌、沙门氏菌、变形杆菌、大肠杆菌等，还有阿米巴原虫、鞭毛虫、以及病毒等均可引起人类痢疾，其中以志贺氏菌引起的细菌性痢疾最为常见。人类对痢疾杆菌有很高的易感性。在幼儿可引起急性中毒性菌痢，死亡率甚高。所以在食物和饮用水的卫生检验时，常以是否含有志贺氏作为指标。

志贺氏菌属细菌的形态与一般肠道杆菌无明显区别，为革兰氏阴性杆菌，长约2-3μ m ,宽0.5-0.7μ m 。不形成芽胞，无荚膜，无鞭毛，不运动，有菌毛。志贺氏菌属的主要鉴别特征为：无鞭毛，不运动，对各种糖的利用能力较差，并且在含糖的培养基内一般不产生气体。志贺氏菌的进一步分群分型有赖于血清学试验。

三、试剂和仪器

（一）最先准备的器材

规格名称

数量 1个 1个 6个 8支 40支 2支 2 支 12套 1支

制SS、EMB平板

用途 稀释样品 制增菌液 制培养基 制三糖铁培养基 制蛋白胨水等

1、500ml广口瓶 2、500ml三角瓶 3、250ml三角瓶 4、18×180mm试管 5、13×100mm试管 6、1ml移液管 7、10ml移液管 9、250ml量筒

8、直径为90 mm平皿

（二）应灭菌的其它器材

剪刀1把

不锈钢汤匙1把

称量纸适量

（三）应准备的培养基和试剂

1. GN 增菌液 2. EMB培养基 3. SS琼脂

225ml/瓶

100ml/瓶 100ml/瓶

培养基总量 1瓶 1瓶 1瓶

所用容器

500ml三角瓶 250ml三角瓶 250ml三角瓶

4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 三糖铁斜面 6ml/支 葡萄糖半固体培养费基4ml/支 蛋白胨水 2ml/支 5%乳糖发酵管 3ml/支 甘露醇发酵管 3ml/支 棉子糖发酵管 3ml/支 甘油发酵管 3ml/支 兔血浆 3ml/支 多价血清和26种因子血清

6支 5支 5支 5支 5支 5支 5支 1支 15×150mm试管 13×100mm试管 13×100mm试管 13×100mm试管 13×100mm试管 13×100mm试管 13×100mm试管 13×100mm试管

四、实验内容

样品处理→→选择性增菌→→选择性平板分离→→生化学试验→→血清学试验鉴

别→→结果报告

第一天 样品处理和增菌培养

（一）、样品处理

无菌操作称取检样25g，加入装有225mLGN增菌液的500mL广口瓶内，固体食品用均质器以8000-10000r/min打碎1min，或用乳钵加灭菌砂磨碎，粉状食品用金属匙或玻璃棒研磨使其乳化。 （二）、增菌培养

放于36℃培养6～8h。

培养时间视细菌生长情况而定，当培养液出现轻微混浊时即应中止培养。

第二天 接种选择性平板进行分离培养

（一）、接种选择性平板

取增菌液1环，划线接种于HE琼脂平板或SS琼脂平板1个；另取1环划线接种于麦康凯琼脂平板和EMB（伊红美蓝）琼脂平板各1个。 （二）、培养

放于36℃培养18～24h。

结果：志贺氏菌在这些培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落

第三天 初步生化试验

（一）、接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体培养基

从SS、EMB琼脂平板、挑取平板上的可疑菌落，接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体各1管。一般应多挑几个菌落，以防遗漏。经36℃培养18～24h，分别观察结果。 （二）、培养

放于36℃培养18～24h。

结果：乳糖、蔗糖不发酵，葡萄糖产酸不产气(福氏志贺氏菌6型可产生少量气体)，无动力

可以弃去的培养物：

a. 在三糖铁琼脂斜面上呈蔓延生长的培养物； b. 在18～24h内发酵乳糖、蔗糖的培养物；

c. 不分解葡萄糖和只生长在半固体表面的培养物；

d. 产气的培养物； e. 有动力的培养物； f. 产生硫化氢的培养物。

第四天、血清学分型和进一步的生化试验

凡是乳糖、蔗糖不发酵，葡萄糖产酸不产气(福氏志贺氏菌6型可产生少量气体)，无动力的菌株，可做血清学分型和进一步的生化试验。 （一）、血清学分型鉴定

从三糖铁琼脂上挑取培养物，做玻片凝集试验。

第1步、先用4种志贺氏菌多价血清检查，如果由于K抗原的存在而不出现凝集，应将菌液煮沸后再检查；

第2步、如果呈现凝集，则用A1、A2、B群多价和D群血清分别试验。

第3步、如系B群福氏志贺氏菌，则用群和型因子血清分别检查。

福氏志贺氏菌各型和亚型的型和群抗原见表1。可先用群因子血清检查，再根据群因子血清出现凝集的结果，依次选用型因子血清检查。

第4步、4种志贺氏菌多价血清不凝集的菌株，可用鲍氏多价1、2、3分别检查，并进一步用1～15各型因子血清检查。如果鲍氏多价血清不凝集，可用痢疾志贺氏菌3～12型多价血清及各型因子血清检查。

表1 福氏志贺氏菌各型和亚型的型和群抗原

型和亚型 1a 1b 2a 2b 3a 3b 4a 4b 5a 5b 6 X Y 型抗原 Ⅰ Ⅰ Ⅱ Ⅱ Ⅲ Ⅲ Ⅳ Ⅳ Ⅴ Ⅴ Ⅵ - - 群抗原 3，4 1，2，4，5，9…… 1，2，4，5，9…… 1,3,4…… 1,7,8,9…… 1,6,7,8,9…… 1,3,4,6…… 1,(3,4)…… 1,3,4,6…… 1,3,4…… 1,5,7,9…… 1,2,(4)…… 1,7,8,9…… 1,3,4…… + + + - - + (+) + + - (+) - + - 在群因子血清中的凝集 6 - + - - + + - + - - - - 7，8 - - - + + - - - - + - + - 注:+凝集;-不凝集;()有或无

（二）、进一步的生化试验

已判定为志贺氏菌属的培养物，应进一步做5%乳糖发酵、甘露醇、棉子糖、甘油的发酵、靛基质试验。

1、 接种生化培养基

从三糖铁琼脂上挑取培养物上,拌种到：

5%乳糖、甘露醇、棉子糖、甘油、靛基质培养基中 2、观察试验结果

志贺氏菌属4个生化群的培养物，应符合该群的生化特性。但福氏6型的生化特性与A群或C群相似，见表2。

表2 志贺氏菌属四个群的生化特性

生化群 A群：痢疾志贺氏菌 B群：福氏志贺氏菌 C群：鲍氏志贺氏菌 D群：宋内氏志贺氏菌 5%乳糖发酵 － － － +/（+） 甘露醇 － ＋ ＋ ＋ 棉子糖 － ＋ － ＋ 甘油 （＋） － （＋） d 靛基质 －／＋ （＋） －／＋ － 注：＋阳性；－阴性；－／＋多数阴性,小数阳性;；（＋）迟缓发酵；d有不同生化型

（三）、结果报告：

综合生化和血清学的试验结果判定菌型并作出报告

五、思考题

1、如何提高志贺氏菌的检出率？

2、志贺氏菌在三糖铁培养基上的反应结果如何？解释这些现象？ 3、志贺氏菌检验有哪5个基本步骤？ 4、食品中能否允许有个别志贺氏菌存在？为什么？