四种分离式培养基检测沙门氏菌的效果比对

作者：黄耀雄，胡海艳，郑苗，张显勇，梁翠琴 来源：《现代食品》 2017年第6期

摘 要：目的：为了更好地开展食品中沙门氏菌的检验工作,使检测工作更加准确、高效，保障食品安全，开展此项目的研究。方法：参照食品国家标准食品微生物检验GB 4789.4-2010食品中沙门氏菌的检验和GB4789.28-2013培养基和试剂的质量要求。结果：本次研究选用的沙门氏菌显色培养基（CAS）、亚硫酸铋琼脂（BS）、木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂（XLD）和HE琼脂（HE）4种培养基的生长率、选择性、特异性均符合GB4789.28-2013中的要求，通过实际加标的结果对比分析发现，显色培养基CAS要优于BS、XLD、HE培养基。结论：在这四种分离式培养基中，显色培养基CAS在分离食品中的沙门氏菌过程中特异性和敏感性是最好。在实际的检测过程中，应灵活运用选择合适的培养基，减少漏检。

关键词：沙门氏菌；培养基；分离效果比较

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1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

鼠伤寒沙门氏菌ATCC13311、金黄色葡萄球菌ATCC6538、奇异变形杆菌CMCC49106、粪肠球菌ATCC19433（广东省微生物种质资源库）。

1.1.2 培养基与试剂

沙门氏菌显色培养基（CAS）（法国科玛嘉公司），缓冲蛋白胨水（BPW）、亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）、四硫磺酸钠煌绿增菌液（TTB）、亚硫酸铋琼脂（BS）、木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂（XLD）、HE琼脂（HE）、胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）（北京陆桥技术股份有限公司）。本实验中所用的实验试剂和培养基均在有效期内。

1.1.3 仪器

AC2-4S1生物安全柜（ESCO公司）；SS-325全自动灭菌锅（上海申安医疗器械厂）；恒温培养箱（上海新苗医疗器械制造有限公司）。

1.1.4 样品

实验所用样品均在市场购买，包括纯牛奶（菌落计数﹤1 CFU/mL）、生猪肉（菌落计数3.8×105 CFU/g）、肉馅（菌落计数：5.2×109 CFU/g，按照GB4789.4-2010[2]

检测,无沙门氏菌检出）。

1.2 方法

1.2.1 平板的制备

按产品使用说明配制培养基并倾注制成平板。

1.2.2 生长率测试方法

（1）工作菌悬液的制备。将标准储备菌株鼠伤寒沙门氏菌ATCC13311接种到NB肉汤培养过夜，制备10倍系列稀释的菌悬液。每平板的接种水平为20～200 CFU。

（2）接种。选择合适的稀释度的工作菌悬液0.1 mL，均匀涂布接种于CAS、BS、XLD和HE4种不同培养基的平板和TSA平板。每一稀释度接种2个平板。36 ℃培养24～48 h。选择菌落数适中的平板进行计数，按下列公式计算生长率。

PR=NS/N0

式中：PR—生长率；NS-CAS、BS、XLD、HE四种不同培养基的平板上得到的菌落总数；

N0—TSA平板上获得的菌落总数（该菌落总数应≥100）。

（3）结果解释。目标菌在培养基上应呈现典型的生长。选择性分离固体培养基上目标菌的生长率一般不低于0.5，最低应为0.1。

1.2.3 选择性测试方法

（1）工作菌悬液的制备。将标准储备菌株粪肠球菌ATCC19433和金黄色葡萄球菌ATCC6538分别接种到NB肉汤培养过夜作为工作菌悬液。

（2）接种。用1 μL接种坏取选择性测试工作菌悬液1环，在CAS、BS、XLD和HE四种不同培养基的平板和TSA平板表面划6条平行直线，同时接种2个平板。

（3）计算。培养后按以下方式对培养基计算生长指数G。每条划线比较稠密菌落生长时，G为1，每个平皿最多为6分。如果划线上没有菌落生长、生长量少于划线的一半或菌落生长微弱，则G为0。记录每个平板的得分总和便得到G。同时接种2个平板。

（4）结果解释。非目标菌的生长指数G一般≤1，至少应达到＜5。

1.2.4 特异性测试方法

（1）工作菌悬液的制备。将标准储备菌株奇异变形杆菌CMCC49106接种到NB肉汤培养过夜作为工作菌悬液。

（2）接种。用1 μL接种坏取选择性测试工作菌悬液1环，在CAS培养基的平板和TSA平板表面划平行直线，36 ℃培养24～48 h，同时接种2个平板。

（3）结果解释。非目标菌应有典型的菌落外观、大小和形态。

1.2.5 人工污染样品沙门氏菌的检测

分别取25 g（或25 mL）样品（纯牛奶、熟猪肉、肉馅3种）于含225 mL BPW的均质袋中，每种样品取2份，共6份，用拍打式均质器均质2 min，36 ℃培养18 h。取BPW增菌液1 mL分别加入至10 mLTTB、10 mLSC中，分别在42 ℃和36 ℃培养24 h，然后取TTB、SC培养液划线接种于待测培养基（XLD、HE、BS、CAS），比较其对沙门氏菌的检出效果。

2 结果

2.1 目标菌的生长率

沙门氏菌生长率实验结果见表1。

以TSA为参比，本次研究XLD、HE、BS和CAS培养基的PR分别为0.83、0.91、0.80和0.88， PR均大于0.5，所以，这4种选择性分离培养基的生长率菌符合要求。

2.2 非目标菌选择性比较

金黄色葡萄球菌ATCC6538划线接种到XLD培养基上，粪肠球菌ATCC19433分别划线接种于HE、BS和CAS培养基上，生长指数G均为0，按照GB4789.28-2013[3]要求，选择性分离培养基的生长指数G≤1，所以，这4种选择性培养基的选择性均符合要求。

2.3 非目标菌特异性比较

将奇异变形杆菌CMCC49106划线接种于CAS培养基上，（36±1）℃培养24～48 h，菌落较小，呈无色，其菌落特点符合使用说明书判定。

2.4 人工污染品沙门氏菌检测结对比

4种选择性分离培养基对3种样品的沙门氏菌见表2。

可以看出，检出情况略有不同。纯牛奶、生猪肉和肉馅中沙门氏菌的检出限分别为1、10、10 CFU/mL，

3种样品的背景菌落数对目标菌的检出有一定的影响，一般背景菌落总数越高越复杂，对目标菌的检出影响越大。在目标菌加标终浓度相同的情况下，CAS培养基要优于其中XLD、HE、BS培养基。

3 结论

作为肠道致病菌，沙门氏菌分布广泛、危害巨大，是引起食源性细菌肠炎的主要原因之一[4-5]。因此，针对沙门氏菌的分离和选择开发了许多选择性培养基，如何选择和利用特异性强、敏感性高和适用于食品样品的选择性培养基，直接关系到是否能够检出目标菌，所以选择性分离培养基的选取很关键。通过此次验证，4种选择性分离培养基的目标菌生长率、生长指数和显色培养基的非目标菌的特异性，均符合要求。人工污染样品检测实验中，低背景微生物污染的样品中CAS、XLD、BS和HE培养基的检出限相同，高背景微生物污染的样品中，CAS培养基要优于其他3种选择性分离培养基。CAS培养基能够准确的检测出沙门氏菌，培养后会出现单一的紫色菌落，其他三种选择性培养基会出现多种不同的菌落形态。BS培养基培养沙门氏菌菌落可以呈黑色有金属光泽、棕褐色、灰色或灰绿色；XLD培养基培养沙门氏菌菌落可以呈黑色

呈粉红色带黑色中心、黄色；HE培养基培养沙门氏菌菌落可以呈蓝色、蓝绿色或黄色，只有CAS培养基能够清晰简单的将沙门氏菌的菌落分离出来。综上所述，显色培养基CAS在分离食品中的沙门氏菌过程中具有良好的特异性和敏感性，检测效果比BS、XLD、HE培养基要好。在实际的检测过程中，尤其是大批量的样品检测中，应灵活运用选择合适的培养基，减少漏检。

显色培养基成品由于其使用方便，灵敏度高，使其成为微生物快速检测新技术最有潜力的方向之一，但是其也面临很多问题，尤其是培养基质量方面。由于显色培养基的强大需求量，培养基市场上有很多厂家生产，质量优劣存在差异，实用性也有所不同，所以在选购培养基时，一定要对其质量进行验证，建立起自己实验室的一套工作程序，使显色培养这项技术更好地服务于实验室工作。另外，在使用选择性分离培养基进行致病性微生物检测时，应充分考虑样品的污染程度，选择合适的培养基和培养时间，从而避免漏检和假阴性检测结果的出现。

参考文献：

[1]陈茂义，胡 婕，刘建昭，等.科玛嘉显色培养基和XLD、SS、HE分离食品中沙门菌效果比较[J].公共卫生与预防医学，2008（4）：12-14.

[2]中华人民共和国卫生部.GB4789.4-2010食品安全国家标准 食品微生物学检验沙门氏菌检测[S].北京：中国国家标准出版社，2010.

[3]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.GB4789.28-2013 食品安全国家标准 食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求[S].北京：中国国家标准出版社，2013.

[4]叶梁银，昝川南.食品中沙门氏菌检测方法研究分析[J].化学工程与装备，2012（11）：181-182.

[5]姚大伟，江 芸，徐幸莲，等.生鲜猪肉中沙门氏菌的分离、鉴定及耐药性检测[J].食品科学，2012，3（24）：210-214.

作者简介：黄耀雄（1989—），男，助理工程师；专业方向为食品微生物检验工作。