一种针对非洲猪瘟病毒的核酸快速检测方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 109295255 A(43)申请公布日 2019.02.01

(21)申请号 2018110869.4(22)申请日 2018.09.18

(71)申请人 张薇

地址 650000 云南省昆明市盘龙区金殿青

龙山省畜牧兽医研究所宿舍34栋1单元5号(72)发明人 张薇　许绍坤　王耕　吴丹丹　

李向东　田克恭　(74)专利代理机构 北京久维律师事务所 11582

代理人 邢江峰(51)Int.Cl.

C12Q 1/70(2006.01)C12Q 1/686(2018.01)C12N 15/11(2006.01)

权利要求书1页 说明书4页 附图2页

CN 109295255 A()发明名称

一种针对非洲猪瘟病毒的核酸快速检测方法

(57)摘要

本发明公开了一种针对非洲猪瘟病毒的核

包括如下检测方法：材料准备，酸快速检测方法，

引物稀释，扩增反应，扩增曲线和溶解曲线获得，判定；本发明的有益效果是：高特异性：6条引物对应目标序列8个特异区域的识别保证了检测反应的高度特异性；高灵敏度：检测反应的灵敏度高，可检测到10个拷贝；操作简单：只要将待测样本、设计的特异引物和反应液混合，上机扩增30分钟即可得到检测结果；使用一个反应管即可检测出样本是否感染了非洲猪瘟病毒，填补了非洲猪瘟核酸快速检测方法的空缺；试剂盒可用于多个检测平台上，不仅可以用在基因快速检测仪和定量PCR仪，也可以用在其他可以提供恒定温度的设备上如金属浴等。

CN 109295255 A

权　利　要　求　书

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1.一种针对非洲猪瘟病毒的核酸快速检测方法，其特征在于，包括如下检测方法：步骤一：材料准备：检测猪是否感染非洲猪瘟的快速扩增引物组，引物组包括：引物1和2干粉、引物3和4干粉、引物5和6干粉，各1OD；反应液组成：反应浓缩液(DNA聚合酶，Buffer，dNTP，MgSO4，Betain，荧光染料)；构建完成的非洲猪瘟病毒pUC-ASF质粒样本；阴性对照组：不含目的基因反应液；

步骤二：引物稀释：将试剂盒中引物1和2稀释成40uM,引物3和4稀释成5uM,引物5和6稀释成20uM；

步骤三：扩增反应：反应浓缩液15ul、引物组6ul,模本、构建的标准质粒DNA1ul，无菌无核酸酶水3ul；

步骤四：扩增曲线和溶解曲线获得：将步骤三中的反应液混匀，放入定量PCR仪，设置60个循环，循环完成后获得扩增曲线和溶解曲线；或者基因快速检测系统中，65℃、30分钟，获得扩增曲线和溶解曲线；

步骤五：判定：根据步骤四所获得扩增曲线和溶解曲线进行判定。

2.根据权利要求1所述的一种针对非洲猪瘟病毒的核酸快速检测方法，其特征在于：所述

引物1：AACGTTGCCAACGTAGTGGATCTGCTCACGATGCCAATCTCATC；引物2：CTTGGAGCGATGATGATTATGCCTATGACCGAAGGATTG；引物3：ATGGCATACTCATCCATCGATG；引物4：AAGGCTCTTGCTGTTGATACC；引物5：AAGCTGTAAGCTCTGCAGGACT；引物6：CTGGGTAGCCACGGAAGGA。

3.根据权利要求1所述的一种针对非洲猪瘟病毒的核酸快速检测方法，其特征在于：所述引物设计根据P72片段，使用Primer Designer软件设计引物组。

4.根据权利要求1所述的一种针对非洲猪瘟病毒的核酸快速检测方法，其特征在于：所述步骤四中，反应液混匀，放入定量PCR仪，设置65℃、30s/循环60个循环。

5.根据权利要求1所述的一种针对非洲猪瘟病毒的核酸快速检测方法，其特征在于：所述步骤五中，根据所获得扩增曲线和溶解曲线进行判定，扩增曲线有明显的“S”型曲线，以及溶解曲线峰型单一且较为尖锐，则判定为阳性结果；扩增曲线没有出现明显“S”型曲线，则判定为阴性结果；扩增曲线有明显“S”型曲线，但溶解曲线峰型不单一判定为非特异性扩增；阴性对照组的检测结果是阴性结果，则是本次实验有效，否则本次实验无效。

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说　明　书

一种针对非洲猪瘟病毒的核酸快速检测方法

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技术领域

[0001]本发明属于生物学技术领域，具体涉及一种针对非洲猪瘟病毒的核酸快速检测方法。

背景技术

[0002]非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的猪的一种烈性、高度接触性传染病。ASF具有高发病率、高死亡率等特点，一旦发生，经济损失巨大；目前缺乏有效疫苗和特异性治疗手段，使ASF成为目前危害养猪业的最严重疫病之一。

[0003]ASFV是非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)非洲猪瘟病毒属(Asfi virus)唯一成员，病毒有些特性类似虹彩病毒科和痘病毒科；病毒粒子的直径为175－215纳米，呈20面体对称，有囊膜。基因组为双股线状DNA，大小170－190kb。在猪体内，非洲猪瘟病毒可在几种类型的细胞浆中增殖，尤其是网状内皮细胞和单核巨噬细胞中复制。该病毒可在钝缘蜱中增殖，并使其成为主要的传播媒介。目前对ASF的控制只能依赖于实验室的快速诊断、对发病动物的捕杀，以及采取有效的检疫措施和严格的卫生措施。[0004]目前，ASFV在我国首次爆发，国内多个地区流行，疫情持续扩大。ASFV在我国缺乏有效疫苗和快速病原检测技术，是疫情准确监测和控制存在的重要问题。因此，利用新型病原学检测技术，建立快速检测方法用于ASFV病原快速鉴定是有效、精准防控疫情的技术关键。

发明内容

[0005]本发明的目的在于提供一种针对非洲猪瘟病毒的核酸快速检测方法，以解决上述背景技术中提出的ASFV在我国缺乏有效疫苗和快速病原检测技术，是疫情准确监测和控制存在的重要问题，克服现有技术的不足，提供一种基于核酸的快速、准确、灵敏的方法检测猪群是否感染非洲猪瘟病毒的引物组，以及应用上述引物组的核酸快速检测方法。[0006]为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种针对非洲猪瘟病毒的核酸快速检测方法，包括如下检测方法：[0007]步骤一：材料准备：检测猪是否感染非洲猪瘟的快速扩增引物组，引物组包括：引物1和2干粉、引物3和4干粉、引物5和6干粉，各1OD；反应液组成：反应浓缩液(DNA聚合酶，Buffer，dNTP，MgSO4，Betain，荧光染料)；构建完成的非洲猪瘟病毒pUC-ASF质粒样本；阴性对照组：不含目的基因反应液；[0008]步骤二：引物稀释：将试剂盒中引物1和2稀释成40uM,引物3和4稀释成5uM,引物5和6稀释成20uM；[0009]步骤三：扩增反应：反应浓缩液15ul、引物组6ul,模本、构建的标准质粒DNA1ul，无菌无核酸酶水3ul；[0010]步骤四：扩增曲线和溶解曲线获得：将步骤三中的反应液混匀，放入定量PCR仪，设

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置60个循环，循环完成后获得扩增曲线和溶解曲线；或者基因快速检测系统中，65℃、30分钟，获得扩增曲线和溶解曲线；[0011]步骤五：判定：根据步骤四所获得扩增曲线和溶解曲线进行判定。[0012]作为本发明的一种优选的技术方案，所述[0013]引物1：AACGTTGCCAACGTAGTGGATCTGCTCACGATGCCAATCTCATC；[0014]引物2：CTTGGAGCGATGATGATTATGCCTATGACCGAAGGATTG；[0015]引物3：ATGGCATACTCATCCATCGATG；[0016]引物4：AAGGCTCTTGCTGTTGATACC；[0017]引物5：AAGCTGTAAGCTCTGCAGGACT；[0018]引物6：CTGGGTAGCCACGGAAGGA。

[0019]作为本发明的一种优选的技术方案，所述引物设计根据P72片段，使用Primer Designer软件设计引物组。

[0020]作为本发明的一种优选的技术方案，所述步骤四中，反应液混匀，放入定量PCR仪，设置65℃、30s/循环60个循环。

[0021]作为本发明的一种优选的技术方案，所述步骤五中，根据所获得扩增曲线和溶解曲线进行判定，扩增曲线有明显的“S”型曲线，以及溶解曲线峰型单一且较为尖锐，则判定为阳性结果；扩增曲线没有出现明显“S”型曲线，则判定为阴性结果；扩增曲线有明显“S”型曲线，但溶解曲线峰型不单一判定为非特异性扩增；阴性对照组的检测结果是阴性结果，则是本次实验有效，否则本次实验无效。[0022]与现有技术相比，本发明的有益效果是：[0023](1)高特异性：6条引物对应目标序列8个特异区域的识别保证了检测反应的高度特异性；[0024](2)高灵敏度：检测反应的灵敏度高，可检测到10个拷贝；[0025](3)操作简单：只要将待测样本、设计的特异引物和反应液混合，上机扩增30分钟即可得到检测结果；[0026](4)使用一个反应管即可检测出样本是否感染了非洲猪瘟病毒，填补了非洲猪瘟核酸快速检测方法的空缺；[0027](2)非洲猪瘟病毒核酸快速扩增检测试剂盒使用了嵌入式的荧光染料，在定量PCR仪或专门的基因快速检测仪上反应，实现了实时监控过程，并且可以针对扩增产物做溶解曲线分析，针对产物进行特异性的分析；[0028](6)试剂盒可用于多个检测平台上，不仅可以用在基因快速检测仪和定量PCR仪，也可以用在其他可以提供恒定温度的设备上如金属浴等。

附图说明

[0029]图1为本发明的结构示意图；

[0030]图2为本发明的使用非洲猪瘟病毒质粒样本为模板，分别使用引物组扩增检测获得ASFV扩增曲线图；

[0031]图3为本发明的使用非洲猪瘟病毒质粒样本为模板，分别使用引物组扩增检测获得ASFV溶解曲线图；

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具体实施方式

[0032]一种针对非洲猪瘟病毒的核酸快速检测方法，包括如下检测方法：[0033]步骤一：材料准备：检测猪是否感染非洲猪瘟的快速扩增引物组，根据P72片段，使用Primer designer软件设计引物组，引物组包括：引物1和2干粉、引物3和4干粉、引物5和6干粉，各1OD，[0034]引物1：AACGTTGCCAACGTAGTGGATCTGCTCACGATGCCAATCTCATC；[0035]引物2：CTTGGAGCGATGATGATTATGCCTATGACCGAAGGATTG；[0036]引物3：ATGGCATACTCATCCATCGATG；[0037]引物4：AAGGCTCTTGCTGTTGATACC；[0038]引物5：AAGCTGTAAGCTCTGCAGGACT；[0039]引物6：CTGGGTAGCCACGGAAGGA；6条引物对应目标序列8个特异区域的识别保证检测反应的高度特异性；反应液组成：反应浓缩液(DNA聚合酶，Buffer，dNTP，MgSO4，Betain，嵌入式荧光染料)；构建完成的非洲猪瘟病毒pUC-ASF质粒样本；阴性对照组：不含目的基因反应液；

[0040]步骤二：引物稀释：将试剂盒中引物1和2稀释成40uM,引物3和4稀释成5nM,引物5和6稀释成20uM；[0041]步骤三：扩增反应：扩增总体系25ul，包括反应浓缩液15ul、引物组6ul,反应样本1ul，无菌无核酸酶水3ul；[0042]步骤四：扩增曲线和溶解曲线获得：将步骤三中的反应液混匀，放入定量PCR仪，设置65℃、30s/循环60个循环，循环完成后获得扩增曲线和溶解曲线；或者基因快速检测系统中，65℃、30分钟，获得扩增曲线和溶解曲线；[0043]步骤五：判定：根据步骤四所获得扩增曲线和溶解曲线进行判定，扩增曲线有明显的“S”型曲线，以及溶解曲线峰型单一且较为尖锐，则判定为阳性结果；扩增曲线没有出现明显“S”型曲线，则判定为阴性结果；扩增曲线有明显“S”型曲线，但溶解曲线峰型不单一判定为非特异性扩增；阴性对照组的检测结果是阴性结果，则是本次实验有效，否则本次实验无效；[0044]引物组及反应体系灵敏度实验：

[0045]将构建的非洲猪瘟病毒质粒10倍稀释成100、101、102、103、104、105个拷贝每微升，使用步骤三、步骤四和步骤五中提及的体系分别进行检测。[0046]试验结果：[0047]引物组及反应体系检测：

[0048]使用非洲猪瘟病毒质粒样本为模板，分别使用引物组扩增检测的实时扩增曲线图和溶解曲线图，从图中可以清晰观测到引物组扩增曲线呈“S”型，溶解曲线峰型单一，且对照组无扩增；[0049]引物组及反应体系灵敏度实验：

[0050]将构建的非洲猪瘟病毒质粒10倍梯度稀释，分别为101、102、103、104、105、106、107个拷贝每微升，使用步骤三、步骤四和步骤五中提及的体系对每个浓度进行检测，在样品浓度为103拷贝时，依旧会产生扩增曲线，并且溶解曲线峰型单一且尖锐，说明本发明非洲猪瘟检测试剂盒灵敏度可达到103拷贝。

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说　明　书

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尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以

理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

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图1

图2

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说　明　书　附　图

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图3

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