实验3 土壤中稀有放线菌的分离、纯化

1.1 了解微生物分离和纯化的原理 1.2 掌握常用的分离纯化微生物的方法 2 原理

从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求,或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。 3 材料 3.1 培养基

淀粉琼脂培养基(高氏I号培养基)，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，马丁氏琼脂培养基，查氏琼脂培养基。 3.2 溶液或试剂

10%酚液，盛9ml无菌水的试管，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，4%水琼脂。 3.3 仪器或其它用具

无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿，链霉素和土样，显微镜，血细胞计数板、涂布器等。 4 步骤

4.1 稀释涂布平板法 4.1.1 倒平板

将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏I号琼脂培养基、马丁氏琼脂培养基加热溶化待冷至55～60℃时，高氏I号琼脂培养基中加入10%酚数滴，马丁氏培养中加入链霉素溶液(终浓度为30μg/ml)，混合均匀后分别倒平板，每种培养基倒三皿。 4.1.2 制备土壤稀释液

称取土样l0g，放入盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20min，使土样与水充分混合，将细胞分散。用一支lml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取lml(无菌操作见图-2)加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀释度的土壤溶液，注意：操作时管尖不能接触液面，每一个稀释度换一支试管。 4.1.3 涂布

将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔写上10-4、10-5和10-6三种稀度，然后用无菌吸管分别由10-4、10和10三管土壤稀释液中各吸取0.1或0.2ml，小心地滴在对应平板培养基表面中央位置。 用无菌玻璃涂棒平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿同心圆方向轻轻地向外扩展，使之分布均匀。室温下静置5～l0min，使菌液浸入培养基。 4.1.4 培养

将高氏I号培养基平板和马丁氏培养基平板倒置于28℃温室中培养3～5d，肉膏蛋白胨平板倒置于37℃温室中培养2～3d。

4.1.5 挑菌落 将培养后长出的单个菌落分别挑取少许细胞接种到上述三种培养基斜面上，分别置28℃和37℃温室培养。若发现有杂菌，需再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。 5结果

分别记录并描绘平板划线、斜面和半固体接种的微生物生长情况和培养特征。 6 思考

6.1 如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养？请写出实验的主要步骤。 6.2 为什么高氏I号培养基和马丁氏培养基中要分别加入酚和链霉素？

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6.3设计一个实验，从土壤中分离酵母菌并进行计数。