２０１３年第５期（总第１９６ 文献综述 。 。 ’。 。’。‘’‘’ 。。‘。 。 。。 ‘ｉ 文献综述 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．，．．． 伪狂犬病毒载体的研究进展 彭芸芸仲晓宁 李春蕾 （山东省烟台市动物疫病预防与控制中心２６４００３） 中图分类号：￥８５２．６５＋５ 文献标ｉ，ｑｇｑ．Ａ 文章编号：１００７－１７３３（２０１３）０５－００７５－０２ 猪伪狂犬病（ＰＲ）是由猪伪狂犬病毒（ＰＲ、，）引起的急性 并且保留了其相应的抗原性、免疫原性及功能。 传染病，每年给养猪业造成巨大的经济损失【】】。基因工程 ３重组伪狂犬病毒的构建 疫苗对该病的预防起到了十分重要的作用，通过基因工 ３．１ 构建原理 重组伪狂犬病毒的构建应分两部分进 程技术使ＰＲＶ中的毒力基因失活，但病毒粒子仍然保持较 行：第一步是构建重组质粒。此质粒应含有启动子，下 好的抗原性。重组病毒粒子作载体同目的基因一起在动 游接表达的外源基因，有时为筛选方便，还要插入有启 物体内表达不仅十分安全，还可以做到一针多防，提高 动子标记的基因￣ｔｌＬａｃＺ等，它们的两侧是伪狂犬病毒特 生产效率，在新型动物病毒载体中已显示出了良好的应 异的ＤＮＡ同源序列；第二步是将重组质粒导入伪狂犬病 用前景。本文就伪狂犬病毒载体研究进展作一综述。 毒感染的细胞中，伪狂犬病毒ＤＮＡ与重组质粒中的同源 ｌ猪伪狂犬病毒基因组结构 序列在细胞内发生同源重组，从而将外源基因装到伪狂 猪伪狂犬病毒（ＰＲＶ）属于疱疹病毒科中的猪疱疹病毒 犬病毒基因组的特定部位，构建出重组病毒。 Ｉ型。病毒基因组为线状双链ＤＮＡ，长度为１５０ｋｂ，Ｃ＋Ｏ ３．２ 筛选方法 目前最常用的方法是通过化学底物及颜 含量约为７４％，由长独特区（ＵＬ）和短独特区（ＵＳ），以及 色变化等来筛选重组病毒，即插入报告基因法，将Ｂ．半乳 ＵＳ两侧的重复序列ｆｉｒｓ）与内部重复序列（ＩＲＳ）所组成。 糖苷酶（ＬａｃＺ）基因或者抗生素基因等与外源基因同时导入 ＵＳ和ＵＬ区段，含有至少７０个基因，可编码７０－１００种蛋白 伪狂犬病毒基因组中，通过在培养液中］ＪＵＡ，Ｘｇａｌ、Ｇ４１８ 质，成熟的病毒粒子只含有约５０种蛋白质犯】。 等试剂来筛选重组病毒。 在ＰＲＶ中已发现ｌ１种糖蛋白，分别命名为ｇＢ ＩＩ）、 ３Ｉ３外源基因的表达调控结构 目前，构建重组伪狂犬 ｇｃ（ｇＩＩＩ）、ｇＤ（ｇｐ５０）、ｇＥ、ｇＧ（ｇＸ）、ｇＨ、ｇＩ（ｇｐ６３）、ｇＫ、 病毒所选用的主要是ｇＧ、ｇＥ启动子，因其结构独特且活 ｇＬ、ｇＭ和ｇＮ，它们已被定位和测序【 。病毒增殖的必需 性较强。一般说来，启动子序列距外源基因起始密码子 的糖蛋自主要有ｇＢ、ｇＤ、ｇＨ、ｇＬ、ｇＫ：非必需糖蛋白是 越近时表达效果越好。 决定毒力因素的因子，主要有ｇＥ、ｇｌ、ｇＧ、ｇＣ、ｇＭ、ｇＮ ３．４构建重组病毒注意事项 复制非必需区ＴＫ、ｇＧ、ｇＥ 等，除ｇＧ外均为成熟病毒粒子的结构成分，ｇＧ常存在于 基因是目前应用较多的同源序列。再者，还必须做好亲 感染细胞分泌物中【４Ｊ。 本病毒株的选择，它应该是目前常规使用的疫苗株，从 ２伪狂犬病毒表达载体的优越性 而才能够不引起宿主发病；再就是考虑其亲本株的宿主 基因组庞大，含有多个复制非必需区，其容量可高 特异性，以对其它动物不构成威胁为前提。最后还要考 达４０Ｋｂ，可在其感染的细胞中忠实的进行修饰，外源基 虑到它所诱导的保护性免疫应答的类型，是全身性免疫 因的表达产物可以诱导机体产生持续时间较长的体液与 应答还是局部的黏膜免疫应答。 细胞免疫反应。除此之外，伪狂犬病毒的宿主范围较 ４猪伪狂犬病毒载体的研究进展 大，能感染多种动物和野生动物，这就为一苗多用打下 ４．１ ＰＲＶ载体的构建 目前，ＰＲＶ基因缺失疫苗株常常 了很好的基础。最为重要的是在重组伪狂犬病毒中所表 是通过缺失ｇＥ、ｇＩ、ｇＧ、ｇＣ、ＴＫ等非必需基因，缺失分 达的蛋白质可以进行翻译后加工、修饰，其中许多过程 为单基因缺失和多基因缺失。 （１）第ｌ代基因缺失疫苗 与体内相类似，因此表达产物具有天然蛋白质的活性， 株。第ｌ代基因缺失疫苗是指缺失ＰＲＶ ＴＫ基因的疫苗， 况，在适宜的时期进行鹿群预防接种。疫苗的接种方法、 用的药物一定要有针对性和安全性。预防接种或使用药物 剂量和注意事项要按照疫苗说明书严格执行。而有些疾病 后，应注意观察鹿群表现，发现异常及时进行诊治。 尚无疫苗可以预防，使用药物预防也是很好的办法，但使 （收稿日期：２０１３－０３－２１） ７５ 山东畜牧兽医 世界上第１个获得批准使用的基因弱毒疫苗就是伪狂犬的 ＴＫ缺失疫苗株ＢＵＫ２ｄｌ３［ ，该病毒株通过基因工程技术 在ＴＫ基因引入缺失，在细胞培养上不能回复为ＴＫ＋，对 猪不仅没有毒力而且具有较好的免疫原性。（２）第２代 基因缺失疫苗株。第２代基因缺失疫苗以缺失ＴＫ基因为基 础，进而缺失编码非必需糖蛋白ｇＥ、ｇＩ、ｇＧ、ｇＣ等基 因，使该疫苗免疫的动物不能产生相应的抗体，有利于 通过血清学方法区分强毒感染猪和疫苗免疫猪，这也是 其最显著的特点，因此该种疫苗又被称为标记疫苗网，从 而为净化和根除伪狂犬病提供了有力的工具。ＴＫ－／ｇＣ．疫 苗株：１９８７年Ｋｉｔｓ等【７１报道在ＰＲＶＢＵＫ２ｄｌ３株的基础上通 过缺失ｇＣ基因ＳａｌＩ片段的ｌ１００ｂｐ构建出了缺失ＴＫ、ｇＣ基 因的ＰＲＶｄｌｇＣ／ｄｌＴＫ株。ＴＫ．／ｇＥ．疫苗株：该疫苗株是从 ＮＩＡ２３和ＮＩＡ２４发展而来的。首先将无毒株ＮＩＡ２４株基因 组的ＨｉｎｄｌＩＩ片断与野毒株ＮＩＡ２３基因组的被引入缺失 ＨｉｎｄｌＩＩＢ片断共转染ＰＫ２２细胞，病变后，空斑筛选病毒， 然后将其基因组与一个ＴＫ基因的ＥｃｏＲＩ位点引入有ＥｃｏＲＩ 接头的质粒共转染ＰＫ２２细胞，在ＢｒｄＵ存在下筛选在ＴＫ基 因含有ＥｃｏＲＩ位点的重组病毒。将此重组病毒的基因组用 ＥｃｏＲＩ完全酶切后共转染ＰＫ２２细胞，即得到重组病毒ＴＫ． ／ｇＥ．即“７８３”１ １。 在国内，郭万柱教授率先系统地开展了伪狂犬病病 毒（ＰＲｖ１分子生物学研究【９】，首次构建了ＰＲＶＦａ株ＴＫ基因 缺失株，ＰＲＶＦａｇＩ・／ｇＩ－基因缺失株，ＰＲＶＦａｇｌ－／ｇｔ－／ＬａｃＺ＋ 基因缺失株，又将构建的ＰＰ６３１ａｃＺ转移载体质粒与ＰＲＶＦａ ＤＮＡ经磷酸钙转染，在ＭＤＢＫ细胞内同源重组获得 ＰＲＶＦａｇＥ．／ｇＩ．／ＴＫ－／ＬａｃＺ＋三基因缺失疫苗株（ＰＲＶ２ＳＡ ２１５），ＰＲＶ２ＳＡ２１５是我国首次成功研制出的ＦａｇＥ－／ｇＩ－／ＴＫ－ ／ＬａｃＺ＋＝基因缺失疫苗株，填补了我国在这一领域的空 缺。 ４．２外源基因在载体中的表达徐高原１ｍ】构建了表达乙 型脑炎病毒ＮＳｌ基因的重组ＰＲＶＴＫ－／ｇＧ．／ＬａｃＺ＋／ＮＳ１株， 经检测，重组病毒能表达具有生物活性的ＮＳ１蛋白，该重 组病毒有望作为猪乙型脑炎和伪狂犬病双价基因工程疫 苗。范伟兴等ｆＪ’】在ＰＲＶ疫苗Ｂａｒｔｈａ株的ＴＫ基因中插入增 强绿色荧光蛋白（ＥＧＦＰ）的整个表达盒，又将猪瘟病毒的 Ｅ２基因插入到ＥＧＦＰ基因的多克隆位点区，经ＢＩＪ１ Ｒ筛选 到了融合表达ＥＧＦＰ和ＣＳＦＶＥ２基因的重组病毒 ＴＫＰＲＶｒＧＥ２，免疫接种试验在猪体内可以产生抗ＰＲＶ和 ＣＳ２ＦＶ的抗体。ＱｉａｎＰ￣ｔ 】将ｇＧ启动子控制下的口蹄疫病 毒（ＦＭＤＶ）的ＶＰ１基因插入ＰＲＶ基因组中的ｇＧ基因的Ｎ端 下游，得到重组病毒ＰＲＶ２ＶＰｌ。周国辉【”ｌ￣＿ｇＥ．表型 的ＰＲＶ经典弱毒疫苗Ｂａｒｔｈａ２Ｋ６１株为载体，构建了表达 Ｈ３Ｎ２亚型ＳＩＶＨＡ基因的重组ＰＲＶ。罗燕等【ｌ 】成功地构建 ７６ ２０１３年第３４卷 了含绿色荧光蛋白基因的猪细小病毒．伪狂犬重组病毒， 为研制猪细小病毒－伪狂犬病重组疫苗创造了条件。这些 工作极大地推动了伪狂犬病毒在基因工程载体方面的研 究。 参考文献 【ｌ】殷震，刘景华．动物病毒学【Ｍ】．第２版．北京：科学出版社，１９９７． 【２】ＬＡＤＩＮＢＦ，ＩＨＡＲＡＳ，ＨＡＭＰＬＨ，ｅｔａ１．Ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｈｅｒｅｐｓｖｉｒｕｓ ｅａｐｓｉｄｓ：ａｎａｎａｌｙｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ＤＮＡ＋ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ２ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｕｔａｎｔｓｏｆｐｓｅｕｄｏ ｒａｂｉｅｓｖｉｍｓ［Ｊ１．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９８２。１１６：５４４－５６１． 【３】ＲＥＡＴＪ。ＴＩＭＭＩＮＳＪＧ，ＬＯＮＧＷ，ｅｔａ１．Ｍａｐｐｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｓｅｕｄｏ ｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ ｇｌｙｅｏｐｍｔｅｉｎ ｗｈｉｃｈ ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅｄｉｕｍ ｏｆｉｎｆｅｃｔｅｄ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＪＶｉｒｏｌ，１９８５，５４（１）：２１—２９． 【４】ＰＥＮＳＡＥＲＴＭ，ＧＩＥＬＫＥＮＳＡＬＪ，ＬＯＭＮＩＣＺＩＢ，ｅｔａ１．Ｒｏｕｎｄ ｔａｂｌｅ ｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ａｕｊｅｓｚｋｙ’Ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｖａｃｅｉｎｅｄ ｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ［Ｊ］．Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９２，３３：５３－６７． 【５】ＫＩＴＳ，ＫＩＴＭ，ＰＩＲＴＬＥＥＣ．Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ２ ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔ ｏｆｐｓｅｕｄｏ ｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ【Ｊ１．ＡｍＪＶｅｔＲｅｓ，１９８５，４６： Ｉ３５９．１３６７． ［６１ ＶＡＮＺＩＪＩＭ，ＷＥＮＳＶＯＯＲＴＧ，ＤＥＫＬＵＹＶＥＲＥ，ｅｔａ１．Ｌｉｖｅ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ＰＲＶｅｘ２ Ｐｒｅｓｓｉｎｇ ｅｎｖｅｌｏｐｅｇｌｙ ｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｌｏｆｈｏｇｃｈｏｌｅｍ［Ｊ］．Ｖｉｒｏｌ，１９９１， ６５：２７６１－２７６５． 【７】ＫＩＴＳ，ＳＨＥＰＰＡＲＤＭ，ＩＣＨＩＭＵＲＡＨ，ｅｔａ１．Ｓｅｃｏｎｄ ２ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｐｓｅｕｄｏ ｒａｂｉｅｓ Ｖｉｅｒｓ ｖａｃｃｉｎｅ ｗｉｈｔ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓｉｎ ｈｔｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ａｎｄ ｇｌｙｃｏｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅｓ［Ｊ］．Ａｍ ＶｅｔＲｅｓ，１９８７。４８：７８０・７９３． 【８】 Ｖ＾ＮＯＩＲＳＣＨＯ仉 ＧＩＥＬｌ（１ ＳＡＵ， ＭＯＯＭＡＮＮｌＵＭ， ｅｔａ１． Ｍａｒｋｅｒｖａｃ２ ｃｉｎｅｓ，ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ２ ｓｐｅｃｉｉｆｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｓｓａｙｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆＡｕｊｅｓｚｋｙ’ｓｄｉｓ ｅａｓｅ［Ｊ］．ＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９０，２３：８５－１０１． 【９】郭万柱．伪狂犬基因缺失疫苗的研究进展【Ｊ】．西南农业学报， １９９９（１２）：５７—６３． 【ｌＯ】徐高原．乙型脑炎病毒Ｎｓ１基因重组伪狂犬病毒的构建【Ｊ】．畜牧 兽医学报，２００４。３５【２）：１９２・１９７． ［１ｌ】范伟兴，张雪莲，魏荣等．含绿色荧光蛋白基因和猪瘟Ｅ２基因的 伪狂犬病毒Ｂａｒｔｈａ２ｋ６１株ＴＫ基因缺失转移载体的构烈Ｊ】．中国兽医杂 志。２００３，３９（３）：３－７． 【１２】ＱＩＡＮＰ，ＬＩＸＭ，Ｊ１ＮＭＬ，ｅｔａ１．Ａｎａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ａ ＦＭＤ ｖａｃｃｉｎｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｃ２Ｎｅｔｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｐｓｅｕｄｏｍｂｉｅｓ ｖｉｅｒｓ：ｏｎｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｕｓｉｎｇＶＰＩＧｅｎｅａｌ ｏｎｅ ｇｅｎｅｒａｔｅｓ ａｌｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｄｓｏｎ ＦＭＤ ｎａｄ ｐｓｅｕｄｏ ｒａｂｉｅｓｉｎ ｓｗｉｎｅ［Ｊ］．Ｖａｃｃｉｎｅ，２００４，２２（１７／１８）：２１２９・２１３６． 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