・３０８・ 中华老年心脑血管病杂志２ｏ１ ７年３月第１９卷第３期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｇｅｒｉａｔｒ Ｈｅａｒｔ ＢｒａｉｎＶｅｓｓｅｌＤｉｓ，Ｍａｒ ２０１ ７，Ｖｏｌ１９，Ｎｏ・３ 基础研究． 电针脑缺血大鼠水沟穴调节微小ＲＮＡ一３ ２ ８ 促进血管新生的机制研究 靳兰洁，李莎莎，周璇，舒适，尤艳利，钱小路，袁影，周爽 摘要：目的 观察电针脑缺血大鼠水沟穴对缺血半暗带区血管新生及微小ＲＮＡ（ｍｉＲ一３２８）、ＣＤ４４ｍＲＮＡ和蛋白表 达的影响，探讨电针脑缺血大鼠水沟穴调节ｍｉＲ一３２８促血管新生的机制。方法 ｓＤ雄性大鼠８Ｏ只，随机分为正 常组、假手术组、模型组、电针组，每组各５只。Ｌｏｎｇａ法评估各组大鼠神经功能缺损，免疫组织化学染色法观察 ＣＤ３４变化，实时荧光定量ＰＣＲ技术检测ｍｉＲ一３２８、ＣＤ４４ ｍＲＮＡ表达水平，Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ技术Ｉｋ￣＇１ ＣＤ４４蛋白表达 水平。结果 假手术组与正常组大鼠在神经功能缺损、ＣＤ３４为标记的血管新生、ｍｉＲ一３２８和ＣＤ４４表达无差异 （Ｐ＞Ｏ．０５）。与假手术组比较，模型组神经功能缺损、血管新生、ｍｉＲ一３２８、ＣＤ４４表达明显增加（Ｐ＜Ｏ．０１）；与模型 组比较，电针刺组神经功能缺损程度改善Ｕ２．６±０．６）分ｖｓ（３．４＋－０．６）分，Ｐ％０．Ｏ１］，血管新生增加显著［（８Ｏ．４Ｏ± ３．８５） ｓ（６７．６Ｏ±２．７９）分，Ｐ％０．０１］，ｍｉＲ一３２８ １．２２士０．３７ ｖｓ ２．Ｏ２±０．２２和ＣＤ４４ ｍＲＮＡ ４．３５±１．３３ ｖｓ ７．１６± １．８３，ＣＤ４４蛋白０．４２４－＿０．０４ ｓ ０．５５±０．０６表达降低（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１）。结论 电针水沟穴可通过调节 ｍｉＲ－３２８．ｇ￣靶基因ＣＤ４４表达水平，促进缺血半暗带区的血管新生。 关键词：脑缺血；电针；微ＲＮＡｓ；穴，水沟 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｓｈｕｉｇｏｕ（Ｄｕ ２６）ｏｎ ｍｉＲ－３２８一 ｒａｔｓ ｗｉｔｈ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ＪＩＮ Ｌａｎ—ｊｉｅ，ＬＩ Ｓｈａ—ｓｈａ，ＺＨＯＵ Ｘｕａｎ，ｅｔ ａｌ （Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｈａｎｇｈａｉ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２００４３３，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌａｌ ａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｓｈｕｉｇｏｕ（Ｄｕ ２６）ｏｎ ａｎｇｉｏ— ｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｉＲ一３２８。ＣＤ４４ ｍＲＮＡ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｒａｔｓ ｗｉｔｈ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ．Ｍｅｔｈ— ｏｄｓ Ｅｉｇｈｔｙ ＳＤ ｍａｌｅ ｒａｔｓ ｗｅｒｅ ｒａｎｄｏｍｌｙ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ｎｏｒｍｏｌ ｇｒｏｕｐ，ｓｈａｍ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ，ｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅ ｇｒｏｕｐ（２０ ｉｎ ｅａｃｈ ｇｒｏｕｐ）．Ｔｈｅｉｒ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｗａｓ ａｓ— ｓｅｓｓｅｄ ｂｙ Ｌｏｎｇａ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ．ｔｈｅｉｒ ＣＤ３４ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｗｉｔｈ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ．Ｅｘｐｒｅｓ— ｓｉｏｎｓ ｏｆ ｍｉＲ一３２８．ＣＤ４４ ｍＲＮＡ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ＲＴ—ＰＣＲ ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ｒｅｓｐｅｃ— ｔｉｖｅｌｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｓｃｏｒｅｓ，ｔｈｅ ｍｉＲ一３２８ ａｎｄ ＣＤ４４ ｍＲＮＡ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｉｎ ｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐ ｔｈａｎ ｉｎ ｓｈａｍ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０１）．Ｔｈｅ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｓｃｏｒｅｓ ａｎｄ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｍｉＲ一３２８，ＣＤ４４ ｍＲＮＡ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｌｏｗｅｒ ｉｎ ｅｌｅｃ— ｔｒｉｃａｌ ａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅ ｇｒｏｕｐ ｔｈａｎ ｉｎ ｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐ（２．６±０．６ ｖｓ ３．４４－０．６，Ｐ％０．０１；８Ｏ．４０±３．８５－ｕｓ ６７．６０±２．７９，Ｐ＜０．０１；１．２２－－＋－０．３７＂ｕｓ ２．０２ ４－＿０．２２，４．３５－＋－１．３３＂ｕｓ ７．１６±１．８３，０．４２－－＿０．０４＂＋－ｕｓ ０．５５＿－４－００６，Ｐ％０．０５，Ｐ＜０．０１）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌａ１ ａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｓｈｕｉｇｏｕ（Ｄｕ ２６）ｓｔｉｍｕ— ．ｌａｔｅｓ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｒａｔｓ ｗｉｔｈ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ ｂｙ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｉＲ一３２８ ａｎｄ ＣＤ４４ ｍＲＮＡ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｂｒａｉｎ ｉｓｃｈｅｍｉａ；ｅ１ｅｃｔｒｏａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅ；ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ；ＰＣｌＩＮＴ ＧＶ２６（ＳＨＵＩＧＯＵ） ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００９ ０１２６．２０１７．０３．０２１ 基金项目：国家自然科学基金（８１１７３３３０，８１５０３６４７） 脑缺血占全部脑卒中的６ｏ ～８０％，是最常见 的脑卒中类型，临床处理强调早期诊断、早期治疗、 早期康复和早期预防再发 。研究发现，在脑缺血 作者单位：２００４３３上海，第二军医大学长海医院中医系（靳兰洁现为 在读硕士研究生） 通信作者：周爽，Ｅ—ｍａｉｌ：ｚｈｏｕｓｈｕａｎｇ８［）（）８＠１６３．ｃｏｒｎ 中华老年心脑血管病杂志２０１ ７年３月第１９卷第３期Ｃｈｉｎｊ ＧｅｒｉａｔｒＨｅａｒｔＢｒａｉｎＶｅｓｓｅｌＤｉｓ，Ｍａｒ ２０１ ７，Ｖｏｌ１９，Ｎｏ．３ 早期，缺血中心血流剧减或中断，神经细胞以坏死为 主，而在缺血半暗带区，即缺血中心的周边，神经细 胞仍有活力，后续死亡以凋亡为主Ｌ２］。因此，尽早恢 复缺血半暗带区的血供，促进血管新生，挽救濒死的 记的血管新生的数量。 １．４实时荧光定量ＰＣＲ检测缺血皮质区ｍｉＲ一３２８ 及ＣＤ４４ ｍＲＮＡ表达水平Ｔｒｉｚｏｌ法提取脑组织中 总ＲＮＡ，ｍｉＲ一３２８逆转录试剂盒、内参为Ｕ６。引物 序列：ｍｉＲ一３２８上游引物：５ 一ＣＵＧＧＣＣＣＵＣＵＣ— ＵＧＣＣＣＵＵＣＣＧＵ一３ ，下游引物：５，－ＧＧＧＧＧＧＣＡ— ＧＧＡＧＧＧＧＣＵＣＡ一３ 。反应条件：３７℃６０ ｍｉｎ， 神经元，是目前治疗脑缺血的重要手段。近年研究 发现，微小ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）与血管疾病密切相关，在 血管疾病的诊断和预后中扮演者重要角色［３ ］。 ｍｉＲ－３２８对血管新生起抑制作用［５］。本实验探讨电 针水沟穴调节ｍｉＲ一３２８及靶基因ＣＤ４４表达变化， ９５。Ｃ ５ ｒａｉｎ，一２０℃保存。反应条件：９５℃１５ ｒａｉｎ 预变性，９４℃１５ Ｓ，５５℃３０ Ｓ，７０。Ｃ ３０ Ｓ，４０个循环。 促进血管新生，从而减轻神经缺损程度，为脑缺血疾 病提供实验依据。 １材料与方法 １．１ 实验动物与分组 健康雄性ＳＤ大鼠８０只， ＳＰＦ级，体质量（２５０±２０）ｇ，由第二军医大学实验 动物中心提供，合格证号：ＳＹＸＫ（沪）２０１２—０００３。 随机分为正常组、假手术组、模型组、电针组，每组５ 只。均取缺血７２ ｈ的大鼠为观察对象。 １．２造模及神经功能评分 模型组和电针组参照 改良的Ｌｏｎｇａ等［６ 制作大鼠局灶性永久性大脑中 动脉闭塞模型（ＭＣＡＯ）。假手术组仅暴露动脉，不 插入线栓，其余同模型组。正常组不做任何特殊处 理。造模大鼠麻醉清醒后，参考Ｌｏｎｇａ等［６］５分法 进行神经功能缺损评分，即０分，无神经损伤症状；１ 分，不能完全伸展左侧前爪（轻度）；２分，向左侧旋 转（中度）；３分，行走时向左侧倾倒（重度）；４分，不 能自发行走，意识昏迷。采取双盲法，由实验员在不 知大鼠分组的情况下评分，将１～３分大鼠入组，不 符合入组标准大鼠则排除。 电针组参照华兴邦等的《实验动物穴位图谱》选 取水沟穴进行电针治疗。水沟穴位于大鼠唇裂鼻尖 下１ ｍｍ正中，向上斜刺１ ｍｍ，负极接水沟穴，正极 接右耳根部皮肤。针具：无锡佳健牌３０号毫针。电 针仪：Ｇ６８０５一ＩＩ电针治疗仪，疏密波，频率４／２０ Ｈｚ， 电流强度１～３ ｍＡ，电压１～３ Ｖ，时间３Ｏ ｍｉｎ。 １．３免疫组织化学染色观察ＣＤ３４标记的血管新 生表达迅速断头取全脑。置于４ 多聚甲醛固定 １２￣２４ ｈ，石蜡包埋。石蜡切片脱蜡至水，ＰＢＳ冲 洗，ＥＤＴＡ缓冲液修复，ＰＢＳ冲洗，切片放入３ 过 氧化氢溶液，室温孵育１０ ｒａｉｎ，５ ＢＳＡ封闭２Ｏ ｍｉｎ，加ＣＤ３４一抗（１：１００），４℃过夜，ＰＢＳ冲洗，加 二抗（１：５００），４℃孵育５０ ｒａｉｎ，加适度的ＤＡＢ溶 液，苏木精对比染色，脱水，透明，封固。光镜下（× ２００）观察血管新生，取３个“热点”，即３个血管表达 最多的视野，软件Ｉｍａｇｅｐｒｏ－ｐｌｕｓ６统计ＣＤ３４为标 ＣＤ４４ ｍＲＮＡ逆转录试剂盒，内参为３一磷酸甘油醛 脱氢酶（ＧＡＰＤＨ）。引物由上海生物工程有限公司 提供。引物序列：ＣＤ４４ ｍＲＮＡ上游引物：５ 一 ＴＧＡＧＧＡＴＧＴＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＴ一３ ，下游引物：５ 一 ＴＣＣＣＡＡＴＡＡＡＧＡＡＧＧＣＧＴＣＡ一３ ，ＧＡＰＤＨ 上 游引物：５，＿ＣＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＣＡＧＧＡ一３ ，下 游引物：５ 一ＣＡＴＣＧＣＣＣＣＡＣＴＴＧＡＴＴＴＴＧ一３ 。反 应条件：３７℃１５ ｒａｉｎ逆转录，８５℃５ Ｓ使逆转录酶 失活，一２Ｏ。Ｃ保存。以逆转录产物为模板进行实时 荧光定量ＰＣＲ扩增，所有操作均在冰上进行，反应 条件：９５℃３０ Ｓ预变性，９５℃１５ Ｓ，６０℃１５ Ｓ，７２。Ｃ ３０ Ｓ，３５个循环。采用２。△△ｃ 法计算相对表达水平。 １．５ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ定量测ＣＤ４４蛋白表达 取右侧 中动脉大脑皮质缺血半暗带区组织，称重，冰浴加适 量ＲＩＰＡ裂解液和苯甲基磺酰氟（１００：１），放入均 浆器，４℃离心５ ｒａｉｎ，取上清即总蛋白。ＢＣＡ蛋白 定量法检测所提蛋白浓度。配置１０ 十二烷基硫 酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶，上样２０ ｇ，恒压 （浓缩胶６Ｏ Ｖ，分离胶９０ Ｖ），电泳完毕后将蛋白转 移至聚偏氟乙烯中空纤维膜，新鲜配置５ 脱脂牛 奶的ＰＢＳ液封闭１ ｈ，然后加入ＣＤ４４兔抗鼠（１： １０００），内参Ｂ肌动蛋白（ｐ—ａｃｔｉｎ）小鼠抗鼠（１： ５０００），４℃孵育过夜，三羟甲基氨基甲烷吐温一２０ 缓冲液ＴＢＳＴ漂洗３次，孵育山羊抗兔（１：５００Ｏ）、 山羊抗鼠（１：５０００）２ ｈ，ＴＢＳＴ漂洗３次，利用显影 仪显影分析图像的灰度值。 １．６统计学方法应用ＳＰＳＳ １９．０统计软件进行 分析，计量资料以 ±Ｓ表示，单因素方差分析，方 差齐时，多重比较采用ＬＳＤ－ｔ检验，方差不齐时，采 用非参秩和检验，Ｐ＜Ｏ．０５为差异有统计学意义。 ２ 结 果 ２．１各组大鼠行为学评分 正常组和假手术组大 鼠无神经功能缺损异常，模型组和电针组大鼠有不 同程度的神经功能缺损。正常组和假手术组神经功 能缺损评分均为０分，模型组为（３．４±０．６）分、电针 纠【为（２．６ Ｉ－０．６）分。 ｊ假ｒ术 比较，梭ｊＦ，４ 人鼠 ｝ＩＩＩ 功能缺损评分 著升高，始 彳丁统汁学意义 （， ｌ （】．０Ｉ）；‘ｊ模刑ｆｌ【比较， 引纠【人鼠神绛功能缺 孔ｉ 分…！ｌ 降低，后 统¨ 、 意义（Ｐ ０．０５）。 ２．２各组大鼠右侧大脑缺血半暗带血管新生 Ｉｌ 常纠ｉ年１Ｊ似ｒ．术组大鼠彳 ４大腑Ｉｔ－动脉皮质 （＂Ｄ３４ 表达少，棋 纠ｉ和ＩＵ针绀大鼠（３）３４表达牛ｌ１埘多，与 ＩＩ 常组比较，似手术 （ Ｄ３４ １６乏达较多，ｆｌ『后肄尤统 汁 意义（，’，／０．ｏ５）； 假ｒ术绀比较．模 绀 【’Ｉ）３４农达 增』Ｊｌｌ，蓐异 统汁学盥义（Ｐ＜ ０．０】）； ｊ帧Ｊ 组比较， 针组（３）３４增『Ｊｌ ｌ多，差异 彳『统汁 、 ：意义（Ｐ＜Ｌ，０．０ｌ， ｌ～１，衷】） ① ② ③ ’． 、 ， ④ 图ｌ ｉｔ！常组 图２ 假丁术卦ｌ 图３ 模剐组 图４ 电针组 图Ｉ～４ 符－ｈ１人鼠人脯ＩＩｔ动脉皮质 Ｌ’Ｉ）：｛Ｉ＃ｊ 的微．ｎＩ 表达（箭 所，Ｊ ．微 竹或ｍ僻内皮细胞染成栋粥也） 免疫＿ｅｌ【织化 ：染色 Ａｌ｛【’ 、 ２００ 表Ｉ 行 人鼠桁怀表达水 比较（ ± Ｉ ５） 组别 ｍ铃新 （个） ｎｌ】Ｒ ３２８ 【、Ｉｊｄ ４ｎ１ＲＮＡ （７１）４４蛋白 ＩＩ 诮 组 ３７．２０±３．３５ （）．９６±（ｊ．４ ６ 】．Ｏｌ｛（）．１ ３ ０．２】±０．０３ 似ｒ术组 ３【）．（）（）±３．５４ （）．９７ （）．３０ １．０１土（）．１８ （１．２４±０．１０ Ｊ ｆｌ【 ６７．６０±２．７９ ２．０２士ｆ】．２２。 ７．】６｛１．８ （）＿５５±０．０６ ａ ｆ乜仆组 ８（）．４０士３．８５‘ １．２２上（）． ７ １． ｛５±１．３３ （）．４２±０．（）４ ２．３各组大鼠右侧大脑缺血半暗带区ｍｉＲ一３２８及 ＣＤ４４ｍＲＮＡ的表达比较 ｊ ｆｔＩ ｍｉＲ ３２８仃少量 太达， ｊ Ｊ卜常组比较。似手术 ｍｉＰ，３２８ 达九日Ｊ］ 变化，肚 尢统计 ：意义（Ｐ、 ０．（）５）； －ｊｆ ｌｒ术组 比较，模 ｍｉＲ一３２８表达水、 ＩＵ¨ 升ｆ ． 异有 统汁 、 意义（Ｐ ０．…）；与饮，Ｉ¨组比较．ＩＵ针组 ｎ ｉＲ ３２８太达水 ｛ｆＩ｝．并降低．后 统汁ｔ 意义 （ｆＪ － ：０．０ １， 】） ｉｔ 纠【Ｉ 似手术 【、Ｄ，ｔ １ ｍＲＮＡ表达比较尤 并后 （， ＞ｏ．０５）； ｊ似手术乡ｆｌ比较，模 绀ＣＤ４４ ｍＲＮＡ 达水平｝』ＩＪ 降低，篪肄有统ｉｔ 、 ：意义（Ｐ ＜ ｏ．ｏ１）；‘ｊ模型组比较，Ｉ乜针 【、Ｄ，１４ ｍＰ，ＮＡ表达水 甲升 ， 异有统汁学意义（， ｄ０．０１， １）。 ２．４ 各组大鼠右侧缺血半暗带区ＣＤ４４蛋白的表 达 Ｊ 组 似下‘术组ＣＩ）４４货Ｆｌ少；Ｉ；＝ 达，２绀 比较九统计学差婷（Ｐ＞０．０５）； ｊ假手术纰比较，模 型组ＣＩ）４４赁向｝ｐｊ Ｙｌ‘高，蓐婷钉统汁 、 意义（Ｐ ０．０１）； 模 组比较，电针纰ＣＩ）４４蛋川洚低，差 彳『统汁学意义（Ｐ＜０．０５， ５．衷１）。 １ ２ ３ ４ ’ 一 Ｂ一． ｌ １：ＩＩ 常组；２：似 术组；３：筷Ｊ ｎ；＿１：电｝ｉ 图５各组ｗｔ，ｓｔ（ ｒｎ Ｉ｝１ｏ￣定・Ｉ 榆测ＣＤ，Ｌ１ Ｉ １太达 ３ 讨 论 本实验通过缱 大鼠ＭＣＡ（）模 ，观察电针 水沟穴对肭缺ｍ大鼠缺 暗带 ｍｉＲ ３２８、 ｛；Ｉ）４４ｍＲＮＡ、ＣＩ）４４蛋白和１０ｌ－僻新生的 Ｉ／响，从而探 讨电针水沟穴通过删 ｍｉＲ一３２８促进Ｍ【、Ａ（）大鼠 缺ｍ、 带区的 箭新生机制。我们前期的实验结 果已验 ，电针水沟穴能促进腑缺 火鼠腑 内血箭 内皮 卜长Ｉ夫ｌ 的１６乏达。从而促进ＭＣＡ（）后血管新 ， 。夺实验研究发现，以ＣＤ３４为血僻新生标｝ 物的免疫绀织化学结果显示， 常组硐ｌ似手术组大 鼠 钎新生较少，模型组和Ｉ乜钳‘组大鼠缺血 暗 ： 血管新，Ｊｉ明显增多，同时电针组缺血、ｔ 暗带区 管新 较模刷 ｉ虹多。与我们前期研究结果一 敛。。。实时荧光定戢ＰＣＲ干¨Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ结果 示，正常组和假手术组ｍｉＲ一３２８有少 表达，与假 手术组大鼠比较，模 组大鼠缺ｍ 暗，ｆ｝ Ｉ ｍｉＲ一３２８ 表达水平显著升高．而电针组大鼠缺ｍ、 暗带区 ｍｉＲ ３２８表达水平较模犁组下调。ＣＤ ｌ １ ｍＲＮＡ及 蛋白在Ｊ卜常组和假 术组中表达较少．仪删组和ｔ乜 针组大鼠缺血半暗带 ＣＤ．Ｉ４ ｍＲＮＡ故篮白表达 明显增高，电针组较模型组丧达下调。水实验结果 与文献报道的调拄机制一致 ，因此得』Ｉ｛．电针水沟 穴可通过捌节ｍｉＲ一３２８的表达水平而州 靶基【太ｌ ＣＩ）４４ ｔｕＲＮＡ及蛋 的表达水平，从而洲节缺血 暗带Ⅸ的血管新 过稗，为临『术上电针水沟穴治疗 腑缺ｍ疾病提供 力叮靠的 据。 腑缺Ｉ仉中心 由于血流【１ｌ断，组织处 缺血、缺 氧的状态。细胞迅速肿胀、变性、坏死．造成不可逆的 中华老年心脑血管病杂志２０１ ７年３月第１９卷第３期Ｃｈｉｎ Ｊ ＧｅｒｉａｔｒＨｅａｒｔ ＢｒａｉｎＶｅｓｓｅｌＤｉｓ，Ｍａｒ ２０１ ７，Ｖｏｌ１９，Ｎｏ．３ 损伤，在缺血区的周围即缺血半暗带区，细胞处于低 氧、低灌溉条件下，若及时恢复该区血供，尚可挽救 可逆的神经元细胞，减轻脑缺血损伤的病理发展过 程，因此，挽救缺血半暗带可逆的神经元，促进缺血 ＦＪ］．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｒｅｓ Ｐｒａｃｔ，２０１３，２０１３：７０３１６３．ＤＯＩ：１０． １１５５／２０１３／７０３１６３． ｅｈ ＹＳ，Ｈｓｉａｏ ＦＣ，ｅｔ ａ１．Ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ ｉｎｄｕｃｅｓ ｈｕ— ［４］ Ｌｅｅ ＣＨ，Ｓｈｉｍａｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｎ Ａｘｌ——ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｅｃｈ—－ ａｎｉｓｍ［Ｊ］．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｄｉａｂｅｔｏｌ，２０１４，１３：５３．ＤＯＩ：１０．１１８６／ １４７５－２８４０—１３—５３． 半暗带的血管新生，恢复血供，是目前脑缺血的治疗 方法。研究表明，ｍｉＲＮＡ参与调控细胞的生长、分 化、增殖、凋亡等过程。ｍｉＲＮＡ与血管性疾病密切 ［５３ Ｓｌｅｖｉｎ Ｍ，Ｋｒｕｐｉｎｓｋｉ Ｊ，Ｇａｆｆｎｅｙ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ—ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ：ｕｎｃｏｖｅｒｉｎｇ ＲＨＡＭＭ ａｎｄ 相关，对疾病的诊断和预后有重要的生理、病理意 义ｌ＿３ ］。特定的ｍｉＲＮＡ在脑缺血后血管新生的过 程中起重要作用＿８ 。其中ｍｉＲ一３２８具有明显的抑 ［６］ ＣＤ４４ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ［Ｊ］．Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌ，２００７，２６ （１）：５８—６８．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｍａｔｂｉｏ．２００６．０８．２６１． Ｌｏｎｇａ ＥＬ，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ ＰＲ，Ｃａｎｓｏｎ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｍｉｄｄｌｅ ｃｅｒｅｂｒａｌ ａｒｔｅｒｙ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ ｗｉｔｈｏｕｔ ｃｒａｎｉｅｃｔｏｍｙ ｉｎ ｒａｔｓ［Ｊ］． 制血管新生的作用ｌ＿５］。在敲除ＣＤ４４的小鼠体内， 人工基底膜的成血管明显减少，并且发现缺失 ＣＤ４４的小鼠，新血管数量减少，并导致伤口愈合时 间延长［１ 。脑缺血相当于中医的中风病。临床上， 中医治疗脑缺血已取得显著的效果，研究报道，针刺 脑缺血模型大鼠内关穴可促进内皮细胞增殖，增强 血管新生，从而改善脑缺血的症状［１ 。Ｘｉｅ等口。 研 究发现，电针脑缺血大鼠百会、太冲等穴可以明显促 进基质细胞衍生因子１的浓度梯度，从而进一步诱 导大脑缺血侧内皮祖细胞和血管新生的形成。杨卓 欣等［１ 研究结果显示，针刺督脉上的穴位可改善脑 缺血后的神经再生状况。张红星等 研究发现，头 针可以促进脑缺血再灌注后的神经功能恢复。其他 中医疗法也证明，中药制剂可以促进脑缺血后血管 新生，补阳还五汤可使脑缺血再灌大鼠缺血区血管 新生，改善大脑血液循环，促进脑缺血损伤的修 复口 。脑组织缺血缺氧后炎性细胞浸润，血管通透 性增加，细胞肿胀甚至坏死，电针疗法能使细胞肿胀 程度降低，通过改变微循环，增加缺血组织周围的血 供，促进血管新生。本实验结果表明，电针水沟穴可 以通过调节ｍｉＲ－３２８及靶基因ＣＤ４４促进血管新 生，改善脑缺血症状。电针水沟穴对脑组织的保护 机制可能通过调节ｍｉＲ－３２８表达，但对其他ｍｉＲＮＡ 或者其他通路的影响机制有待进一步的探索。 参考文献 Ｅｌｉ 中华医学会神经病学分会脑血管病学组脑缺血二级预防指南 撰写组．中国脑缺血和短暂性脑缺血发作二级预防指南２ＯｌＯ ＥＪ］．中国临床医生，２０１１，３９（１１）：６８—７４．ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ． ｉｓｓｎ．１００８－１０８９．２０１１．１１．０２８． Ｅ２３ Ｍｅｈｔａ ＳＬ，Ｍａｎｈａｓ Ｎ，Ｒａｇｈｕｂｉｒ Ｒ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔａｒｇｅｔｓ ｉｎ ｃｅｒｅ— ｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ ｆｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｎｏｖｅｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ［Ｊ］．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｒｅｖ，２００７，５４（１）：３４—６６．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｂｒａｉｎｒｅｓｒｅｖ． ２００６．１１．００３． Ｅ３］Ａｍｍｅｎｄｏｌａ Ｍ，Ｓａｃｃｏ Ｒ，Ｓａｍｍａｒｃｏ Ｇ，ｅｔ ａ１．Ｍａｓｔ ｃｅｌｌｓ ｐｏｓｉ— ｔｉｖｅ ｔｏ ｔｒｙｐｔａｓｅ ａｎｄ ｃ—Ｋｉｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｓｕｒｇｉｃａｌｌｙ ｔｒｅａｔｅｄ Ｓｔｒｏｋｅ，１９８９，２０（１）：８２—９１．ＤＯＩ：１０．１１６１／０１．ＳＴＲ．２Ｏ．１． ８４． ［７３ 尤艳利，徐晓明，舒适，等．电针水沟穴对ＭＣＡＯ模型大鼠缺 血半暗带ＶＥＧＦ及ａｒｒｅｓｔｅｎ表达的影响［盯．上海中医药大学 学报，２０１４，２８（６）：８０—８４．ＤＯＩ：１０．１６３０６／ｊ．１００８—８６ｌｘ． ２Ｏ１４．０６．０１８． ［８］ Ｌｉ Ｙ，Ｍａｏ Ｉ ，Ｇａｏ Ｙ，ｅｔ ａ１．ＭｉｃｒｏＲＮＡ一１０７ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ Ｐｏｓｔ—ｓｔｒｏｋｅ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｄｉｃｅｒ－１［Ｊ］．Ｓｃｉ Ｒｅｐ， ２０１５，５：１３３１６．ＤＯＩ：１０．１Ｏ３８／ｓｒｅｐｌ３３１６． Ｅ９］ Ｚｅｎｇ Ｌ，Ｈｅ Ｘ，Ｗａｎｇ Ｙ，ｅｔ ａ１．ＭｉｃｒｏＲＮＡ一２ ｌＯ ０ｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉ０ｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｎｏｒｍａｌ ａｄｕｌｔ ｍｏｕｓｅ ｂｒａｉｎＦＪ］．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２０１４，２１（１）：３７—４３．ＤＯＩ：１０． １０３８／ｇｔ．２０１３．５５． ［１Ｏ］ Ｌｉ ＬＪ，Ｈｕａｎｇ Ｑ，Ｚｈａｎｇ Ｎ，ｅｔ ａ１．ｍｉＲ一３７６ｂ一５ｐ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ａｎｇｌｏ— ｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ［Ｊ］．Ｍｏｌ Ｍｅｄ Ｒｅｐ，２０１４，１０（１）： ５２７—５３５．ＤＯＩ：１０．３８９２／ｍｍｒ．２０１４．２１７２． ［ｕ］ Ｃａｏ Ｇ，Ｓａｖａｎｉ ＲＣ，Ｆｅｈｒｅｎｂａｃｈ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｅｎｄｏ— ｔｈｅｌｉａｌ ＣＤ４４ ｄｕｒｉｎｇ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ， ２００６，１６９（１）：３２５—３３６．ＤＯＩ：１０．２３５３／ａｊｐａｔｈ．２００６． ０６０２０６． Ｅ１２］ 周学溢，孟智宏，王健美．针刺内关穴对大脑中动脉缺血大鼠 血管内皮细胞增殖的调节［Ｊ］．辽宁中医杂志，２０１５，４２（７）： １３５２—１３５４．ＤＯＩ：１０．１３１９２／ｊ．ｉｓｓｎ．１００—１７１９．２０１５．０７．０８１． ［１３］ Ｘｉｅ Ｃ，Ｇａｏ Ｘ，Ｌｕｏ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｅｌｅｃｔｒ０ａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ—－ｄｅｒｉｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ—－ｌａ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｆｏｃａｌ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓ— ｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｍｏｄｅｌ ｒａｔｓ［Ｊ］．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ，２０１６，１６４８： １１９—１２６．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｂｒａｉｎｒｅｓ．２０１６．０７．０３８． ［１４］ 杨卓欣，陈鹏典，于海波，等．针刺任督脉穴位促进脑缺血后神 经再生的研究近况［Ｊ］．中西医结合学报，２０１２，１０（１）：１９—２４． ＤＯＩ：１０．３７３６／ｊｃｉｍ２０１２０１０４． ［ｉ５］ 张红星，王琼，周利，等．头针抗大鼠急性脑缺血再灌注炎症损 伤的作用机制［Ｊ］．中西医结合学报，２００９，７（８）：７６９—７７４． Ｄ０Ｉ：１０．３７３６／ｊｃｉｍ２００９０８１２． ［１６］ Ｚｈａｎｇ ＺＱ，Ｓｏｎｇ ＪＹ，Ｊｉａ ＹＱ，ｅｔ ａ１．Ｂｕｙａｎｇｈｕａｎｗｕ ｄｅｃｏｃｔｉｏｎ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｆｔｅｒ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎ— ｊｕｒｙ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｂｒａｉｎ ｔｉｓｓｕｅ ｒｅｐａｉｒ［Ｊ］．Ｎｅｕｒａｌ Ｒｅｇｅｎ Ｒｅｓ，２０ｌ６，ｌ１（３）：４３５—４４０．ＤＯＩ：１０．４１０３／１６７３－５３７４． １７９０５５． （收稿日期：２０１６—１０—１７） （本文编辑：银燕）