高效液相色谱法测定丹参中丹酚酸B等3种有效成分_游勇基

游勇基1,陈铭辉2(1.福建省药品检验所,福建福州

350001;2.福建中医学院药学系,福建福州350003)

摘要:目的󰀁测定丹参中丹酚酸B,丹参素和原儿茶醛等3种水溶性有效成分的含量。方法󰀁采用高效液相色谱法测定。以甲醇-5%冰醋酸为流动相进行梯度洗脱,以对羟基苯甲酸为内标,检测波长为281nm,柱温30󰀁。结果󰀁丹参素、原儿茶醛和丹酚酸B浓度分别在3.95~47.4󰀁g󰀁mL-1(r=0.9996),5.14~61.68󰀁g󰀁mL-1(r=0.9999),16.8~117.6󰀁g󰀁mL-1(r=0.9994)范围内呈良好线性关系,丹参素、原儿茶醛和丹酚酸B的平均回收率分别为101.43%(RSD=2.88%,n=6),99.89%(RSD=3.04%,n=6)和103.43%(RSD=1.52%,n=6)。结论󰀁方法简便,分离效果好,能同时测定丹参中丹酚酸B、丹参素、原儿茶醛等3种水溶性有效成分的含量,结果准确可靠。关键词:丹参;丹参素;原儿茶醛;丹酚酸B;高效液相色谱法中图分类号:R917

文献标识码:A

文章编号:1001-2494(2003)12-0950-03

DeterminationofthreeeffectivecomponentsinSalviamiltiorrhizabymeansofHPLC

YOUYong-ji1,CHENMing-hui2(1.FujianInstituteforDrugControl,Fuzhou350001,China;2.DepartmentofPharmacy,

FujianCollegeofTraditionalChineseMedicine,Fuzhou350003,China)

ABSTRACT:OBJECTIVE󰀁ToinvestigatethedeterminationofthreewatersolublecomponentsinSalviamiltiorrhiza.METHODS󰀁TheanalysiswascarriedonacolumnofHypersilC18(250mm󰀁4.6mm,5󰀁m)withamobilephaseofmethano-l5%aceticacid(gradientelutionfrom10󰀁90to35󰀁65in20minutes),using4-hydroxy-benzoicacidastheinternalstandard.Thedetectionwave-lengthwasat281nm.RESULTS󰀁Thelinearitywasobtainedover3.95~47.4󰀁g󰀁mL-1(r=0.9996)forDanshensu,5.14~61.68󰀁g󰀁mL-1(r=0.9999)forprotocatechuicaldrhydeand16.8~117.6󰀁g󰀁mL-1(r=0.9994)forsalviamolicacidB,respectively.Theaveragerecoverieswere101.43%(RSD=2.88%,n=6)forDanshensu,99.89%(RSD=3.04%,n=6)forprotocatechuica-ldrhydeand103.43%(RSD=1.52%,n=6)forsalviamolicacidB,respectively.CONCLUSION󰀁Thismethodappearedtoberapid,simpleandaccurate.

KEY󰀁WORDS:SatviamiltiorrhizaBge.;Danshensu;protocatechuicaldehyde;salviamolicacidB;HPLC󰀁󰀁丹参为唇形科植物丹参(SalviamiltiorrhizaBge.)的干燥根及根茎,是重要的传统中药。具有祛淤止痛、活血调经、养心除烦的功效。丹参在临床上广泛用于治疗心血管系统疾病,其水溶性活性成分为丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B等,具有抗血栓、改善血流环、抗氧化等作用,其中丹酚酸B活性较强[1]。它们的分析测定主要有HPLC测定丹参药材及制剂中

[2~3]

云南,市售品),经福建省药品检验所中药室周继斌主任药师鉴定为SalviamiltirrhizaBge.丹参对照药材(中国药品生物制品鉴定所,批号0923-9804),对羟基苯甲酸(分析纯),甲醇(色谱纯),水为超纯水,其它试剂均为分析纯。对照品:丹参素,原儿茶醛对照品(中国药品生物品检定所),丹酚酸B对照品(福建漳州制药厂,HPLC显单一色谱峰,纯度大于98%)。2󰀁方法与结果2.1󰀁色谱条件

色谱柱:HypersilC18(4.6mm󰀁250mm,5󰀁m,大连依利特科学仪器公司装填);流动相:甲醇-5%冰醋酸溶液(10󰀁90),pH2.5~3.0,维持0~5min,在5~10min,流动相比例线性改变至(35󰀁65),10~20min,维持比例(35󰀁65),再返回起始流动相;流速:1mL󰀁min-1;检测波长:281nm;柱温:30󰀁。

E-mail:youyj@sina.com

中国药学杂志2003年12月第38卷第12期丹参素和原儿茶醛含量以及用薄层扫描法测定丹

参药材中丹酚酸B等酚酸类化合物的含量[4]。用HPLC同时测定丹参药材中丹参素、原儿茶醛和丹酚酸B的含量,笔者未见文献报道。本实验建立了高效液相色谱法同时测定丹参中丹参素、原儿茶醛和丹酚酸B的含量,方法简便易行,分离效果好,准确可靠。1󰀁实验材料

仪器:Integral4000型高效液相色谱系统(美国Perkin-Elmer公司)。试药:丹参药材(产地:河北,甘肃,湖南,四川,

作者简介:游勇基,男,硕士,副主任药师

Tel:(0591)7621966-3521

󰀁950󰀁ChinPharmJ,2003December,Vol.38No.12

󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁

在此色谱条件下的色谱图见图1。2.5󰀁回收率实验

精密称取已知含量的丹参对照药材0.2g,分别精密加入一定量的3种对照品,按以上方法测定。结果丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B的平均回收率分别为101.43%,99.89%,103.43%,RSD为2.88%,3.04%,1.52%。2.6󰀁样品含量测定

精密称取样品细粉(过4号筛)约1g,加水30mL,浸泡过夜后热提2h,静置过滤。滤液用10%盐酸酸化至pH2,用醋酸乙酯萃取5次,每次10mL,合并萃取液,蒸干后用甲醇溶解并定量转移到25mL量瓶中,并稀释至刻度,摇匀。精密吸取2mL及内标溶液0.5mL,置10mL量瓶,甲醇定容。精密吸取20󰀁L注入液相色谱仪,记录丹参素、原儿茶

图1󰀁HPLC色谱图

a-对照品;b-丹参药材(河北);󰀁-丹参素;󰀁-原儿茶酸;󰀁-原儿茶醛;󰀁-对羟基苯甲酸(内标);󰀁-丹酚酸B

醛、丹酚酸B与内标的峰面积,分别以它们与内标的峰面积比为定量指标,根据内标法求算相应的浓度。结果见表2。表2󰀁丹参药材测定结果.%

Tab2󰀁ContentsofDanshensu,protocatechuicaldrhydeandsalviamolicacidBinSatviamiltiorrhizaBge.%

样品

丹参药材(四川)丹参药材(河北)丹参药材(甘肃)丹参药材(湖南)丹参药材(云南)丹参对照药材󰀁(0923-9804)

丹参素含量

0.2700.1060.3790.1600.4110.244

原儿茶醛含量0.0500.00700.00540.00690.0890.026

丹酚酸B含量

4.36

3.963.773.725.124.79

Fig1󰀁HPLCchromatogramsofthethreecomponents

a-standard;b-SatviamiltiorrhizaBge.(Hebei);󰀁-Danshensu;󰀁-protocat-echuicacid;󰀁-protocatechuicaldrhyde;󰀁-4-hydroxy-benzoicacid(internalsubstance.);󰀁-salviamolicacidB

2.2󰀁线性关系

精密称取丹参素3.95mg,原儿茶醛5.14mg,丹酚酸B8.4mg分别置于25mL棕色量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,作为贮备液A,B,C。精密称取内标对羟基苯甲酸0.02g,置50mL量瓶,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,作为内标溶液。精密吸取贮备液A0.25,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0mL,贮备液B0.25,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0mL,贮备液C0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5mL,分别置于7个10mL量瓶中,加入内标0.5mL,用甲醇稀释至刻度。精密吸取20󰀁L进样,分别以丹参素、原儿茶醛和丹酚酸B与内标的峰面积比,对丹参素、原儿茶醛和丹酚酸B的浓度进行线性回归处理,得回归方程与线性关系见表1,表明3种成分在所列浓度范围内具有良好线性关系。表1󰀁回归方程与线性关系

Tab1󰀁Regressionequationsandtheirlinearity

水溶性成分丹参素原儿茶醛丹酚酸B

回归方程

Y=-0.0213+0.0164XY=0.0403+0.1235XY=0.0011+0.0216X

r0.99860.99990.9994

线性范围/󰀁g󰀁mL-3.95~47.4

5.14~61.6816.8~117.6

1

3󰀁讨󰀁论

3.1󰀁提取条件的选择󰀁参考文献[2,4]考察了样品提取条件,曾通过实验比较了不同提取方法(冷浸、热提及超声波提取)、不同提取溶剂(水、甲醇、酸性甲醇)及不同提取时间的提取效果。实验表明水提取率最高;超声波提取1h左右,提取不完全;用水冷浸再热提2h,提取完全。同时根据丹酚酸类化合物的性质,用10%盐酸酸化至pH2,用醋酸乙酯萃取,合并萃取液,蒸干,溶解,定容。这样进一步纯化后测定有利分离和保护色谱柱。同时对制备的供试品溶液进行了稳定性考察,即每隔3h,进色谱仪测定一次,共测定6次,结果表明至少在15h以内,供试品溶液稳定。

3.2󰀁色谱条件选择󰀁按上述色谱条件实验,用二极管阵列检测器对丹参素、原儿茶醛和丹酚酸B的色谱峰进行波长扫描,所得光谱图显示丹参素在230,281nm处有最大吸收峰,原儿茶醛在230,281,310nm处有最大吸收峰;丹酚酸B在230,250,281,305nm处有最大吸收峰,因此选择检测波长在281nm处。丹参素、原儿茶醛、对羟基苯甲酸(内标)和丹酚酸B的理论塔板数分别为:3050,7738,9418和28431。3.3󰀁从样品含量测定结果,可以看出丹参药材中,丹酚酸B的含量最高(3%~5%左右),丹参素次之(0.1%~0.4%左右),原儿茶醛含量则在0.1%以下。6批丹参药材中,均未检出原儿茶酸。参考文献

[1]

中国医学科学院药物研究所.中草药现代研究.第2卷[M].

北京:北京医科大学-中国协和医科大学联合出版社,1997:472.

ChinPharmJ,2003December,Vol.38No.12󰀁951󰀁2.3󰀁精密度实验

分别精密吸取贮备液A,B和C,1.5,1.5和2.0mL,于10mL量瓶中,加入内标0.5mL,用甲醇稀释至刻度。精密吸取20󰀁L进样,记录峰面积,并分别计算丹参素、原儿茶醛和丹酚酸B与内标的峰面积比,丹参素、原儿茶醛和丹酚酸B与内标的峰面积比的RSD分别为1.19%,0.89%和0.57%(n=5)。2.4󰀁重复性实验

取丹参对照药材(0923-9804)按上述含量测定方法,计算含量。丹参素,原儿茶醛和丹酚酸B的平均含量分别为0.2444%,0.02572%和4.792%,RSD为3.90%,3.49%和3.87%,n=5。

中国药学杂志2003年12月第38卷第12期

󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁

[2]

[3]

王杰民,何怀冰,竺叶清,等.RP-HPLC法测定丹参药材中丹参素及原儿茶醛含量[J].上海医科大学学报,1991,18(1):28.

盛景芬,何晓华.高效液相色谱法测定丹参注射液中的原儿茶

[4]

醛和丹参素[J].中成药研究,1987,(7):14.

李静,何丽一,宋万志.丹参中水溶性酚酸类成分的薄层扫描测定法[J].药学学报,1993,28(7):543.

(收稿日期:2002-06-11)

动态浊度法定量检测替硝唑注射液中内毒素研究

苑庆华,芮菁,华晓东,唐元泰

(天津市药品检验所,天津300070)

摘要:目的󰀁对替硝唑注射液进行细菌内毒素动态浊度法检查实验,建立定量检测替硝唑注射液中细菌内毒素实验方法。方法󰀁采用中国药典2000年版附录检测细菌内毒素动态比浊法。结果󰀁替硝唑注射液用定量鲎试剂检测无干扰因素影响,内毒素回收率在50%~200%范围内。结论󰀁细菌内毒素动态比浊法定量检查替硝唑注射液中的内毒素是可行的。关键词:替硝唑注射液;动态比浊法;细菌内毒素;干扰实验中图分类号:R917

文献标识码:A

文章编号:1001-2494(2003)12-0952-03

Measurementofendotoxinintinidazoleinjectionusingthekinetic-turbidimetrictechnique

YUANQing-hua,RUIJing,HUAXiao-dong,TANGYuan-tai(TianjinInstituteforDrugControl,Tianjin300070,

China)

ABSTRACT:OBJECTIVE󰀁Toestablishthekinetic-turbidimetrictechniqueforpracticalqualitycontrolonendotoxincontentintinidazoleinjection.METHODS󰀁Thekinetic-turbidimetrictechniqueinChinesepharmacopoeia2000editionwasused.Interfencefac-torswereinvestigated.RESULTS󰀁Endotoxinspikedtotinidazoleinjectionwasrecoveredinaquantitativemannerandneitherinhib-itionnorenhancementeffectwasfound.Theendotoxinrecoverywasmorethan50percentandlessthan200percent.CONCLUSION󰀁Theseresultssuggestedthatthekinetic-turbidimetrictechniqueforbacterialendotoxintestwassuitableforthedetectionofendo-toxinintinidazoleinjection.

KEY󰀁WORDS:tinidazoleinjection;kinetic-turbidimetrictechnique;bacterialendotoxin;interferencefactorstest󰀁󰀁替硝唑注射液为抗菌类药物,适用于各种厌氧菌感染。本品的质量标准[1]中规定使用热原检查法,该法不仅费时、费力,要求条件高,且易受药品药理毒理作用干扰。细菌内毒素检查法作为补充热原检查法的一种检测方法,具有检测周期短,结果准确等优点。为此,我们参照中国药典2000年版[1]󰀁细菌内毒素定量测定法󰀁及美国药典24版内毒素检查法[2],考察了替硝唑注射液对细菌内毒素定量检查的干扰情况,为该品种的细菌内毒素检查方法的建立提供依据。1󰀁材料与仪器

替硝唑注射液(批号010928,010929,010930,规格:100mL:400mg;010925,010926,010927,规格:200mL:800mg,天津华津制药厂)。鲎试剂(TAL)(批号000708,󰀁b=0.03EU󰀁mL-1,每支规格2.1mL,福州新北生化有限公司;批号

-1

0205232,󰀁,每支规格1.25mL;批号b=0.015EU󰀁mL-10204171,󰀁,每支规格0.5mL,湛江安度斯b=0.25EU󰀁mL

180EU,中国药品生物制品检定所);细菌内毒素检查用水,批号W99-2,每支10mL(内毒素含量小于0.005EU󰀁mL-1,中国药品生物制品检定所)。EDS-99细菌内毒素检测系统(北京金山川科技发展有限公司)。2󰀁方法与结果

2.1󰀁细菌内毒素限值的确立[1]

按细菌内毒素限值公式L=K󰀁M-1,K为规定的给药途径下人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量,注射剂为5.0EU󰀁kg-1,M为1h内每公斤体重人的最大给药剂量为10mL󰀁kg-1󰀁h-1,计算L=5.0/10=0.5EU󰀁mL-1。2.2󰀁标准曲线的制备及可靠性[1]

用细菌内毒素检查用水将细菌内毒素工作标准品进行溶解稀释,使其最终内毒素浓度分别为0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0313EU󰀁mL-1稀释系列。各取0.1mL分别加到预先加有0.1mL动态比浊TAL试剂反应管内,混合均匀。立刻插入EDS-99细菌内毒素检测系统内进行自动检

生物有限公司);细菌内毒素工作标准品,批号2002-3(每支

基金项目:天津市科委自然基金项目(No.000261)Tel:(022)23353008,Fax:(022)23374070

作者简介:苑庆华,男,硕士,副主任药师

E-mail:yuan502@163.com

󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁

中国药学杂志2003年12月第38卷第12期󰀁952󰀁ChinPharmJ,2003December,Vol.38No.12