试剂配置
A：0.5~1%的伊红酒精溶液：
称取伊红Y0.5~1g，加少量蒸馏水溶解后，再滴加冰醋酸直至浆糊状。以滤纸过滤，将滤渣在烘箱中烤干后，以95%酒精（即工业酒精，如果不怕浪费，用无水乙醇配制也可）100毫升溶解。
B：苏木素染液配方：(配制3000ml，可按比列减少)
苏木精6g
无水乙醇100ml
硫酸铝钾150g
蒸馏水2000ml
碘酸钠1.2g
冰醋酸120ml
甘油900ml
配制方法：将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝钾溶于蒸馏水，溶解后将甘油倾入一起混合，最后加入冰醋酸和碘酸钠。
C：1%盐酸酒精分化液：将1毫升浓盐酸加入99毫升70%酒精中即可。
染色流程
(1)二甲苯（Ⅰ）15min
(2)二甲苯（Ⅱ）15min
（3）二甲苯：无水乙醇=1:12min
(4)100%乙醇（Ⅰ）5min
(5)100%乙醇（Ⅱ）5min
(6)80%乙醇5min
(7)蒸馏水5min
(8)苏木精液染色5min
(9)流水稍洗去苏木精液1-3s
(10)1%盐酸乙醇1-3s
(11)稍水洗10-30s
(12)蒸馏水过洗1-2s
(13)0.5%伊红液染色1-3min
(14)蒸馏水稍洗1-2s
(15)80%乙醇稍洗1-2s
(16)95%乙醇（Ⅰ）2-3s
(17)95%乙醇（Ⅱ）3-5s
(18)无水乙醇5-10min
(19)石炭酸二甲苯5-10min
(20)二甲苯（Ⅰ）2min
(21)二甲苯（Ⅱ）2min
(22)二甲苯（Ⅲ）2min
(23)中性树胶封固
注：①第（11）、（12）步可省去，（13）步冲水时间需延长至20-30min。
②第（21）步如果不用石炭酸二甲苯，可改用无水乙醇。
*冷冻切片HE染色步骤：
（1）冰冻切片固定10～30s
（2）稍水洗1～2s
（3）苏木精液染色（60℃）30～60s
（4）流水洗去苏木精液5～10s
（5）1%盐酸乙醇1～3s
（6）稍水洗1～2s
（7）促蓝液返蓝5～10s
（8）流水冲洗15～30s
（9）0.5%曙红液染色30～60s
（10）蒸馏水稍洗1～2s
（11）80%乙醇1～2s
（12）95%乙醇1～2s
（13）无水乙醇1～2s
（14）石炭酸二甲苯2～3s
（15）二甲苯（Ⅰ）2～3s
（16）二甲苯（Ⅱ）2～3s
（17）中性树胶封固。
注：第（14）步如果不用石炭酸二甲苯，可改用无水乙醇。
染色结果：细胞核蓝色，胞质、肌纤维、胶原纤维和红细胞呈深浅不一的红色。
4．12切片脱水透明切片经HE染色后，要彻底脱水透明，才能用中性树胶封盖。如果脱水不彻底，封片后呈白色雾状，镜下观察模糊不清，且容易褪色。切片1-2级无水乙醇脱水，也可使用石碳酸二甲苯进行脱水。石碳酸有较强脱水能力，但长时间可使切片脱色，因此要经过多次二甲苯以使石碳酸完全除去。
5.H-E染色评定标准：
（1）切片完整，厚度4-6微米，厚薄均匀，无皱褶无刀痕；
（2）染色核浆分明，红蓝适度，透明洁净，封裱美观。
4 染色结果 编辑
细胞核被苏木精染成鲜明的蓝色，软骨基质、钙盐颗粒呈深蓝色，粘液呈灰蓝色。细胞浆被伊红染成深浅不同的粉红色至桃红色，胞浆内嗜酸性颗粒呈反光强的鲜红色。胶原纤维呈淡粉红色，弹力纤维呈亮粉红色，红血球呈橘红色，蛋白性液体呈粉红色。
着色情况与组织或细胞的种类有关，也随其生活周期及病理变化而改变。例如，很多细胞在新生时期胞浆对伊红着色较淡或轻度嗜碱，当其衰老时或发生退行性变则呈现嗜伊红浓染。胶原纤维在老化和出现透明变性时，伊红着色由浅变深。
Masson染色,用于显示组织中纤维的染色方法之一。
试剂：
Regaud 氏苏木精：苏木精1g，95%酒精10ml，甘油10ml，蒸馏水80ml。
将苏木精加入蒸馏水内加温溶解,冷却后加入酒精和甘油,放数日后即可应用。
Masson丽春红酸性复红液： 丽春红0.7g，酸性复红0.3g，蒸馏水99ml，冰醋酸1ml。
0.2%冰醋酸水溶液： 冰醋酸0.2 ml，蒸馏水100 ml。
1%磷钼酸水溶液：磷钼酸1g，蒸馏水100 ml。
苯胺蓝水溶液：苯胺蓝2g，蒸馏水98 ml，冰醋酸2 ml。
1%光绿水溶液：光绿 1g，蒸馏水100 ml。
Masson三色法步骤
1． 石蜡切片脱蜡至水。
2． 铬化处理或去汞盐沉淀（甲醛固定的组织此步可略）。
3． 依次自来水和蒸馏水洗。
4． 用Regaud苏木精染液或Weigert苏木精液染核5-10min。
5． 充分水洗,如过染可盐酸酒精分化。
6． 蒸馏水洗。
7． 用Masson 丽春红酸性复红液5-10min。
8． 以2%冰醋酸水溶液浸洗片刻。
9． 1%磷钼酸水溶液分化3-5min。
10. 不经水洗,直接用苯胺蓝或光绿液染5min。
11．以0.2%冰醋酸水溶液浸洗片刻。
12．95%酒精、无水酒精、二甲苯透明、中性树胶封固。
结果：胶原纤维、粘液、软骨呈蓝色（如光绿液染色为绿色），胞浆、肌肉、纤维素、神经胶质呈红色，胞核黑蓝色。
体会与说明：
1．控制好染色步骤。
2．组织固定起着很重要的作用，根据不同的固定液可延长或缩短染色时间。
3．0.2%冰醋酸水溶液洗，可使色调清晰鲜艳。
4．磷钼酸水溶液对丽春红、酸性复红有分化作用，分化时镜下控制， 肌纤维和纤维素呈红色，胶原纤维呈淡粉红色即可。
天狼猩红染色
[试剂配制]
(1)天狼星红饱和苦昧酸液 O．5％天狼星红10ml，苦味酸饱和液90ml。
(2)天青石蓝液 天青石蓝B1．25g．铁明矾1．25g，蒸馏水250ml。溶解煮沸、待冷却过滤
加入甘油30ml，然后再加入浓盐酸0．5ml。
[染色步骤]
(1)中性甲醛液固定组织，石蜡切片，常规脱蜡至水。
(2)人大青石蓝液染5一lOmin。
(3)蒸馏水洗3次。
(4)天狼星红饱和苦昧酸浓染15-30min
(5)无水乙醇直接分化与脱水。
Devil二甲苯透明，中性树胶封固。
[注意事项]
(1)细胞核里染色可以用Harris苏木素染色液谈染。
(2)染色封固后的切片，须及时用偏光显微镜进行观察和照相已保持鲜艳的色彩
注：在偏光显微镜下可以观察到四种类型的胶原纤维。
l型胶原纤维：紧密排列，显示很强的双折光性，呈黄色或红色的纤维o
ll型胶原纤维：显示弱的双折光，呈多种色彩的疏松网状分布。
皿型胶原纤维：显示弱的双折光，呈绿色的细纤维。
lv型胶原纤维：显示弱的双折光的基膜，呈淡黄色。
免疫组化步骤（ABC法）
1。4%多聚甲醛常规灌注固定，取材并置20%蔗糖溶液（4℃）中过夜。蜡块制作。切片，贴片。0.01MKPBS清洗5min×3后；
2。加入配好的0.3%的过氧化氢甲醇溶液（甲醇80ml＋0.01MKPBS 100ml＋30%过氧化氢）30min，以消除内源性过氧化物酶的影响，0.01MPBS清洗5min×3；
3。加入配好的0.3% Triton X100（30% Triton X100＋0.01MKPBS 100ml）30min，以增加细胞的通透性，0.01MKPBS清洗5min×3；
4。加入用血清稀释液（牛血清白蛋白1.00g＋0.01MPBS 100ml＋叠氮纳0.08g）稀释的一抗，4℃存放24-48h；吸去抗体，0.01MKPBS洗5min×3；
5。加入0.01MKPBS稀释的的二抗，室温孵育2h。0.01MKPBS洗5min×3；
6。加入ABC复合物之类的抗体，室温孵育2h，0.01MKPBS洗5min×3；蒸馏水迅速冲三次；
7。加入显色液，进行免疫组织化学显色，时间一般不超过30min，可不时在显微镜
下进行观察，待细胞着色而背底颜色较淡时马上吸去显色液，用蒸馏水迅速冲三次后加入0.01MKPBS终止反应；
8。梯度酒精脱水之后，封片，拍照。
免疫组化SP法步骤：
SP(streptavidin-perosidase)法,即链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法.
按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶(主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶)、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、酶标法和免疫金银法等。按染色步骤可分为直接法(又称一步法)和间接法(二步、三步或多步法)；按结合方式可分为抗原—抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法和亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是最常使用的方法。
一般的sp法步骤啊,具体如下：
1.烤片，68℃，20分钟,
2. 常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水；二甲苯I 20min --二甲苯II 20 min--100%酒精I 10min --100%II 10min --95% 5min-- 80% 5min-- 70% 5min
3.阻断 灭活内源性过氧化物酶：3%H2O2 37℃孵育10min，PBS冲洗3X5min；
4. 抗原修复:置0.01M枸橼酸缓冲液（PH 6.0）中用煮沸（95℃，15－20min），自
然冷却20min 以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温，PBS冲洗3X5min。
5. 正常羊血清工作液封闭，37℃10 min，倾去勿洗.
6. 滴加一抗4℃ 冰箱孵育过夜，PBS冲洗3X5min（用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照）；
滴加生物素标记二抗, 37℃孵育30min, PBS冲洗3X5min;
7. 滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37℃孵育30min, PBS冲洗3X5min;
8. DAB/ H2O2反应染色，自来水充分冲洗后，
苏木素复染，常规脱水，透明，干燥，封片。
免疫组化（Elivision二步法）：
（1）石蜡切片置于67℃烘箱中，烘片2小时，脱蜡至水，用pH7.4的PBS冲洗三次，每次3分钟（3×3’）。
（2）取一定量pH=6.0柠檬酸盐缓冲液，加入微波盒中，微波加热至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，中档微波处理10分钟，取出微波盒流水自然泠却，从缓冲液中取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用PBS冲洗2×3’。(注：不是所有的抗体都需要微波修复的，视具体情况而定)
（3）每张切片加1滴3% H2O2，室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3×3’。
（4）除去PBS液，每张切片加1滴相应的第一抗体（相应稀释倍数），室温下孵育2小时。
（5）PBS冲洗3×5’。除去PBS液，每张切片加1滴聚合物增强剂（试剂A），室温下孵育20分钟。PBS冲洗3×3’。
（6）除去PBS液，每张切片加1滴酶标抗鼠/兔聚合物（试剂B），室温下孵育30分钟。PBS冲洗3×5’
（7）除去PBS液，每张切片加1滴新鲜配制的DAB液，显微镜下观察5分钟。
（8）苏木素复染，0.1%HCl分化，自来水冲洗，蓝化，切片经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，晾干后观察。
注：即用型第二代免疫组化Elivision plus广谱试剂盒，购自福州脉新生物技术开发有限公司。包括：生物素化抗兔二抗、亲和素（Reagent A）、生物素－辣根过氧化物酶（Reagent B）、二氨基联苯胺（DAB）
脱钙剂的配置
10%EDTA的配置：
1) 加热水浴锅到65℃
2) 称取NaOH11g加到900ml dd H2O中
3) 再加入EDT A-Na2 100g至水中；
4) 水浴加热，搅拌至透明溶解
5) 加入Na2HPO4 6g, NaH2PO4 0.4g, NaCl 9g ; 蒸馏水定容至1000ml
6) 调节pH值至7.2~7.3,室温或4度保存
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