(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 110662831 A(43)申请公布日 2020.01.07
(21)申请号 201880034504.1(22)申请日 2018.05.25(30)优先权数据
62/511,907 2017.05.26 US62/514,467 2017.06.02 US(85)PCT国际申请进入国家阶段日
2019.11.25(86)PCT国际申请的申请数据
PCT/US2018/034567 2018.05.25(87)PCT国际申请的公布数据
WO2018/218105 EN 2018.11.29(71)申请人 凯德药业股份有限公司
地址 美国加利福尼亚州(72)发明人 E.格施文格 R.罗德里格斯
Y.欧阳 (54)发明名称
制备和使用胚胎间充质祖细胞的方法(57)摘要
本公开提供了生成非聚簇的干细胞的方法。中胚层分化之前的聚簇破坏提高了hEMP和T细胞分化的产量和效率。因此，该方法允许开发改进的hEMP和T细胞分化的方法。
(74)专利代理机构 北京市柳沈律师事务所
11105
代理人 凃滔(51)Int.Cl.
C12N 5/0735(2006.01)C12N 5/0783(2006.01)C12N 5/0775(2006.01)
权利要求书3页 说明书26页 附图7页
CN 110662831 ACN 110662831 A
权 利 要 求 书
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1.生成人胚胎间充质祖(hEMP)细胞的方法，所述方法包括以下步骤：(a)使非聚簇的干细胞以确定的单细胞密度与基质接触；
(b)在促进细胞生长至期望的汇合的培养条件下培养所述干细胞；和
(c)改变所述培养条件以诱导所述干细胞在期望的温育时间内分化为hEMP细胞；从而生成hEMP细胞。2.权利要求1的方法，其中所述干细胞是人胚胎干(ES)细胞或诱导多能干(iPS)细胞。3.权利要求2的方法，其中所述ES或iPS细胞是人来源的。4.权利要求3的方法，其中所述ES或iPS细胞是H1细胞、H9细胞、HES3细胞、HSF1细胞、HSF6细胞、ESI-017细胞、CS02iCTR-NTn1细胞、CS03iCTR-NTn1细胞、CS80iCTR-Tn3细胞、CS179iCTR-NTn1细胞、CS201iCTR-NTn4细胞、CS202iCTR-NTn2细胞或CS206iCTR-Tn5细胞。
5.前述权利要求中任一项的方法，其中所述确定的单细胞密度在约1.5x105和约8x105个细胞/cm2之间。
6.权利要求5的方法，其中所述确定的单细胞密度为约1.89x105个细胞/cm2、约3.2x105个细胞/cm2、约3.4x105个细胞/cm2、约3.6x105个细胞/cm2、约3.79x105个细胞/cm2、约7.2x105个细胞/cm2或约7.58x105个细胞/cm2。
7.前述权利要求中任一项的方法，其中所述基质用
或重组人玻连蛋白而不
是小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)包被。8.前述权利要求中任一项的方法，其中所述基质是孔板、细胞培养皿、膜、袋、培养瓶、反蛋白石、聚合物晶格、静态细胞悬液、搅拌细胞悬液或经等离子体处理的聚合物。
9.权利要求8的方法，其中所述基质包含膜。10.前述权利要求中任一项的方法，其中所述促进细胞生长的培养条件包括在mTeSR1培养基中培养所述干细胞。
11.权利要求10的方法，其中所述mTeSR1培养基包含ROCK抑制剂Y27632。12.前述权利要求中任一项的方法，其中所述期望的汇合在约20％和约80％之间。13.权利要求12的方法，其中所述汇合为约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％或约80％。
14.前述权利要求中任一项的方法，其中所述改变培养条件的步骤包括添加X-VIVOTM 15。
15.前述权利要求中任一项的方法，其中所述温育时间在约2和约4天之间。16.权利要求15的方法，其中所述温育时间为约2.0、约2.5、约3.0、约3.5或约4.0天。17.权利要求16的方法，其中所述温育时间为约3.5天。18.前述权利要求中任一项的方法，其进一步包括将所述hEMP细胞分化为T细胞的步骤。
19.前述权利要求中任一项的方法，其中所述方法进一步包括破坏干细胞的聚簇以生成所述非聚簇的干细胞的步骤。
20.权利要求19的方法，其中通过机械或化学破坏来破坏所述干细胞的聚簇。21.权利要求20的方法，其中所述化学破坏包括与胰蛋白酶样酶温育。22.权利要求21的方法，其中所述胰蛋白酶样酶为胰蛋白酶、TrypLE Express、TrypLE
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Select、胶原酶、分散酶、胰蛋白酶-EDTA。
23.根据前述权利要求中任一项的方法生成的人胚胎间充质祖(hEMP)细胞。24.组合物，其包含根据权利要求1-22中任一项的方法生成的人胚胎间充质祖(hEMP)细胞的群体。
25.生成T细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)使非聚簇的干细胞以确定的单细胞密度与基质接触，其中所述干细胞不包含小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)；
(b)在促进细胞生长至期望的汇合的培养条件下培养所述干细胞；和
(c)改变所述培养条件以诱导所述干细胞在期望的温育时间内分化为T细胞；从而从干细胞生成T细胞。26.权利要求25的方法，其中所述干细胞是人胚胎干(ES)细胞或诱导多能干(iPS)细胞。
27.权利要求26的方法，其中所述ES或iPS细胞是人来源的。28.权利要求26或27的方法，其中所述ES或iPS细胞是H1细胞、H9细胞、HES3细胞、HSF1细胞、HSF6细胞、ESI-017细胞、CS02iCTR-NTn1细胞、CS03iCTR-NTn1细胞、CS80iCTR-Tn3细胞、CS179iCTR-NTn1细胞、CS201iCTR-NTn4细胞、CS202iCTR-NTn2细胞或CS206iCTR-Tn5细胞。
29.权利要求25-28中任一项的方法，其中所述确定的单细胞密度在约1.5x105和约8x105个细胞/cm2之间。
30.权利要求25-29中任一项的方法，其中所述确定的单细胞密度为约1.89x105个细胞/cm2、约3.2x105个细胞/cm2、约3.4x105个细胞/cm2、约3.6x105个细胞/cm2、约3.79x105个细胞/cm2、约7.2x105个细胞/cm2或约7.58x105个细胞/cm2。
31.权利要求25-30中任一项的方法，其中所述基质用
或重组人玻连蛋白而
没有小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)包被。
32.权利要求25-31中任一项的方法，其中所述基质是孔板、细胞培养皿、膜、袋、培养瓶、反蛋白石、聚合物晶格、静态细胞悬液、搅拌细胞悬液或经等离子体处理的聚合物。
33.权利要求32的方法，其中所述底物包含膜。34.权利要求25-33中任一项的方法，其中所述促进细胞生长的培养条件包括在mTeSR1培养基中培养所述干细胞。
35.权利要求34的方法，其中所述mTeSR1培养基包含ROCK抑制剂Y27632。36.权利要求25-35中任一项的方法，其中所述期望的汇合在约20％和约80％之间。37.权利要求36的方法，其中所述汇合为约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％或约80％。
38.权利要求25-37中任一项的方法，其中所述改变培养条件的步骤包括添加X-VIVOTM 15。
39.权利要求25-38中任一项的方法，其中所述温育时间在约2和约4天之间。40.权利要求39的方法，其中所述温育时间为约2.0、约2.5、约3.0、约3.5或约4.0天。41.权利要求40的方法，其中所述温育时间为约3.5天。42.权利要求25-41中任一项的方法，其中所述方法进一步包括破坏干细胞的聚簇以生
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成所述非聚簇的干细胞的步骤。
43.权利要求42的方法，其中通过机械或化学破坏来破坏所述干细胞的聚簇。44.权利要求43的方法，其中所述化学破坏包括与胰蛋白酶样酶温育。45.权利要求44的方法，其中所述胰蛋白酶样酶为胰蛋白酶、TrypLE Express、TrypLE Select、胶原酶、分散酶、胰蛋白酶-EDTA。
46.根据权利要求25-45中任一项的方法生成的T细胞。47.组合物，其包含根据权利要求25-45中任一项的方法生成的T细胞的群体。
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说 明 书
制备和使用胚胎间充质祖细胞的方法
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相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2017年5月26日提交的美国临时申请号62/511,907和2017年6月2日提交的美国临时申请号62/514,467的优先权，其两者以其整体通过引用并入本文。[0003]发明背景
[0004]人类癌症就其本质而言包含已经经历了遗传或表观遗传转化而变成异常癌细胞的正常细胞。此时，癌细胞开始表达与正常细胞表达的蛋白质和其他抗原不同的蛋白质和其他抗原。这些异常的肿瘤抗原可以被身体的免疫系统用于特异性靶向和杀伤癌细胞。然而，癌细胞采用各种机制来防止免疫细胞如T和B淋巴细胞成功靶向癌细胞。
[0005]目前的T细胞疗法依赖于经富集或经修饰的人T细胞来靶向并杀伤患者中的癌细胞。患者或正常供体衍生的T细胞由于其缺乏自我更新在本质上是有限的。从干细胞来源衍生T细胞将为治疗用途提供潜在的细胞的无限来源。需要有效的体外方法以将多能干细胞分化为胚胎中胚层祖细胞和成熟T细胞。[0006]发明概述
[0007]本发明尤其通过提供用于生成人胚胎间充质祖(hEMP)细胞的改进的方法、其衍生物及其在有效生成T细胞中的用途来满足该需求。[0008]在一方面，本公开提供了生成人胚胎间充质祖(hEMP)细胞的方法，该方法包括以下步骤：使非聚簇的干细胞以确定的单细胞密度与基质接触；在促进细胞生长至期望的汇合的培养条件下培养干细胞；和改变培养条件以诱导干细胞在期望的温育时间内分化为hEMP细胞；从而生成hEMP细胞。[0009]在一些实施方案中，非聚簇的干细胞是人胚胎干(ES)细胞或诱导多能干(iPS)细胞。在一些实施方案中，ES或iPS细胞是人来源的。[0010]在一些实施方案中，ES或iPS细胞是H1细胞、H9细胞、HES3细胞、HSF1细胞、HSF6细胞、ESI-017细胞、CS02iCTR-NTn1细胞、CS03iCTR-NTn1细胞、CS80iCTR-Tn3细胞、CS179iCTR-NTn1细胞、CS201iCTR-NTn4细胞、CS202iCTR-NTn2细胞或CS206iCTR-Tn5细胞。[0011]在一些实施方案中，确定的单细胞密度在约1.5x105和约8x105个细胞/cm2之间。在某些实施方案中，确定的单细胞密度为约1.89x105个细胞/cm2、约3.2x105个细胞/cm2、约3.4x105个细胞/cm2、约3.6x105个细胞/cm2、约3.79x105个细胞/cm2、约7.2x105个细胞/cm2或约7.58x105个细胞/cm2。
[0012]
[0001]
在一些实施方案中，基质用或重组人玻连蛋白而不是小鼠胚胎成纤维
细胞(MEF)包被。在一些实施方案中，基质是孔板、细胞培养皿、膜、袋、培养瓶、反蛋白石、聚
合物晶格、静态细胞悬液、搅拌细胞悬液或经等离子体处理的聚合物。在一些实施方案中，基质包含膜。
[0013]在一些实施方案中，促进细胞生长的培养条件包括在mTeSR1培养基中培养干细胞。在一些实施方案中，mTeSR1培养基进一步包含ROCK抑制剂。在某些实施方案中，mTeSR1培养基进一步包含ROCK抑制剂Y27632。[0014]在一些实施方案中，细胞生长至在约20％和约80％之间的期望的汇合。在一些实
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施方案中，汇合为约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％或约80％。[0015]在一些实施方案中，改变培养条件的步骤包括在X-VIVOTM 15培养基中培养细胞。[0016]在一些实施方案中，温育时间在约2和约4天之间。在一些实施方案中，温育时间为约2.0、约2.5、约3.0、约3.5或约4.0天。在某些实施方案中，温育时间为约3.5天。[0017]在一些实施方案中，该方法进一步包括将hEMP细胞分化为T细胞的步骤。[0018]在一些实施方案中，该方法进一步包括破坏干细胞的聚簇以生成非聚簇的干细胞的步骤。在一些实施方案中，通过机械或化学破坏来破坏干细胞的聚簇。在一些实施方案中，化学破坏包括与胰蛋白酶样酶(TrypLE)温育。在某些实施方案中，胰蛋白酶样酶为胰蛋白酶、TrypLE Express、TrypLE Select、胶原酶、分散酶，或胰蛋白酶-EDTA。[0019]在一些实施方案中，根据本文所述的方法生成人胚胎间充质祖(hEMP)细胞。[0020]在一方面，本公开提供了包含根据本文所述的方法生成的人胚胎间充质祖(hEMP)细胞的群体的组合物。[0021]在一方面，本公开提供了生成T细胞的方法，该方法包括以下步骤：使非聚簇的干细胞以确定的单细胞密度与基质接触，其中干细胞不包含小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)；在促进细胞生长至期望的汇合的培养条件下培养干细胞；和改变培养条件以诱导干细胞在期望的温育时间内分化为T细胞；从而从干细胞生成T细胞。[0022]在一些实施方案中，干细胞是人胚胎干(ES)细胞或诱导多能干(iPS)细胞。在一些实施方案中，ES或iPS细胞是人来源的。[0023]在一些实施方案中，ES或iPS细胞是H1细胞、H9细胞、HES3细胞、HSF1细胞、HSF6细胞、ESI-017细胞、CS02iCTR-NTn1细胞、CS03iCTR-NTn1细胞、CS80iCTR-Tn3细胞、CS179iCTR-NTn1细胞、CS201iCTR-NTn4细胞、CS202iCTR-NTn2细胞或CS206iCTR-Tn5细胞。[0024]在一些实施方案中，确定的单细胞密度在约1.5x105和约8x105个细胞/cm2之间。在某些实施方案中，确定的单细胞密度为约1.89x105个细胞/cm2、约3.2x105个细胞/cm2、约3.4x105个细胞/cm2、约3.6x105个细胞/cm2、约3.79x105个细胞/cm2、约7.2x105个细胞/cm2或约7.58x105个细胞/cm2。
[0025]
在一些实施方案中，基质用或重组人玻连蛋白而不是小鼠胚胎成纤维
细胞(MEF)包被。在一些实施方案中，基质是孔板、细胞培养皿、膜、袋、培养瓶、反蛋白石、聚
合物晶格、静态细胞悬液、搅拌细胞悬液或经等离子体处理的聚合物。在一些实施方案中，基质包含膜。
[0026]在一些实施方案中，促进细胞生长的培养条件包括在mTeSR1培养基中培养干细胞。在一些实施方案中，mTeSR1培养基进一步包含ROCK抑制剂。在某些实施方案中，mTeSR1培养基进一步包含ROCK抑制剂Y27632。[0027]在一些实施方案中，细胞生长至在约20％和约80％之间的期望的汇合。在一些实施方案中，汇合为约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％或约80％。[0028]在一些实施方案中，改变培养条件的步骤包括在X-VIVOTM 15培养基中培养细胞。[0029]在一些实施方案中，温育时间在约2和约4天之间。在一些实施方案中，温育时间为约2.0、约2.5、约3.0、约3.5或约4.0天。在某些实施方案中，温育时间为约3.5天。[0030]在一方面，本公开提供了根据本文所述的方法生成的T细胞。[0031]在一方面，本公开提供了包含根据本文所述的方法生成的T细胞的群体的组合物。
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本文所述的任何方面或实施方案可以与如本文公开的任何其他方面或实施方案
组合。尽管本公开已联合其详细描述进行描述，但前述描述旨在说明而不是限制本公开的范围，本公开的范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优点和修改在所附权利要求的范围内。
[0033]本文所指的专利和科学文献建立了本领域技术人员可获得的知识。本文引用的所有美国专利和已公开或未公开的美国专利申请均通过引用并入。本文引用的所有公开的外国专利和专利申请均在此通过引用并入。本文引用的所有其他公开的参考文献、词典、文件、手稿和科学文献均在此通过引用并入。
[0034]本公开的其他特征和优点将从附图和以下包括实施例的发明详述以及权利要求书中显而易见。[0035]附图简述
[0036]当结合附图时，根据以下详细描述，将更清楚地理解上述以及其他特征。然而，这些附图仅用于说明目的而不是限制。
[0037]图1显示示例性流式细胞术数据，其说明表面表达的CD326和CD56的变化。[0038]图2显示示例性流式细胞术数据的摘要图，其说明表面表达的CD326和CD56的变化。
[0039]图3显示从ES或iPS细胞生成hEMP细胞的示例性流程图。
[0040]
图4显示示例性流式细胞术数据，其说明在和玻连蛋白基质上表面表达
的CD326和CD56的变化。
[0041]图5显示从ES或iPS细胞生成hEMP细胞的示例性流程图。[0042]图6显示流式细胞术数据，其说明细胞是纯的诱导的和分选的hEMP细胞。非hEMP和hEMP细胞两者的分选后纯度均确定为>95％。[0043]图7显示流式细胞术数据，其说明在第4周时T细胞发育的分析。收获的细胞用针对以下抗原的抗体染色：CD45、CD56、CD3、CD4、CD8、TCRab。[0044]定义
[0045]为了使本公开更容易理解，下面首先定义某些术语。对于以下术语和其他术语的附加定义在整个说明书中得以阐述。
[0046]如在本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。
[0047]除非在上下文中明确说明或显而易见，否则如本文所用，术语“或”应当理解为包含性的并且涵盖“或”和“和”两者。[0048]本文使用的术语“和/或”视为具有或不具有另一个的两个指定特征或组分中的每一个的具体公开。因此，如在本文中的短语例如“A和/或B”中所使用的术语“和/或”旨在包括A和B，A或B，A(单独)和B(单独)。同样地，如在短语例如“A、B和/或C”中所使用的术语“和/或”旨在涵盖以下方面的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。[0049]如本文所用，术语“例如”和“即”仅作为实例使用，而无意于限制，并且不应当诠释为仅涉及在说明书中明确列举的那些项目。[0050]术语“或更多”、“至少”、“超过”等，例如“至少一种”应当理解为包括但不限于比所
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述值多至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149or 150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000或更多。还包括任何更大的数字或其间的分数。[0051]相反地，术语“不超过”包括小于所述值的每个值。例如，“不超过100个核苷酸”包括100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1和0个核苷酸。还包括任何更小的数字或其间的分数。[0052]术语“多个”、“至少两个”、“两个或更多个”、“至少第二个”等应当理解为包括但不限于至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149or 150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000或更多。还包括任何更大的数字或其间的分数。[0053]在整个说明书中，词语“包含(comprising)”或变形如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”将理解为暗指包括所述要素、整数或步骤，或要素、整数或步骤的组，但不排除任何其他要素、整数或步骤，或要素、整数或步骤的组。应当理解的是，在本文中无论何处用语言“包含”描述方面，还提供了以“由......组成”和/或“基本上由......组成”描述的其他类似方面。
[0054]除非明确说明或从上下文中显而易见，如本文所用，术语“约”是指如本领域普通技术人员测定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分取决于如何测量或测定值或组成，即测量系统的局限性。例如，“约”或“基本上由......组成”可以意指按本领域实践的1个内或超过1个标准偏差。“约”或“基本上由......组成”可以意指高达10％的范围(即±10％)。因此，“约”可以理解为在10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％或0.001％内大于或小于所述值。例如，约5mg可以包括4.5mg和5.5mg之间的任何量。此外，特别是关于生物系统或过程，该术语可以意指高达一个数量级或高达5倍的值。当在本公开中提供特定值或组成时，除非另有说明，否则应当假定“约”或“基本上由......组成”的含义在该特定值或组成的可接受的误差范围内。[0055]如文本所述，除非另有说明，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应当理解为包括所叙述范围内的任何整数的值，并且在适当时包括其分数(例如整数的
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十分之一和百分之一)。
[0056]使用其国际单位制(SI)接受的形式提供本文所使用的单位、前缀和符号。数字范围包括定义范围的数字。[0057]除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本公开所涉及领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。例如，Juo“,The Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology”,2nd ed.,(2001),CRC Press；“The Dictionary of Cell&Molecular Biology”,5th ed.,(2013),Academic Press；和“The Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology”,Cammack et al.eds.,2nd ed,(2006),Oxford University Press为本领域技术人员提供了本公开中使用的许多术语的通用词典。
[0058]“施用”是指使用本领域技术人员已知的任何各种方法和递送系统将药剂物理引入受试者。本文公开的制剂的示例性施用途径包括静脉内、肌肉内、皮下、腹膜内、脊柱或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。如本文所用，短语“肠胃外施用”意指除肠内和局部施用外的施用方式，通常通过注射以及包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、淋巴内、病灶内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注，以及体内电穿孔。在一些实施方案中，经由非肠胃外途径例如口服施用制剂。其他非肠胃外途径包括局部、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内、阴道、直肠、舌下或局部。也可以进行施用，例如，一次，多次，和/或在一个或多个延长时期。[0059]如本文所用，如果抗原与第一结合分子、抗体或其抗原结合分子之间的相互作用阻断、限制、抑制或以其他方式降低参照结合分子、参照抗体或其抗原结合分子与抗原相互作用的能力，则抗原结合分子、抗体或其抗原结合分子与参照抗体或其抗原结合分子“交叉竞争”。交叉竞争可以是完全的，例如结合分子与抗原的结合完全阻断了参照结合分子结合抗原的能力，或者其可以是部分的，例如结合分子与抗原的结合降低了参照结合分子结合抗原的能力。在某些实施方案中，与参照抗原结合分子交叉竞争的抗原结合分子结合与参照抗原结合分子相同或重叠的表位。在其他实施方案中，与参照抗原结合分子交叉竞争的抗原结合分子结合与参照抗原结合分子与参照抗原结合分子不同的表位。许多类型的竞争性结合测定法可以用于确定一种抗原结合分子是否与另一种竞争，例如：固相直接或间接放射免疫测定法(RIA)；固相直接或间接酶免疫测定法(EIA)；夹心法竞争测定法(Stahli et al.,1983,Methods in Enzymology 9:242-253)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(Kirkland et al.,1986,J.Immunol.137:3614-3619)；固相直接标记测定法、固相直接标记夹心法测定法(Harlow and Lane,1988,Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press)；使用1-125标记的固相直接标记RIA(Morel et al.,1988,Molec.Immunol.25:7-15)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(Cheung,et al.,1990,Virology 176:546-552)；以及直接标记RIA(Moldenhauer et al.,1990,Scand.J.Immunol.32:77-82)。[0060]“抗原”是指引发免疫应答或能够被抗体或抗原结合分子结合的任何分子。免疫应答可以牵涉抗体产生或特异性免疫活性细胞的活化或这两者。本领域技术人员将容易理解任何大分子(包括几乎所有蛋白质或肽)均可以充当抗原。抗原可以内源性表达，即由基因组DNA表达或可以重组表达。抗原可以对某些组织，例如癌细胞具有特异性或者其可以广泛
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地表达。此外，较大分子的片段可以起抗原作用。在一些实施方案中，抗原为肿瘤抗原。[0061]术语“同种异体”是指衍生自一个个体然后被引入相同物种的另一个个体的任何物质，例如同种异体T细胞移植。[0062]术语“转导”和“经转导的”是指一种过程，通过该过程将外源DNA经由病毒载体引入到细胞中(参见Jones et al.,“Genetics:principles and analysis,”Boston:Jones&Bartlett Publ.(1998))。在一些实施方案中，载体为逆转录病毒载体、DNA载体、RNA载体、腺病毒载体、杆状病毒载体、EB病毒载体、乳多空病毒载体、牛痘病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒相关载体、慢病毒载体或其任何组合。[0063]“癌症”是指一大组各种疾病，其特征为体内异常细胞不受控制的生长。不受调节的细胞分裂和生长导致形成入侵相邻组织且可以通过淋巴系统或血流转移到身体远程部分的恶性肿瘤。“癌症”或“癌症组织”可以包括肿瘤。可以通过本公开的方法治疗的癌症的实例包括但不限于免疫系统的癌症，包括淋巴瘤、白血病、骨髓瘤及其他白细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，本公开的方法可以用于缩小源自例如以下的肿瘤的肿瘤尺寸：骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、多发性骨髓瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBC)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、转化滤泡性淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤(SMZL)、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病、急性髓样白血病、慢性髓样白血病、急性淋巴母细胞白血病(ALL)(包括非T细胞ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)赘生物、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、由环境诱发的癌症(包括由石棉诱发的那些)、其他B细胞恶性肿瘤以及所述癌症的组合。在一个具体的实施方案中，癌症为多发性骨髓瘤。特定癌症可以对化学疗法或放射疗法有响应或者癌症可以是难治性的。难治性癌症是指不可通过手术干预进行修正的癌症，并且癌症或是最初对化学疗法或放射疗法无响应，或是癌症随时间变成无响应。[0064]如本文所用，“抗肿瘤效应”是指可以呈现为肿瘤体积缩小、肿瘤细胞的数目减少、肿瘤细胞增殖减少、转移的数目减少、总体或无进展生存期增加、预期寿命增加或各种与肿瘤相关的生理症状改善的生物效应。抗肿瘤效应也可以指肿瘤发生的预防，例如疫苗。[0065]如本文所用，“细胞因子”是指响应与特定抗原的接触由一个细胞释放的非抗体蛋白质，其中细胞因子与第二个细胞相互作用以介导在第二个细胞中的应答。细胞因子可以由细胞内源性表达或施用于受试者。细胞因子可以由免疫细胞(包括巨噬细胞、B细胞、T细胞和肥大细胞)释放以传播免疫应答。细胞因子可以诱导受体细胞中的各种应答。细胞因子可以包括稳态细胞因子、趋化因子、促炎细胞因子、效应物和急性期蛋白质。例如，稳态细胞因子(包括白细胞介素(IL)7和IL-15)促进免疫细胞存活和增殖，而促炎细胞因子可以促进炎症应答。稳态细胞因子的实例包括但不限于IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-15及干扰素(IFN)gamma。促炎细胞因子的实例包括但不限于IL-1a、IL-1b、IL-6、IL-13、IL-17a、肿瘤坏死因子(TNF)-alpha、TNF-beta、成纤维细胞生长因子(FGF)2、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、可溶性细胞间黏附分子1(sICAM-1)、可溶性血管黏附分
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子1(sVCAM-1)、血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF-C、VEGF-D以及胎盘生长因子(PLGF)。效应物的实例包括但不限于颗粒酶A、颗粒酶B、可溶性Fas配体(sFasL)以及穿孔素。急性期蛋白质的实例包括但不限于C反应蛋白(CRP)及血清淀粉样蛋白A(SAA)。[0066]“趋化因子”是介导细胞趋化性或定向运动的一类细胞因子。趋化因子的实例包括但不限于IL-8、IL-16、嗜酸性粒细胞趋化因子、嗜酸性粒细胞趋化因子-3、巨噬细胞衍生的趋化因子(MDC或CCL22)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1或CCL2)、MCP-4、巨噬细胞炎性蛋白1α(MIP-1α、MIP-1a)、MIP-1β(MIP-1b)、gamma-诱导蛋白10(IP-10)以及胸腺和活化调节的趋化因子(TARC或CCL17)。
[0067]治疗剂(例如经工程化的CAR T细胞)的“治疗有效量”、“有效剂量”、“有效量”或“治疗有效剂量”是当单独使用或与另一治疗剂组合使用时保护受试者免于疾病发作或者促进疾病消退的任何量，所述疾病消退的证据为疾病症状的严重性降低、疾病无症状期的频率和持续期间增加或防止由于疾病折磨导致的损伤或残疾。可以使用熟练从业人员已知的各种方法评估治疗剂促进疾病消退的能力，例如在临床试验期间在人受试者中评估、在用于预测在人体中的效力的动物模型系统中评估或通过在体外测定法中测定试剂的活性评估。
[0068]如本文所用，术语“淋巴细胞”包括自然杀伤(NK)细胞、T细胞或B细胞。NK细胞是代表固有免疫系统的主要组分的一类细胞毒性(cytotoxic)(细胞毒性(cell toxic))淋巴细胞。NK细胞排斥肿瘤以及病毒感染的细胞。其通过凋亡或程序性细胞死亡的过程发挥作用。由于其不需要活化来杀伤细胞，因而称为“自然杀伤”。T细胞在细胞介导的免疫(无抗体参与)中发挥主要作用。它的T细胞受体(TCR)将自身与其他淋巴细胞类型区分开来。胸腺(免疫系统的专门器官)主要负责T细胞的成熟。有六种类型的T细胞，即：辅助性T细胞(例如CD4+细胞)、细胞毒性T细胞(也称为TC、细胞毒性T淋巴细胞、CTL、T杀伤细胞、溶细胞性T细胞、CD8+T细胞或杀伤T细胞)、记忆T细胞((i)干细胞样记忆TSCM细胞(如初始细胞)为CD45RO-、CCR7+、CD45RA+、CD62L+(L选择素)、CD27+、CD28+以及IL-7Rα+，但它们也表达大量的CD95、IL-2Rβ、CXCR3以及LFA-1，并且显示许多记忆细胞独特的功能属性；(ii)中央记忆TCM细胞表达L-选择素和CCR7，它们分泌IL-2，但不分泌IFNγ或IL-4，以及(iii)效应记忆TEM细胞，然而，不表达L-选择素或CCR7，但产生效应细胞因子，如IFNγ和IL-4)、调节性T细胞(Treg、抑制性T细胞或CD4+CD25+调节性T细胞)、自然杀伤T细胞(NKT)以及Gamma Delta T细胞。另一方面，B细胞在体液免疫(有抗体参与)中发挥主要作用。其生成抗体和抗原并执行抗原呈递细胞(APC)的作用，并且在通过抗原相互作用的活化后转变成记忆B细胞。在哺乳动物中，未成熟的B细胞在骨髓中形成。[0069]术语“经基因工程化改造的”、“经工程化改造的”或“经修饰的”是指修饰细胞的方法，包括但不限于通过删除编码或非编码区或其部分或者通过反义技术造成基因缺陷，或者增加引入编码区或其部分的蛋白质的表达。在一些实施方案中，经修饰的细胞为干细胞(例如，造血干细胞(HSC)、胚胎干细胞(ES)、诱导多能干(iPS)细胞)、淋巴细胞(例如T细胞)，其可以从患者或供体获得。[0070]“免疫应答”是指免疫系统的细胞(例如T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、树突状细胞以及中性粒细胞)和由这些细胞的任一种或肝脏产生的可溶性大分子(包括Ab、细胞因子和补体)的作用，该作用导致选择性靶向、
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结合、损害、破坏和/或排除脊椎动物体内的入侵病原体、被病原体感染的细胞或组织、癌细胞或其他异常细胞，或者在自身免疫或病理性炎症的情况下，正常的人细胞或组织。[0071]术语“免疫疗法”是指患有疾病或处于感染疾病或遭受疾病复发的风险的受试者的治疗，该治疗通过包括诱导、增强、抑制或以其他方式修饰免疫应答的方法进行。免疫疗法的实例包括但不限于T细胞疗法。T细胞疗法可以包括过继性T细胞疗法、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)免疫疗法、自体细胞疗法、工程化自体细胞疗法(eACTTM)以及同种异体T细胞移植。然而，本领域技术人员将认为本文公开的调理方法将增强任何移植的T细胞疗法的有效性。T细胞疗法的实例描述于美国专利公开号2014/0154228和2002/0006409、美国专利号5,728,388以及国际公开号WO 2008/081035中。
[0072]免疫疗法的T细胞可以来自本领域已知的任何来源。例如，T细胞可以在体外从造血干细胞群分化；诱导多能干细胞(iPS)、胚胎干细胞(ES)或T细胞可以从受试者获得。T细胞可以从例如外周血单核细胞(PBMC)、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织以及肿瘤获得。此外，T细胞可以衍生自本领域中可获得的一个或多个T细胞系。T细胞也可以使用本领域技术人员已知的任何数目的技术(如FICOLLTM分离和/或单采术(apheresis))从受试者收集的单位血液获得。分离用于T细胞疗法的T细胞的另外的方法公开于美国专利公开号2013/0287748，其以其整体通过引用并入本文。[0073]术语“工程化自体细胞疗法”(其可以缩写为“eACTTM”，也称为过继细胞转移)是收集患者自身的T细胞，随后将其经遗传改变以识别并靶向一种或多种在一种或多种特定的肿瘤细胞或恶性肿瘤的细胞表面上表达的抗原的过程。如本文所用，“患者”包括任何患有癌症(例如淋巴瘤或白血病)的人。本文中，术语“受试者”和“患者”可互换使用。[0074]如本文所用，术语“体外细胞”是指离体培养的任何细胞。特别地，体外细胞可以包括T细胞。[0075]术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用并且是指包含通过肽键共价连接的氨基酸残基的化合物。蛋白质或肽含有至少两个氨基酸并且可以包含蛋白质或肽的序列的氨基酸的最大数目没有限制。多肽包括任何包含两个或更多个通过肽键彼此连接的氨基酸的肽或蛋白质。如本文所用，该术语是指短链(其在本领域中也通常称为例如肽、寡肽和寡聚体)和较长的链(其在本领域中通常称为蛋白质，其具有许多类型)两者。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽的变体、经修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然的肽、重组的肽、合成的肽或其组合。[0076]如本文所用，“刺激”是指由刺激分子与其同源配体的结合所诱导的初级应答，其中结合介导信号转导事件。“刺激分子”是T细胞上的分子，例如与存在于抗原呈递细胞上的同源刺激配体特异性结合的T细胞受体(TCR)/CD3复合物。“刺激配体”是当存在于抗原呈递细胞(例如APC、树突状细胞、B细胞等)上时可以与T细胞上的刺激分子特异性结合，从而介导T细胞的初级应答(包括但不限于活化、启动免疫应答、增殖等)的配体。刺激配体包括但不限于抗CD3抗体、装载有肽的MHC I类分子、超激动性抗CD2抗体以及超激动性抗CD28抗体。
[0077]如本文所用，“共刺激信号”是指与初级信号(例如TCR/CD3连接)组合时导致T细胞应答(例如但不限于增殖和/或关键分子的上调或下调)的信号。[0078]如本文所用，“共刺激配体”包括与T细胞上的同源共刺激分子特异性结合的抗原
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呈递细胞上的分子。共刺激配体的结合提供介导T细胞应答(包括但不限于增殖、活化、分化等)的信号。共刺激配体诱导除了由刺激分子提供的初级信号(例如通过T细胞受体(TCR)/CD3复合物与装载有肽的主要组织相容性复合物(MHC)分子的结合提供)外的信号。共刺激配体可以包括但不限于，3/TR6、4-1BB配体、结合Toll配体受体的激动剂或抗体、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD30配体、CD40、CD7、CD70、CD83、疱疹病毒侵入介体(HVEM)、人白细胞抗原G(HLA-G)、ILT4、免疫球蛋白样转录物(ILT)3、诱导性共刺激配体(ICOS-L)、细胞内黏附分子(ICAM)、特异性结合B7-H3的配体、淋巴毒素beta受体、MHC I类链相关蛋白A(MICA)、MHC I类链相关蛋白B(MICB)、OX40配体、PD-L2或程序性死亡(PD)L1。共刺激配体包括但不限于，与存在于T细胞上的共刺激分子特异性结合的抗体，该存在于T细胞上的共刺激分子例如但不限于4-1BB、B7-H3、CD2、CD27、CD28、CD30、CD40、CD7、ICOS、与CD83特异性结合的配体、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、自然杀伤细胞受体C(NKG2C)、OX40、PD-1或肿瘤坏死因子超家族成员14(TNFSF14或LIGHT)。[0079]“共刺激分子”是在T细胞上特异性结合共刺激配体，从而介导T细胞的共刺激反应(例如但不限于增殖)的同源结合配偶体。共刺激分子包括但不限于4-1BB/CD137、B7-H3、BAFFR、BLAME(SLAMF8)、BTLA、CD 33、CD 45、CD100(SEMA4D)、CD103、CD134、CD137、CD154、CD16、CD160(BY55)、CD18、CD19、CD19a、CD2、CD22、CD247、CD27、CD276(B7-H3)、CD28、CD29、CD3(alpha；beta；delta；epsilon；gamma；zeta)、CD30、CD37、CD4、CD4、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD5、CD64、CD69、CD7、CD80、CD83配体、CD84、CD86、CD8alpha、CD8beta、CD9、CD96(Tactile)、CDl-la、CDl-lb、CDl-lc、CDl-ld、CDS、CEACAM1、CRT AM、DAP-10、DNAM1(CD226)、Fc gamma受体、GADS、GITR、HVEM(LIGHTR)、IA4、ICAM-1、ICAM-1、ICOS、Ig alpha(CD79a)、IL2R beta、IL2R gamma、IL7R alpha、整合素、ITGA4、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、ITGBl、KIRDS2、LAT、LFA-1、LFA-1、LIGHT、LIGHT(肿瘤坏死因子超家族成员14；TNFSF14)、LTBR、Ly9(CD229)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1(CDl la/CD18)、MHC I类分子、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、OX40、PAG/Cbp、PD-1、PSGL1、SELPLG(CD162)、信号传导淋巴细胞活化分子、SLAM(SLAMF1；CD150；IPO-3)、SLAMF4(CD244；2B4)、SLAMF6(NTB-A；Lyl08)、SLAMF7、SLP-76、TNF、TNFr、TNFR2、Toll配体受体、TRANCE/RANKL、VLA1或VLA-6，或其片段、截短或组合。[0080]本文中，术语“降低”和“减少”可互换使用并且表示小于原来的任何变化。“降低”和“减少”是相对的术语，需要在测量前和测量后间进行比较。“降低”和“减少”包括完全消耗。
[0081]受试者的“治疗”或“处理”是指在受试者上进行任何类型的干预或过程，或对该受试者施用活性剂，以达到逆转、减轻、改善、抑制、减缓或预防症状、并发症或状况或与疾病相关的生化指标的发作、进展、发展、严重性或复发的目的。在一个实施方案中，“治疗”或“处理”包括部分缓解。在另一个实施方案中，“治疗”或“处理”包括完全缓解。[0082]为了计算同一性百分比，通常以给出序列之间最大匹配的方式比对所比较的序列。可以用来确定同一性百分比的计算机程序的一个实例是GCG程序包，其包括GAP(Devereux et al.,1984,Nucl.Acid Res.12:387；Genetics Computer Group,University of Wisconsin,Madison,Wis.)。计算机算法GAP用于比对两个待确定序列同一性百分比的多肽或多核苷酸。序列经比对以使其各自的氨基酸或核苷酸最佳匹配(“匹配跨度”，由算法
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确定)。在某些实施方案中，算法还使用标准比较矩阵(关于PAM 250比较矩阵，参见Dayhoff et al.,1978,Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352；关于BLOSUM 62比较矩阵，参见Henikoff et al.,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:10915-10919)。[0083]如本文所用，术语“破坏”是指对聚簇的细胞的机械、化学和/或酶解离。如本文所用，经破坏的细胞保持完整但松散的细胞-细胞黏附接触以及膜黏附性质。[0084]如本文所用，术语“培养”或语法等同物是指在有利于生长、存活或分化的条件下维持细胞的过程。术语“培养”和“细胞培养”或任何同义词在本申请中可互换使用。[0085]如本文所用，术语“细胞密度”或“单细胞密度”是指在一定体积或表面积中的细胞的量。在一些实施方案中，细胞密度以细胞/六孔板的孔表示。根据本公开，标准的六孔板具有大约9.5cm2的表面积。在一些实施方案中，细胞密度表示为细胞/cm2。[0086]如本文所用，术语“培养容器”是指可以提供用于培养细胞的无菌环境的任何容器。示例性培养容器包括但不限于玻璃、塑料或金属容器。[0087]本公开的各种方面进一步详细描述于下列小节中。[0088]发明详述
[0089]根据本公开，HSC或其他干细胞(胚胎干(ES)或诱导多能干(iPS))可以用于生成具有期望的谱系的大量(可能是无限的)工程化T细胞。本公开尤其提供了用于将人胚胎干(ES)或诱导多能干(iPS)细胞分化为胚胎中胚层祖细胞(hEMP)和/或T细胞的高效方法，以及包括胚胎中胚层祖细胞(hEMP)和/或T细胞的组合物。[0090]不希望受任何特定理论的束缚，考虑如果在称为“中胚层推进(mesoderm push)”或hEMP诱导的诱导步骤之前，从ES或iPS细胞生成T细胞更有效。简而言之，将ES或iPS细胞培养、传代并生长直至期望的汇合。随后，将培养条件改变为hEMP诱导培养基。在一些实施方案中，培养ES或iPS细胞的方法是在
或重组人玻连蛋白上无饲养层的(即无
MEF)。出乎意料的是，本发明人发现，如果将非聚簇的细胞培养物用于“中胚层推进”或hEMP诱导，则可以更有效地生成hEMP。例如，可以将非聚簇的干细胞以确定的单细胞密度接种在基质上并诱导。结果是高效和可再现的中胚层推进。来自中胚层推进的高产量的hEMP细胞允许在下游应用中高效、快速和稳健的T细胞分化。[0091]多能干细胞
[0092]各种多能干细胞可以用于实施本公开。例如，除所有其他成熟血细胞外，骨髓中的造血干细胞(HSC)(以及脐带血或外周血)还产生定型的胸腺祖细胞。这些胸腺祖细胞运输至胸腺，在那里它们开始发育为成熟的T细胞。Notch受体经由它们的配体Delta和Jagged(在胸腺中特别是Notch1和Delta样4)的信号传导驱动转录级联(即Tcf7、Gata3、Bcl11b等)，其导致通过重组酶激活基因RAG1和RAG2的TCR基因座重排。首先，有成效的TCRb重排(即产生TCR蛋白)将生成与pTa配对的蛋白并运输至表面。这种表面运输将信号传达回细胞，允许其得以进一步发育。表面pTa-TCRb不需要像成熟TCR中发生的那样与MHC相互作用，即生存信号可以是肽:MHC非依赖性的。然后该细胞进行重排TCRa，仔细检查其是否成功进行alpha/beta配对和对自身肽:MHC的弱识别(即阳性和阴性选择或中枢耐受性)，然后成为成熟的初始T细胞并循环到外周。[0093]在一些实施方案中，可以使用胚胎干(ES)或诱导多能干(iPS)细胞。[0094]可以从本领域已知的任何来源获得干细胞。例如，可以从商业来源获得诱导多能
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干细胞(iPS)或胚胎干细胞(ES)。合适的HSC、ES细胞、iPS细胞和其他干细胞也可以是培养的永生细胞系或直接从患者中分离。用于分离、发育和/或培养干细胞的各种方法在本领域中是已知的，并且可以用于实行本公开。[0095]生成非聚簇的干细胞[0096]如本文所述，在中胚层诱导之前在悬液中培养非聚簇的单细胞干细胞导致干细胞分化效率提高。可以使用各种方法来生成非聚簇的干细胞培养物。例如，可以首先将ES或iPS细胞在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)、的形式传代至
或玻连蛋白上培养成聚簇，然后以聚簇
或玻连蛋白包被的平板上。在一些实施方案中，为了生成悬浮的
单个细胞，通过用胰蛋白酶、胰蛋白酶样酶或本领域已知的其他细胞-细胞黏附破坏物消化来化学破坏聚簇。在一些实施方案中，通过均质化(例如，重悬浮、机械搅拌、培养基洗涤、缓冲液洗涤、细胞解离剂(例如，Miltenyi GentleMACS)或涡旋)机械破坏聚簇，以生成悬浮的单细胞。
[0097]在一些实施方案中，培养条件适于促进单细胞生长，使得干细胞不形成聚簇。例如，干细胞可以悬浮生长。[0098]基质
[0099]根据本公开，将非聚簇的干细胞以确定的单细胞密度接种在基质上以进行生长。如本文所用，术语“基质”是指任何固体或半固体表面或支撑物。例如，合适的基质可以是层、微珠、孔板、细胞培养皿、膜、袋、培养瓶、容器、反蛋白石、聚合物晶格、凝胶或聚合物。
[0100]
在一些实施方案中，可以用期望的包被处理合适的基质。例如，可以用
或玻连蛋白包被合适的基质。在一些实施方案中，用胶原(例如胶原I、II、II或IV)、明胶、纤连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白、纤维蛋白原、BD
基底膜基质、硫酸皮肤素蛋白
聚糖、Poly-D-赖氨酸和/或其组合包被合适的基质。[0101]根据本公开，将非聚簇的细胞以确定的单细胞密度接种在基质上。适用于本公开的单细胞密度在标准6孔板中的范围可以是约1.0-50X 106个细胞/孔(例如，约1.0-40X 106个细胞/孔、约1.0-30X 106个细胞/孔、约1.0-20X 106个细胞/孔、约1.0-10X 106个细胞/孔、1.0-8X 106个细胞/孔、约1.0-5X 106个细胞/孔、约1.0-4.5X 106个细胞/孔、约1.0-4X 106个细胞/孔、约1.0-3.6X 106个细胞/孔、约1.0-3X 106个细胞/孔、约1.0-2.5X 106个细胞/孔、约1.0-2.0X 106个细胞/孔、约1.0-1.5X 106个细胞/孔、约1.5-10X 106个细胞/孔、约1.5-8X 106个细胞/孔、约1.5-4X 106个细胞/孔、约1.5-3.5X 106个细胞/孔、约1.5-3.0X106个细胞/孔、约1.5-2.5X 106个细胞/孔、约1.5-2.0X 106个细胞/孔)。[0102]在一些实施方案中，以确定的单细胞密度传代细胞(例如，约1.8X 106个细胞/孔、约3.6X 106个细胞/孔、约7.2X 106个细胞/孔)。[0103]在一些实施方案中，以范围为约1.5x105至约8x105个细胞/cm2(例如，1.89x105个细胞/cm2、约3.2x105个细胞/cm2、约3.4x105个细胞/cm2、约3.6x105个细胞/cm2、约3.79x105个细胞/cm2、约7.2x105个细胞/cm2或约7.58x105个细胞/cm2)的细胞密度传代细胞。[0104]在一些实施方案中，接种时确定的单细胞密度表示为百分比汇合。根据本公开，以确定的细胞密度接种使得表面汇合范围为1％至100％(例如，约1％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约
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70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约97％、约99％)。在一些实施方案中，以高百分比汇合(例如，约70-100％、约80％)传代细胞。在一些实施方案中，以中等百分比汇合(例如，约30-70％、约40％)传代细胞。在一些实施方案中，以低百分比汇合(例如，约1-30％、约20％)传代细胞。
[0105]在一些实施方案中，将细胞接种在生长培养基中。在其他实施方案中，将细胞接种在诱导培养基中。在一些实施方案中，根据本公开将细胞接种在诱导培养基中，使其生长至期望的汇合，并重新铺板在诱导培养基中。[0106]细胞培养条件[0107]根据本公开，ES或iPS细胞可以适于在悬浮培养中作为单细胞生长。在一些实施方案中，ES或iPS细胞维持悬浮。悬浮在营养培养基中的ES或iPS细胞可以用循环装置维持，该循环装置确保分离的细胞保持悬浮在营养培养基中。[0108]培养基
[0109]根据本公开，可以使用各种细胞培养基和条件。例如，可以在含血清或无血清的细胞培养基中产生细胞。在一些实施方案中，培养基是无血清培养基。在一些实施方案中，培养基是无动物培养基，即，缺少动物衍生的组分的培养基。在一些实施方案中，培养基是化学成分确定的培养基(chemically defined medium)。如本文所用，术语“化学成分确定的营养培养基”是指基本上所有化学组分都是已知的培养基。在一些实施方案中，化学成分确定的营养培养基不含动物衍生的成分，例如血清、血清衍生的蛋白质(例如白蛋白或胎球蛋白)和其他组分。在一些情况下，化学成分确定的培养基包含一种或多种蛋白质(例如蛋白质生长因子或细胞因子)。在一些情况下，化学成分确定的营养培养基包含一种或多种蛋白质水解物。在其他情况下，化学成分确定的营养培养基是不含蛋白质的培养基，即不含有蛋白质、水解物或未知组分的无血清培养基。[0110]在一些实施方案中，化学成分确定的培养基可以补充一种或多种动物衍生的组分。此类动物衍生的组分包括但不限于胎牛血清、马血清、山羊血清、驴血清、人血清和血清衍生的蛋白质，例如白蛋白(例如牛血清白蛋白或人血清白蛋白)。[0111]在某些实施方案中，可以选择某些优选的属性或在特定条件下的生长来培养细胞。本领域技术人员将理解，此类属性可以基于已建立的系(即，表征的可商购的细胞系)的已知特征和/或特性或通过经验评估来确定。在一些实施方案中，可以针对其在细胞的饲养层上生长的能力来选择细胞系。在一些实施方案中，可以针对细胞系生长为细胞的贴壁单层的能力来选择细胞系。在一些实施方案中，该方法涉及包括在包含培养基的细胞培养物中培养干细胞和/或祖细胞。[0112]根据本公开，生成人胚胎间充质祖(hEMP)细胞包括生长阶段和分化阶段。在一些实施方案中，生长阶段期间的培养基与分化阶段期间的培养基实质上不同。在某些实施方案中，mTESR1培养基用于生长阶段，而X-VIVOTM 15培养基用于分化阶段。[0113]可以利用各种培养基。说明性但非限制性的培养基包括但不限于MEM(最低必需培养基)、DMEM(杜氏改良Eagle培养基)、BME(Eagle基础培养基)、RPMI 1640、DMEM/F-12(杜氏改良Eagle培养基：营养混合物F-12)、DMEM/F-10(杜氏改良Eagle培养基：营养混合物F-10)、a-MEM(a-最低必需培养基)、G-MEM(Glasgow最低必需培养基)、FMDM(Isocove改良杜氏培养基)、必需8(E8)培养基、敲除DMEM、AIM V、mTeSRTM 1、X-VIVOTM 15、StemSpan、CellGro
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树突状细胞培养基。
[0114]在一些实施方案中，使用了用于人胚胎干细胞(ES细胞)和诱导多能干细胞(iPS细胞)的无饲养物细胞培养基。在一些实施方案中，本公开用于生成非聚簇的ES或iPS细胞。在一些实施方案中，适用于本公开的无血清培养基缺乏动物衍生的组分。在一些实施方案中，适合于本公开的无血清培养基是化学成分确定的培养基。例如，mTeSRTM 1培养基可以用于细胞生长。mTeSRTM 1是高度专业化的、无血清且完全的细胞培养基。[0115]在某些实施方案中，培养基补充有Rho相关蛋白激酶(ROCK)途径的抑制剂(例如，Y27632)。ROCK抑制剂可以用于辅助重编程、维持、自我更新和/或分化。[0116]诱导时期望的汇合[0117]根据本公开，将非聚簇的细胞重悬于或转移至诱导培养基中，并以确定的单细胞密度在基质上铺板。适用于本公开的单细胞密度在标准6孔板中的范围可以是约1.0-50X 106个细胞/孔1.0-50X 106个细胞/孔(例如，约1.0-40X 106个细胞/孔、约1.0-30X 106个细胞/孔、约1.0-20X 106个细胞/孔、约1.0-10X 106个细胞/孔、1.0-8X 106个细胞/孔、约1.0-5X 106个细胞/孔、约1.0-4.5X 106个细胞/孔、约1.0-4X 106个细胞/孔、约1.0-3.6X 106个细胞/孔、约1.0-3X 106个细胞/孔、约1.0-2.5X 106个细胞/孔、约1.0-2.0X 106个细胞/孔、约1.0-1.5X106个细胞/孔、约1.5-10X 106个细胞/孔、约1.5-8X 106个细胞/孔、约1.5-4X106个细胞/孔、约1.5-3.5X 106个细胞/孔、约1.5-3.0X 106个细胞/孔、约1.5-2.5X 106个细胞/孔、约1.5-2.0X 106个细胞/孔)。[0118]在一些实施方案中，将非聚簇的细胞重悬于或转移至诱导培养基中，并以确定的单细胞密度在基质上铺板(例如，约1.8X 106个细胞/孔、约3.6X 106个细胞/孔、约7.2X 106个细胞/孔)。
[0119]在一些实施方案中，将非聚簇的细胞重悬于或转移至诱导培养基中，并以确定的单细胞密度在基质上铺板，所述确定的单细胞密度范围在约1.5x105和约8x105个细胞/cm2之间(例如，1.89x105个细胞/cm2、约3.2x105个细胞/cm2、约3.4x105个细胞/cm2、约3.6x105个细胞/cm2、约3.79x105个细胞/cm2、约7.2x105个细胞/cm2或约7.58x105个细胞/cm2)。[0120]在一些实施方案中，诱导时确定的单细胞密度表示为百分比汇合。根据本公开，将非聚簇的细胞重悬于或转移至诱导培养基中，并以确定的细胞密度在基质上铺板，使得表面汇合范围为1％至100％(例如，约1％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约97％、约99％)。在一些实施方案中，以高百分比汇合(例如，约70-100％、约80％)诱导细胞。在一些实施方案中，以中等百分比汇合(例如，约30-70％、约40％)诱导细胞。在一些实施方案中，以低百分比汇合(例如，约1-30％、约20％)诱导细胞。[0121]生长和分化阶段
[0122]在一些实施方案中，在范围为约30-37℃的温度培养细胞(例如，约31-37℃、约32-37℃、约33-37℃、约34-37℃、约35-37℃、约36-37℃)。在一些实施方案中，在大约30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃或37℃的温度培养细胞。本文所述的任何温度可以用于生长和/或分化阶段。在一些实施方案中，在生长阶段和分化阶段期间在不同的温度下培养细胞。在一些实施方案中，在生长阶段和分化阶段期间在基本相同的温度下培养细胞。本文所述的任何培养基pH可以用于生长和/或分化阶段。在一些实施方案中，用于生长阶段和分化
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阶段的培养基pH是不同的。在一些实施方案中，用于生长阶段和分化阶段的培养基pH基本相同。
[0123]在一些实施方案中，ES或iPS细胞生长并维持在生长阶段。在一些实施方案中，接种ES或iPS细胞并使其生长至期望的汇合(例如，约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％或约90％汇合)。在其他实施方案中，在分化阶段之前不接种ES或iPS细胞。在某些实施方案中，将ES或iPS细胞重悬于分化培养基中并以期望的汇合铺板(例如，约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％或约90％汇合)。在一些实施方案中，ES或iPS细胞在生长阶段期间在
或玻连蛋白上培养。在一些实施方案中，ES或iPS
细胞在生长阶段期间在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)上培养。[0124]在一些实施方案中，生长阶段的温育时间为约1-6天(例如，约1-5天、约1-4天、约1-3天、约1-2天、约1天、约2天、约2.5天、约3天、约3.5天、约4天)。在一些实施方案中，生长阶段的温育时间发生在两个步骤，其中培养物得以接种。在一些实施方案中，生长阶段的每个步骤为约1-6天(例如，约1-5天、约1-4天、约1-3天、约1-2天、约1天、约2天、约2.5天、约3天、约3.5天、约4天)。在一些实施方案中，分化阶段持续约2、3、4、5、6或7天。[0125]在一些实施方案中，分化阶段的温育时间为约1-6天(例如，约1-5天、约1-4天、约1-3天、约1-2天、约1天、约2天、约2.5天、约3天、约3.5天、约4天)。在一些实施方案中，分化阶段的温育时间发生在两个步骤，其中培养物得以重新铺板。在一些实施方案中，分化阶段的每个步骤为约1-6天(例如，约1-5天、约1-4天、约1-3天、约1-2天、约1天、约2天、约2.5天、约3天、约3.5天、约4天)。在一些实施方案中，分化阶段持续约2、3、4、5、6或7天。[0126]干细胞分化
[0127]使用根据本发明的单细胞非聚簇方法生成的hEMP细胞可以进一步分化成各种细胞类型。
[0128]中胚层诱导
[0129]最早的CD326-CD56+hEMP细胞是在存在激活素A、BMP4、VEGF和FGF2的情况下从hESC或iPSC生成的，代表了多能中胚层定型的祖细胞群体。CD326-CD56+祖细胞在其生成所有中胚层谱系(包括造血、内皮、间充质(骨、软骨、脂肪、成纤维细胞)、平滑肌和心肌细胞)的能力中是独特的，尽管缺乏hESC或iPSC的多能性。CD326-CD56+hEMP细胞是更多受谱系限制的中胚层祖细胞的前体。
[0130]CD326-CD56+hEMP细胞可以用BMP4、VEGF和bFGF的组合以及短暂暴露于激活素A产生。
[0131]hEMP细胞的选择
[0132]ESC或iPSC转变为hEMP的特征在于CD326 EPCAM的丧失和CD56NCAM(CD326-CD56+)的获得。上皮标志物CD326在来自人胚胎干细胞系(例如H9、H1和HES3)或iPSC的未分化细胞中高水平均匀表达，而CD56在未分化的hESC或iPSC中不表达。在中内胚层诱导条件下分化后，以CD326表达的丧失和CD56的获得(CD326-CD56+)标记的群体明确可检测到。[0133]此外，在hEMP分化后，E-钙黏蛋白、CD326/TACSTD1、Claudin 3、Claudin6、Claudin 7、Syndecan 1、Syndecan 2、Beta-连环蛋白、Occludin、Nanog、Sox 2和/或OCT4可以下调。在hEMP分化后，Snail-1、Snail2/Slug、Twist 1、LEF1、ZEB1、MMP9、纤连蛋白、波形蛋白和/或ZEB2可以上调。
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可以通过本领域中已知的技术来确定hEMP细胞标志物的调节，包括蛋白质检测方
法(例如，流式细胞术、FACS、Western印迹、ELISA、HPLC、LC/MS、蛋白质免疫沉淀、免疫电泳、蛋白质免疫染色等)和核酸检测方法(例如，mRNA转录本分析、Northern印迹、cDNA、DNA微阵列分析、聚合酶链反应、基因表达谱分析等)。[0135]T细胞的分化和选择
[0136]hEMP细胞具有分化成血内皮(hematoendothelial)细胞(例如血液、内皮)、心血管(例如内皮、心肌细胞、平滑肌)和间充质(例如平滑肌、成纤维细胞、骨、软骨、脂肪)的潜力。淋巴样细胞包括T细胞、B细胞和自然杀伤细胞。T细胞起源于骨髓中的造血干细胞。来自造血干细胞的造血祖细胞(例如hEMP细胞)聚集于胸腺并通过细胞分裂而扩增以生成大量未成熟的胸腺细胞。最早的胸腺细胞既不表达CD4也不表达CD8，然而通过其发育它们进行发展，它们变成双阳性(DP)胸腺细胞(CD4+CD8+)，并最终成熟为单阳性(SP)(CD4+CD8-或CD4-CD8+)胸腺细胞，然后其从胸腺释放到周围组织。
[0137]根据本公开的增加的hEMP细胞的效率和产量导致快速且稳健的T谱系定型。在一些实施方案中，T细胞可以在ATO系统中从hEMP细胞分化。在一些实施方案中，T细胞可以使用慢病毒转导方法从hEMP细胞分化。在一些实施方案中，T细胞可以使用基质单层(stromal monolayer)从hEMP细胞分化。
[0138]CD4+CD3-未成熟的单阳性(ISP)细胞和CD4+CD8+(DP)细胞的出现表明hEMP细胞向T细胞的分化。更多成熟的CD3+TCRαβ+细胞出现，并随时间增加。与ATO中的阳性选择相一致，也可以生成较小级分的CD3+TCRγδ+T细胞，使其逐渐成熟至CD8SP，并且以较少程度成熟至CD4SP T细胞。[0139]胸腺和ATO衍生的T细胞祖细胞的流式细胞术分析可以用于评价以下表面表型：早期胸腺祖细胞(ETP；CD34+CD7-CD1a-)、CD1a-pro-T(CD34+CD7+CD1a-)和CD1a+pro-T(CD34+CD7+CD1a+)；或CD5-pro-T(pro-T1；CD34+CD7+CD5-)和CD5+pro-T(pro-T2；CD34+CD7+CD5+)。胸腺和ATO衍生的T细胞及其前体定义为CD14-CD56-，结合以下表型：总T谱系细胞(CD7+CD5+)、双阴性(DN；CD4-CD8-)、CD4未成熟的单阳性(CD4 ISP；CD5+CD4+CD3-)、双阳性(DP；CD4+CD8+)、CD8SP(CD3+TCRαβ+CD8+CD4-)、CD4SP(CD3+TCRαβ+CD8-CD4+)、未成熟的初始(CD8SP或CD4SP的CD45RA-CD45RO+)、成熟的初始(CD8SP或CD4SP的CD45RA+CD45RO-)。通过对CD1a、CD27、CD28和CCR7的共染色确认未成熟和成熟的初始表型。[0140]人工胸腺类器官(ATO)
[0141]体内遗传修饰的小鼠模型、人源化小鼠和体外系统如OP9-DLL1或最近描述的人工胸腺类器官(ATO)已显示多种途径，通过这些途径可以修饰或培养干细胞以生成期望的成熟T细胞，包括具有针对抗癌抗原的抗原受体的成熟T细胞。
[0142]根据本公开的多能干细胞和/或hEMP可以在OP9-DLL1或人工胸腺类器官(ATO)细胞培养系统中进一步分化。ATO是无血清的3维细胞培养技术，其重演T细胞分化。ATO技术具有生成现成的工程化T细胞以治疗癌症和其他疾病的潜力。
[0143]合适的人工胸腺类器官(ATO)系统支持高效的体外分化以及从脐带血、骨髓和外周血HSPC中对天然和TCR工程化的人T细胞的阳性选择。ATO衍生的T细胞表现出初始表型、多样的TCR组成以及TCR依赖性的活化和增殖。ATO衍生的工程化T细胞也成熟至初始表型，而且在体外和体内显示出抗原特异性肿瘤杀伤。因此，ATO呈现了用于生成用于过继细胞疗
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法的成熟初始和潜在非同种异体反应性工程化T细胞的有效的方法。用ATO培养系统产生工程化T细胞的示例性方法描述于例如Seet CS,He C,Bethune MT,et al.Generation of mature T cells from human hematopoietic stem/progenitor cells in artificial thymic organoids.Nature methods.2017；14(5):521-530.doi:10.1038/nmeth.4237中，其内容通过引用并入本文。
[0144]高纯度的T细胞群体易于通过机械解离从ATO收集，并可以通过标准方法进一步纯化以去除<0.5％的污染基质细胞。每干细胞或祖细胞的ATO细胞产量与接种的细胞(例如hEMP细胞)数以及输入细胞与基质细胞的比率成反比。[0145]ATO系统能够支持人T细胞从祖细胞(例如，hEMP细胞)的分化和阳性选择，同时保留关键的转化医学特性，例如适用于治疗应用的T细胞的生成的标准化的组分、可再现性和可扩展性。本公开提供了与人胸腺相比在ATO中用于T细胞分化的显著保真度的手段，其最终达到了与在胸腺和血液中发现的那些相似的真正的初始T细胞的出现。[0146]根据本公开提供具有祖细胞的ATO支持人T细胞的稳健的体外分化、阳性选择和成熟。ATO衍生的成熟T细胞表现出抗原初始表型、多样的TCR组成以及响应于抗原刺激的活化/增殖。ATO还支持从对肿瘤相关抗原具有特异性的祖细胞高效分化TCR工程化改造的抗原特异性T细胞。[0147]细胞
[0148]可以通过本领域已知的任何来源获得本公开的细胞。例如，可以在体外从造血干细胞群或多能干细胞分化T细胞，或者可以从受试者获得T细胞。可以从例如外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织以及肿瘤获得T细胞。此外，T细胞可以衍生自本领域中可获得的一个或多个T细胞系。也可以使用本领域技术人员已知的任何数目的技术(例如FICOLLTM分离和/或单采术(apheresis))从收集自受试者的血液单位获得T细胞。在某些实施方案中，通过单采术收集的细胞经洗涤以去除血浆级分，并且放置于适当的缓冲液或介质中以进行后续处理。在一些实施方案中，用PBS洗涤细胞。如应当领会的，可以例如通过使用半自动无逆流离心机(例如CobeTM 2991细胞处理器，Baxter CytoMateTM等)来使用洗涤步骤。在一些实施方案中，将经洗涤的细胞重悬于一种或多种生物相容性缓冲液，或含有或不含有缓冲液的其他盐溶液中。在某些实施方案中，单采样品中不期望的组分得以去除。分离用于T细胞疗法的T细胞的另外的方法公开于美国专利公开号2013/0287748中，其以其整体通过引用并入本文。[0149]在某些实施方案中，通过溶解红细胞和消耗单核细胞(例如经由PERCOLLTM梯度，通过使用离心来分离)从PBMC分离干细胞。在一些实施方案中，可以通过本领域中已知的阳性或阴性选择技术进一步分离T细胞的特定亚群，例如CD4+、CD8+、CD28+、CD45RA+和CD45RO+T细胞。例如，可以用针对阴性选择的细胞所特有的表面标志物的抗体组合来完成通过阴性选择进行的T细胞群的富集。在一些实施方案中，可以使用细胞分选和/或经由负磁性免疫黏附或流式细胞术(其使用针对存在于经阴性选择的细胞上的细胞表面标志物的单克隆抗体混合物)的选择。例如，为了通过阴性选择来富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对CD8、CD11b、CD14、CD16、CD20和HLA-DR的抗体。在某些实施方案中，使用流式细胞术和细胞分选来分离用于本公开中的感兴趣的细胞群。[0150]在一些实施方案中，通过鉴别与CD8+细胞的初始细胞、干细胞记忆细胞、中央记忆
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细胞、效应记忆细胞和效应细胞类型中每种相关联的细胞表面抗原来将CD8+细胞进一步分选成初始细胞、干细胞记忆细胞、中央记忆细胞、效应记忆细胞和效应细胞。在一些实施方案中，中央记忆T细胞的表型标志物的表达包括CCR7、CD3、CD28、CD45RO、CD62L和CD127并且为颗粒酶B阴性。在一些实施方案中，中央记忆T细胞为CD8+、CD45RO+和CD62L+T细胞。在一些实施方案中，效应T细胞为CCR7、CD28、CD62L和CD127阴性并且为颗粒酶B和穿孔素阳性。在某些实施方案中，将CD4+T细胞进一步分选成亚群。例如，可以通过鉴别具有细胞表面抗原的细胞群将CD4+T辅助性细胞分选为初始细胞、中央记忆细胞和效应细胞。[0151]在一些实施方案中，在分离后使用已知的方法进行遗传修饰免疫细胞例如T细胞，或者免疫细胞在经遗传修饰前在体外活化和扩增(或者，在祖细胞的情况下分化)。在另一个实施方案中，在诱导为hEMP之前修饰多能干细胞。在另一个实施方案中，通过ATO处理经转导的hEMP。在另一个实施方案中，免疫细胞例如T细胞以嵌合抗原受体或TCR进行遗传修饰(例如用包含一个或多个编码CAR或TCR的核苷酸序列的病毒载体转导)，并然后在体外活化和/或扩增。用于活化和扩增T细胞的方法为本领域所已知并描述于例如美国专利号6,905,874、6,867,041和6,797,514；以及PCT公开号WO 2012/079000中，其内容以其整体在此通过引用并入。一般而言，此类方法包括将PBMC或分离的T细胞在具有适当的细胞因子(例如IL-2)的培养基中与刺激剂和共刺激剂(例如抗CD3和抗CD28抗体，通常黏附在珠子或其他表面)接触。黏附在相同珠子上的抗CD3和抗CD28抗体充当“替代”抗原呈递细胞(APC)。一个实例为
系统，用于生理活化人T细胞的CD3/CD28活化剂/刺激剂系统。在其
他实施方案中，使用例如美国专利号6,040,177、5,827,642以及PCT公开号WO 2012/129514(其内容以其整体在此通过引用并入)中描述的方法，以饲养细胞以及适当的抗体和细胞因子活化并刺激T细胞以进行增殖。[0152]在某些实施方案中，从供体受试者获得T细胞。在一些实施方案中，供体受试者为患有癌症或肿瘤的人类患者。在其他实施方案中，供体受试者为未患有癌症或肿瘤的人类患者。
[0153]本公开的其他方面涉及包含本文所述的多核苷酸、本文所述的载体、本文所述的多肽或本文所述的体外细胞的组合物。在一些实施方案中，组合物包含药学上可接受的载体、稀释剂、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂。在一些实施方案中，组合物包含赋形剂。[0154]在其他实施方案中，组合物经选择以用于肠胃外递送、用于吸入或用于通过消化道递送，例如口服。制备此类药学上可接受的组合物在本领域技术人员的能力内。在某些实施方案中，缓冲液用于将该组合物维持在生理pH或稍低的pH，通常在约5至约8的pH范围内。在某些实施方案中，当考虑肠胃外施用时，组合物为无热原、肠胃外可接受的水溶液形式，其包含在药学上可接受的媒介物中的具有或不具有另外的治疗剂的本文所述的组合物。在某些实施方案中，用于肠胃外注射的媒介物为无菌蒸馏水，其中将本文所述的组合物(具有或不具有至少一种另外的治疗剂)配制成经适宜保存的无菌的等渗溶液。在某些实施方案中，制备牵涉具有提供产品受控或持续释放的聚合化合物(例如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠子或脂质体的所期望的分子的制剂，然后该制剂经由贮存注射(depot injection)来递送。在某些实施方案中，使用可植入的药物递送装置来引入所期望的分子或细胞。[0155]癌症治疗
[0156]本公开的方法可以用于治疗受试者中的癌症、缩小肿瘤尺寸、杀伤肿瘤细胞、防止
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肿瘤细胞增殖、防止肿瘤生长、从患者消除肿瘤、防止肿瘤复发、防止肿瘤转移、诱导患者缓解或其任何组合。在某些实施方案中，方法诱导完全应答。在其他实施方案中，方法诱导部分应答。
[0157]可以治疗的癌症包括未血管化、基本上尚未血管化或血管化的肿瘤。癌症也可以包括实体瘤或非实体瘤。在一些实施方案中，癌症为血液学癌症。在一些实施方案中，癌症为白细胞的癌症。在其他实施方案中，癌症为浆细胞的癌症。在一些实施方案中，癌症为白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。在某些实施方案中，癌症为急性淋巴母细胞白血病(ALL)(包括非T细胞ALL)、急性淋巴样白血病(ALL)和噬血细胞性淋巴组织细胞增生症(HLH)、B细胞幼淋巴细胞白血病、B细胞急性淋巴样白血病(“BALL”)、母细胞性浆细胞样树突状细胞赘生物、伯基特淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性髓样白血病(CML)、慢性或急性肉芽肿病、慢性或急性白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤(FL)、毛细胞白血病、噬血细胞综合征(巨噬细胞活化综合征(MAS))、霍奇金病、大细胞肉芽肿、白细胞黏附缺陷、恶性淋巴增生性状况、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、意义不明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征(MDS)、髓样疾病包括但不限于急性髓样白血病(AML)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、浆细胞增生性病症(例如无症状性骨髓瘤(冒烟型多发性骨髓瘤或惰性骨髓瘤)、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞赘生物、浆细胞瘤(例如浆细胞恶液质；单发性骨髓瘤；单发性浆细胞瘤；髓外浆细胞瘤；和多发性浆细胞瘤)、POEMS综合征(Crow-Fukase综合征；Takatsuki病；PEP综合征)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBC)、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤(SMZL)、系统性淀粉样蛋白轻链淀粉样变、T细胞急性淋巴样白血病(“TALL”)、T细胞淋巴瘤、转化滤泡性淋巴瘤或瓦氏巨球蛋白血症，或其组合。
[0158]在一个实施方案中，癌症为骨髓瘤。在一个具体的实施方案中，癌症为多发性骨髓瘤。在另一个实施方案中，癌症为白血病。在一个实施方案中，癌症为急性髓样白血病。[0159]在一些实施方案中，方法进一步包括施用化疗剂。在某些实施方案中，选择的化疗剂是淋巴消减(预调理)化疗剂。有益的预调理治疗方案以及相关的有益生物标志物描述于美国临时专利申请62/262,143和62/167,750中，其以其整体通过引用并入本文。这些描述了例如调理需要T细胞疗法的患者的方法，包括对患者施用指定的有益剂量的环磷酰胺(200mg/m2/天和2000mg/m2/天之间)和指定剂量的氟达拉滨(20mg/m2/天和900mg/m2/天之间)。一个此类剂量方案牵涉治疗患者，包括每天向患者施用约500mg/m2/天的环磷酰胺和约60mg/m2/天的氟达拉滨，持续3天，然后向患者施用治疗有效量的工程化T细胞。[0160]在其他实施方案中，抗原结合分子、经转导的(或以其他方式工程化的)细胞(例如CAR或TCR)和化疗剂各自以有效治疗受试者中疾病或状况的量施用。[0161]在某些实施方案中，包含本文公开的表达CAR和/或TCR的免疫效应细胞的组合物可以与任何数目的化疗剂联合施用。化疗剂的实例包括烷化剂类(alkylating agents)，如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺(cyclophosphamide)(CYTOXANTM)；磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates)，如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美多巴(meturedopa)和乌多巴(uredopa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类
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(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphaoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine resume)；氮芥类(nitrogen mustards)，如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，如阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、authramycin、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、加利车霉素(calicheamicin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、5-FU；雄激素类，如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，如亚叶酸(folinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；曲布赛(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；defofamine；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elformithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；雷佐生(razoxane)；西索菲兰(sizofiran)；螺旋锗
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(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2”-三氯三乙胺；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托辛(gacytosine)；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇(taxoids)，例如帕利他塞(paclitaxel)(TAXOLTM,Bristol-Myers Squibb)和多西他塞(doxetaxel)(
Rhone-Poulenc Rorer)；苯丁酸
氮芥(chlorambucil)；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；铂类似物，如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；丝裂霉素C；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱；长春瑞滨；诺维本(navelbine)；能灭瘤(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；xeloda；伊本膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维A酸(retinoic acid)衍生物，如TargretinTM(贝沙罗汀(bexarotene))、PanretinTM、(阿利维A酸(alitretinoin))；ONTAKTM(地尼白介素(denileukin diftitox))；埃斯培拉霉素(esperamicin)；卡培他滨(capecitabine)；和上述任何物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在一些实施方案中，包含本文公开的表达CAR和/或TCR的免疫效应细胞的组合物可以与抗激素剂联合施用，所述抗激素剂作用为调节或抑制激素对肿瘤的作用，如抗雌激素，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、芳香酶抑制性4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、奇沃昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)(Fareston)；和抗雄激素如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；和上述任何物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在适当的情况下也施用化疗剂的组合，包括但不限于CHOP，即环磷酰胺多柔比星)、长春新碱
[0162]
多柔比星(羟基
和泼尼松。
在一些实施方案中，在施用工程化细胞或核酸同时或之后一周内施用化疗剂。在其他实施方案中，在施用工程化细胞或核酸后1至4周，1周至1个月，1周至2个月，1周至3个月，1周至6个月，1周至9个月或1周至12个月施用化疗剂。在一些实施方案中，在施用细胞或核酸之前至少1个月施用化疗剂。在一些实施方案中，该方法进一步包括施用两种或更多种化疗剂。
[0163]多种另外的治疗剂可以与本文所述的组合物联合使用。例如，潜在有用的另外的治疗剂包括PD-1抑制剂，例如纳武单抗(nivolumab)(pembrolizumab)
派姆单抗
派姆单抗、匹地利珠单抗(pidilizumab)(CureTech)
和阿特珠单抗(atezolizumab)(Roche)。
[0164]适合于与本公开组合使用的另外的治疗剂包括但不限于伊布替尼(ibrutinib)
奥法木单抗(ofatumumab)贝伐单抗(bevacizumab)
利妥昔单抗(rituximab)曲妥珠单抗(trastuzumab)
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恩星曲妥珠单抗(trastuzumab emtansine)
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伊马替帕尼单抗
尼(imatinib)(panitumumab)
西妥昔单抗(cetuximab)
卡妥索单抗(catumaxomab)、替伊莫单抗(ibritumomab)、
奥法木单抗、托西莫单抗(tositumomab)、本妥昔单抗(brentuximab)、阿仑单抗
(alemtuzumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、厄洛替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、凡德他尼(vandetanib)、阿法替尼(afatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、来那替尼(neratinib)、阿昔替尼(axitinib)、马赛替尼(masitinib)、帕唑帕尼(pazopanib)、舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)、托西尼布(toceranib)、来他替尼(lestaurtinib)、阿昔替尼(axitinib)、西地尼布(cediranib)、乐伐替尼(lenvatinib)、尼达尼布(nintedanib)、帕唑帕尼(pazopanib)、瑞格非尼(regorafenib)、司马沙尼(semaxanib)、索拉非尼、舒尼替尼、替瓦沙尼(tivozanib)、托西尼布、凡德他尼、恩曲替尼(entrectinib)、卡博替尼(cabozantinib)、伊马替尼、达沙替尼(dasatinib)、尼洛替尼(nilotinib)、帕纳替尼(ponatinib)、雷多替尼(radotinib)、博舒替尼(bosutinib)、来他替尼、鲁索替尼(ruxolitinib)、帕利替尼(pacritinib)、考比替尼(cobimetinib)、司美替尼(selumetinib)、曲美替尼(trametinib)、必尼美替尼(binimetinib)、阿雷替尼(alectinib)、色瑞替尼(ceritinib)、克唑替尼(crizotinib)、阿柏西普(aflibercept)、阿迪波太(adipotide)、地尼白介素、mTOR抑制剂如依维莫司(Everolimus)和西罗莫司(Temsirolimus)、hedgehog抑制剂如索尼得吉(sonidegib)和维莫得告(vismodegib)、CDK抑制剂如CDK抑制剂(帕博西尼(palbociclib))。[0165]在另外的实施方案中，包含含有CAR和/或TCR免疫的组合物与抗炎剂一起施用。抗炎剂或药物可以包括但不限于类固醇和糖皮质激素(包括倍他米松(betamethasone)、布地奈德(budesonide)、地塞米松(dexamethasone)、乙酸氢化可的松、氢化可的松、氢化可的松、甲泼尼龙(methylprednisolone)、泼尼松龙(prednisolone)、泼尼松(prednisone)和曲安西龙(triamcinolone))、非类固醇类消炎药(NSAIDS)，包括阿司匹林(aspirin)、布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、甲氨蝶呤、柳氮磺胺吡啶、来氟米特(leflunomide)、抗TNF药物、环磷酰胺和麦考酚酯(mycophenolate)。示例性的NSAID包括布洛芬、萘普生、萘普生钠、Cox-2抑制剂和唾液酸化物(sialylate)。示例性镇痛剂包括扑热息痛(acetaminophen)、羟考酮(oxycodone)和盐酸丙氧芬的曲马多(tramadol of proporxyphene hydrochloride)。示例性糖皮质激素包括可的松、地塞米松、氢化可的松、甲泼尼龙、泼尼松龙或泼尼松。示例性生物反应调节剂包括针对细胞表面标志物(例如CD4、CD5等)的分子、细胞因子抑制剂如TNF拮抗剂，(例如依那西普(etanercept)阿达木单抗(adalimumab)
和英夫利昔单抗(infliximab)
趋化因子抑制剂和黏附分子抑制剂。生物反应调节剂包括单克隆抗体以及重组形式的分子。示例性的DMARD包括硫唑嘌呤(azathioprine)、环磷酰胺、环孢菌素、甲氨蝶呤、青霉胺、来氟米特、柳氮磺胺吡啶、羟氯喹、Gold(口服(金诺芬(auranofin))和肌内)和米诺环素(minocycline)。
[0166]在某些实施方案中，本文所述的组合物与细胞因子联合施用。如本文所用，“细胞
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因子”意指由一种细胞群释放的、作为细胞间介质对另一种细胞起作用的蛋白质。细胞因子的实例是淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。细胞因子中包括生长激素，如人生长激素，N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和黄体生成素(LH)；肝生长因子(HGF)；成纤维细胞生长因子(FGF)；催乳素；胎盘催乳激素；缪勒管抑制物质(mullerian-inhibiting substance)；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整合素；血小板生成素(TPO)；神经生长因子(NGF)如NGF-beta；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)如TGF-alpha和TGF-beta；胰岛素样生长因子-I和-II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素如干扰素-alpha、beta和-gamma；集落刺激因子(CSF)，如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(G-CSF)；白细胞介素(IL)，如IL-1、IL-1alpha、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；IL-15，肿瘤坏死因子如TNF-alpha或TNF-beta；和其他多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。如本文所用，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质，以及天然序列细胞因子的生物活性等同物。
[0167]本公开的另一个方面涉及诱导针对肿瘤的免疫力的方法，其包括向受试者施用有效量的本文公开的经修饰的T细胞。本公开的另一方面涉及诱导受试者中免疫应答的方法，其包括施用有效量的本申请的经工程化改造的免疫细胞。在一些实施方案中，免疫应答为T细胞介导的免疫应答。在一些实施方案中，T细胞介导的免疫应答针对一种或多种靶细胞。在一些实施方案中，经工程化改造的免疫细胞包含CAR或TCR，其中CAR或TCR包含本公开中描述的THD。在一些实施方案中，靶细胞为肿瘤细胞。
[0168]本公开的另一方面涉及用于治疗或预防恶性肿瘤的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用有效量的至少一种免疫细胞，其中免疫细胞包含至少一种CAR或TCR。[0169]本公开的另一方面涉及治疗有此需要的受试者中癌症的方法，其包括向受试者施用本文所公开的多核苷酸、载体、CAR或TCR、细胞或组合物。在一个实施方案中，方法包括施用编码CAR或TCR的多核苷酸。在另一个实施方案中，方法包括施用包含编码CAR或TCR的多核苷酸的载体。在另一个实施方案中，方法包括施用由本文所公开的多核苷酸编码的CAR或TCR。在另一个实施方案中，方法包括施用包含编码CAR或TCR的多核苷酸或包含编码CAR或TCR的多核苷酸的载体的细胞。[0170]在一些实施方案中，从患者获得用于T细胞疗法中的供体T细胞(例如用于自体T细胞疗法)。在其他实施方案中，从非患者的受试者获得用于T细胞疗法中的待分化为T细胞的供体干细胞。
[0171]T细胞可以以治疗有效量施用。例如，T细胞的治疗有效量可以为至少约104个细胞、至少约105个细胞、至少约106个细胞、至少约107个细胞、至少约108个细胞、至少约109个细胞或至少约1010个细胞。在另一个实施方案中，T细胞的治疗有效量为约104个细胞、约105个细胞、约106个细胞、约107个细胞或约108个细胞。在一个具体的实施方案中，CAR T细胞或TCR T细胞的治疗有效量为约2X 106个细胞/kg、约3X 106个细胞/kg、约4X 106个细胞/kg、约5X 106个细胞/kg、约6X 106个细胞/kg、约7X 106个细胞/kg、约8X 106个细胞/kg、约9X 106个细胞/kg、约1X 107个细胞/kg、约2X 107个细胞/kg、约3X 107个细胞/kg、约4X 107个细胞/kg、约5X 107个细胞/kg、约6X 107个细胞/kg、约7X 107个细胞/kg、约8X 107个细胞/kg
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或约9X 107个细胞/kg。[0172]免疫耐受
[0173]本公开的方法可以用于治疗受试者的免疫耐受性疾病。在某些实施方案中，方法诱导完全应答。在其他实施方案中，方法诱导部分应答。
[0174]中枢或外周耐受性不足可以引起自身免疫性疾病，导致综合征如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、1型糖尿病、自身免疫性多内分泌综合征1型(APS-1)和免疫失调多内分泌病肠病X连锁综合征(IPEX)，并可能导致哮喘、过敏和炎症性肠病。免疫耐受在移植排斥(例如，干细胞移植、肾移植、肝移植等)中也可能有问题。[0175]本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体和单独地指出通过引用并入。然而，本文引用的参考文献不应解释为承认此类参考文献是本公开的现有技术。在通过引用并入的参考文献中提供的任何定义或术语与本文提供的术语和讨论不同的程度上，以本发明的术语和定义为准。
[0176]通过以下实施例进一步说明本公开，所述实施例不应解释为进一步限制。本申请中引用的所有参考文献的内容通过引用明确地并入本文。实施例
[0177][0178][0179]
实施例1：聚簇和单细胞之间hEMP诱导的比较
该实施例说明了聚簇和单细胞之间的hEMP诱导的比较。对成簇的ES细胞的汇合平板进行手动传代，并将其以相当于孔的20％、40％和
包被的6孔板中。另外，通过酶消化化学破坏ES细胞的汇合平板并计
80％铺板到
数以确定细胞数/表面积。将单细胞以1.8x106(20％汇合)、3.6x106(40％汇合)和7.2x106
(80％汇合)接种。在已知将ES细胞维持在未分化状态的mTeSR1培养基(作为对照)或在X-VIVOTM-15hEMP推进培养基中培养细胞。在所有条件下，小分子Y27632 ROCK抑制剂都包括在内以帮助传代期间ES细胞的存活。在d1、d2、d3和d4收获处于所有条件下的细胞。实验图如表1、2和3中所示。[0180]表1
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[0181]
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转变为hEMP的ES细胞的特征在于CD326 EPCAM的丧失和CD56 NCAM的获得。基于表
面表达的CD326和CD56的变化的表型分析表明，在6孔板中以1.8-7.2x106个细胞/孔或2.53-7.58x105个细胞/cm2的最佳密度生成hEMP的方面，单细胞方法比基于聚簇的方法的更高效。示例性流式细胞术数据和摘要图分别显示于图1和图2中，其说明表面表达的CD326和CD56的变化。生成hEMP细胞的示例性过程显示于图3中。
[0184][0185]
实施例2：和玻连蛋白在中胚层推进中的比较以及细胞扩增的评估
或玻连蛋白的情况下hEMP诱导的比较。为了研
的效果，进行了中胚
本实施例提供了在存在
究从hEMP诱导过程中去除小鼠肉瘤细胞产生的不确定产物层推进实验。
[0186]
将单细胞以5％或40％汇合接种在用(组织培养物处理的板)或重组人
玻连蛋白(非组织培养物处理的板)包被的6孔板中。细胞生长3天，然后将一部分细胞传代并以5％或40％的密度重新铺板在新鲜包被的平板上，并且再生长3天。收获细胞并评价CD326和CD56表达。实验设计的总结显示于图4中。[0187]表4
[0188]
[0189]如图4中所示，在所有测试的实验条件下，观察到和玻连蛋白包被的表
面之间的相当的hEMP表型。作为在其上从ES细胞分化hEMP的基质，重组人玻连蛋白至少与
相当。有趣的是，如表5和表6中所总结的，在d3时，将40％的初始接种密度分裂为
5％密度允许从输入ES细胞的数量hEMP约10倍(13.31)的扩增。包括接种步骤的生成hEMP细
胞的示例性过程显示于图5中。
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[0190]
实施例3：hEMP细胞分化为T细胞
[0192]根据本公开的非聚簇的细胞方法生成的hEMP细胞可以用于增加体外系统(例如，ATO系统)中T细胞分化的效率。如所述诱导hEMP细胞，并在FACSAria Fusion(BD)上进行分选。非hEMP和hEMP两者的分选后纯度均确定为>95％(图6)。使用无血清ATO培养基(“RB27”)诱导T细胞分化，该培养基由RPMI 1640(Corning，Manassas，VA)、2％XenoFree B27(ThermoFisher Scientific，Grand Island，NY)、重构于PBS中的30μM L-抗坏血酸2-磷酸倍半镁盐水合物(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)、1％青霉素/链霉素(Gemini Bio-Products，West Sacramento，CA)、1％Glutamax(ThermoFisher Scientific，Grand Island，NY)、5ng/ml rhFLT3L、5ng/ml rhIL-7和50ng/ml SCF(Peprotech，Rocky Hill，NJ)组成。2％XenoFree B27代替了B27。
[0193]将每ATO的0.5x106个MS5-hDL4细胞与1x104个纯化的hEMP细胞在50ml锥形瓶中合并，并在吊桶式离心机中以500g离心5分钟。小心地除去上清液，并通过短暂涡旋将细胞沉淀重悬。对于每个ATO，将0.4μm Millicell跨孔插入物(EMD Millipore，Billerica，MA；Cat.PICM0RG50)置于每孔含1ml RB27的6孔板中。为了铺板ATO，取出插入物，将其放在平板的边缘以排出多余的培养基。将细胞浆调整至5μl每ATO，用20μl移液器吸头吸取，并通过在移液器吸头末端形成液滴进行铺板，将其轻柔沉积在细胞插入物上。将细胞插入物放回含有1mL RB27的孔中。每3-4天通过从细胞插入物周围抽吸，然后用1ml新鲜RB27/细胞因子替换来完全更换培养基。以这种方式培养ATO长达8周。通过向每个孔添加FACS缓冲液(PBS/0.5％牛血清白蛋白/2mM EDTA)收获ATO细胞，并通过移液短暂地解聚ATO，然后通过70μm尼龙滤网传代。
[0194]将收获的细胞用针对以下抗原的抗体染色：CD45、CD56、CD3、CD4、CD8、TCRab(Biolegend)，在黑暗中于4C进行30分钟的染色。用PBS洗涤细胞，并在Fortessa X20(BD)上进行分析以用于分析T细胞发育。第4周时的细胞的实例显示于图7中。
[0191]
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