第４４卷第２期 ２０ｌ４年４月 精细化工中间体 ＦＩＮＥ ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＩＮＴＥＲＭＥＤＩＡＴＥＳ Ｖ０Ｉ．４４ Ｎｏ．２ Ａｐｒｉｌ ２０１４ ，■■■■●●■■■■■■■■■■●●＾ １分析与测试ｌ ’■■■■■●■■■■■■■■■■●■’■■■● ＨＰＬＣ测定Ⅳ一（Ⅳ一苯甲酰基一Ｏ一苯甲酰基一 一酪氨酰基）－Ｌ一苯 丙氨醇及其三种杂质 曹佩雪’。安 巧 ，梁光义’，黄正明 ，刘昌孝。，胡占兴 （１．贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室，贵州贵阳 ５５０００２；２．中国人民解放军第三。二医院， 北京１０ｏ０３９：３．天津药物研究院，天津５６１０００） ３００１９３；４．贵州百灵企业集团制药股份有限公司，贵州安顺 摘 要：建立了Ｙ１０１中间体Ⅳ－（Ⅳ＿苯甲酰基一Ｄ一苯甲酰基一 一酪氨酰基）一 一苯丙氨醇（Ｍ０５７）及其已知 杂质的含量测定方法。采用液相色谱质谱联用技术（ＨＰＬＣ／ＭＳ），正离子扫描模式指认杂质峰；采用高效 液相色谱（ＨＰＬＣ）外标法，以甲醇一水（ｖ：ｖ＝７５：２５）洗脱，测定Ｍ０５７含量，以甲醇一０．０１％磷酸水溶液梯 度洗脱，测定３个已知杂质含量。测定结果：Ｍ０５７含量不低于７７％，已知杂质总量未超过４．５％。本法已 作为该中间体质量内控方法。 关键词：ＨＰＬＣ／ＭＳ；Ⅳ＿（Ⅳ一苯甲酰基一Ｄ一苯甲酰基 一酪氨酰基）一Ｌ一苯丙氨醇；杂质 中图分类号：Ｒ９２７．２ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００９—９２１２（２０１４）０３—００６５—０５ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎ—ｆＮ－ｂｅｎｚｏｙｌ－Ｏ－ｂｅｎｚｏｙｌ—Ｌ—ｔｙｒｏｓｙ１）－Ｌ－ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｏｌ ａｎｄ Ｔｈｒｅｅ Ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ ｂｙ ＨＰＬＣ，ＭＳ ＣＡ０ Ｐｅｉ－ｘｕｅ１，ＡＮ Ｑｉａｏ４，ＬＩＡＮＧ Ｇｕａｎｇ－ｙｉ￣，ＨＵＡＮＧ Ｚｈｅｎｇ－ｍｉｎ￣，ＬＩＵ Ｃｈａｎｇ－ｘｉａｏ３，ＨＵＺｈａｎ－ｘｉｎｇ￣ （１．Ｔｈｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｆｏｒ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ ａｎｄ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｇｕｉｙａｎｇ ５５０００２，Ｃｈｉｎａ；２．３０２ Ｈｏｓｐｉｔｌａ ｏｆ ＰＬＡ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００３９，Ｃｈｉｎａ；３．Ｔｉａｎｊｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｔｉａｎｊｉｎ ３００１９３，Ｃｈｉｎａ；４．Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｂａｉｌｉｎｇ Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ Ｇｒｏｕｐ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ａｎｓｈｕｎ ５６１０００， Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｎ—ｒⅣ一Ｂｅｎｚｏｙｌ—Ｏ－ｂｅｎｚｏｙｌ－Ｌ－ｔｙｒｏｓｙ１）－Ｌ－ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｏｌ（Ｍ０５７），ａｎ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｆｏｒ ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ Ｙ１０１， ａｎｄ ｔｈｒｅｅ ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ ｃｏ—ｅｘｉｓｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｍ０５７ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ＨＰＬＣ／ＭＳ．Ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｉｏｎ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｕｓｉｎｇ ｍｅｔｈａｎｏｌ－０．０１％ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ ａｃｉｄ ａｓ ｔｈｅ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｅｌｕｔｉｏｎ．Ａｎ ｅｘｔｅｒｎａｌ ｓｔａｎｄａｒｄ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｍ０５７ ｗｉｔｈ ｍｅｔｈａｎｏｌ－ｗａｔｅｒ￣：ｖ＝７５：２５） ａｓ ｔｈｅ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ．Ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｕｓｅｄ ａｓ ａ ｓｔａｎｄａｒｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｍ０５７． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ＨＰＬＣ／ＭＳ；Ｎ－（Ｎ－ｂｅｎｚｏｙｌ－Ｏ－ｂｅｎｚｏｙｌ－Ｌ－ｔｙｒｏｓｙ１）－Ｌ－ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｏｌ；ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ １前言 得的二肽衍生物…，具有良好的抗ＨＢＶ和保肝降 苯丙氨酸二肽类化合物Ｙ１０１（临床批件号： 酶作用［２－５］。化合物Ⅳ＿（Ⅳ－苯甲酰基一Ｄ一苯甲酰基一 一２０１３Ｌ０２４９１）是从苗族药马蹄金中分离、设计所 酪氨酰基） 一苯丙氨醇［代号Ｍ０５７，为（２Ｓ， 基金项目：“十二五”国家重大新药创制科技重大专项（２０１１ｚｘｏ９１０２—００９—００２），贵州省中药现代化科技产业研究开发专项（黔科合中药 字［２ｏ１２］５０５４）。 作者简介：曹佩雪（１９７３一），女，贵州贵阳人，助理研究员，研究方向：药物分析（Ｅ—ｍａｉｌ：ｓｎｏｗｅｐｘ＠１２６．ｃｏｒｎ）。 联系人：胡占兴，男，助理研究员，研究方向：新药研发（Ｅ—ｍａｉｌ：ｈｕｚｈｘｉ８８＠１６３．ｃｏｒｎ）。 收稿日期：２０１４—０３—２１ 精细化工中间体 第４４卷 ２ Ｓ）构型］是制备Ｙ１０１重要的新结构中间体，其 中含多种杂质．可对后续产品质量产生直接影响。 因此需对本品及其杂质进行必要的质量控制研究。 笔者依据该中间体合成路线．采取多种分离提取及 分析方法实现了其中３个杂质单体的富集及结构确 证．分别为副产物Ⅳ一苯甲酰基一 一苯丙氨醇 （ＢＢ）、Ⅳ＿（＾Ｌ苯甲酰基 一酪氨酰基） 一苯丙氨醇 （Ａ０５９）以及未反应完全的底物Ⅳ＿苯甲酰基一Ｄ一苯 甲酰基一 一酪氨酸（Ａ０４２），这３个杂质也通过合 成方法制备得到［ 。其结构式如下。 ＢＢ Ｈ Ａ０５９ Ａ０４２ 笔者课题组对Ｍ０５７的质量控制进行了研究， 已经建立了其异构体的检测方法［ ，建立了主成分 及３个杂质的定量方法。 ２实验部分 ２．１仪器与试剂 仪器：ＨＰ１１００型高效液相色谱仪（自动进样 器，ＶＷＤ检测器，美国ＨＰ公司）、ＨＰ１１００ＭＳＤ质 谱联用仪（美国ＨＰ公司）、ＨＰ １１００型高效液相色 谱仪（自动进样器，ＤＡＤ检测器，美国ＨＰ公司）、 梅特勒一托利多ＡＧ２８５型电子分析天平（美国梅特 勒一托利多公司）、ＫＱ一３００ ＤＡ型超声波清洗器 （２５０ Ｗ，４０ ｋＨｚ，昆山市超声仪器有限公司）。 试剂：Ｍ０５７对照品（批号２０１１０４０８—１，纯度 不低于９９．５％）．已知杂质对照品及中间体中试样 品均为自制。甲醇（色谱纯）、水（纯净水），其余 试剂均为ＡＲ。 ２．２ 实验步骤 ２．２．１色谱峰指认 由于该中间体杂质较多，为判定已知杂质或主 成分在相应的出峰位置是否受到其他杂质峰的干 扰，通过质谱提供的离子碎片信息结合对照品峰保 留时间来确定。采用加酸的流动相洗脱，杂质质谱 峰响应较弱，改用缓冲盐系统，质谱响应信号明显 增大，便于杂质的指认。 液质联用条件：Ｐｈｅｍｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ—ＮＸ Ｃ１８ 柱（４．６￣２５０ ｍｍ，５ ｉｘｍ）；流动相甲醇一０．２ ｍｏｌ／Ｌ 乙酸铵水溶液（含１％乙酸， ：／３＝５０：５０）；流速 ０．８ ｍＬ／ｍｉｎ；检测波长２２８ ｎｍ；柱温３ＯｏＣ；进样 量５ Ｌ。质谱ＥＳＩ正离子扫描模式，扫描范围： ｍ／ｚ １００－１ ３００。 经检测样品中与对照品出峰位置相同的３个杂 质峰『Ｍ＋Ｈ］ 质荷比与对照品一致，为２５６．０、 ４１９．０、３９０．０，各对应为杂质ＢＢ、Ａ０５９及Ａ０４２， 主峰Ｍ０５７［Ｍ＋Ｈ］ 质荷比５２３．０（图２、图３）。 ∞∞∞∞∞ｏ ０ ５ １０ １５ ２０ ２５ ３０ ３５ ４０ 一品∞∞∞∞加０ ０ ５ １０ １５ 一２０ ２５ ３０ ３５ ４０ 时问／ｍｉｎ 时间／ｍｉｎ 图２正离子扫描模式下的总离子流图 Ｆｉｇ．２ ＨＰＬＣ－ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ－ｔｏｔａｌ ｉｏｎ ｃｕｒｅｎｔ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓ ｉｎ ｐｏｓｉｉｔｖｅ ｉｏｎ ｍｏｄｅ ０ ｌＯＯ ８Ｏ ６０ ４０ ２Ｏ Ｏ ２５０ ５００ ７５０ １０００ ｍ／ｚ ｍ？ｚ ３９０ ４００ ４ｌ０ ４２０ ４３０ ５２０ ５３０ ５４０ ＩＴＩ／ｚ ｍ／ｚ 图３正离子扫描模式下的Ｍ０５７及已知杂质质谱图 Ｆｉｇ．３ ＭＳ ｓｐｅｃｔｒａｓ ｏｆ Ｍ０５７ ａｎｄ ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎ ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｉｏｎｍｏｄｅ ２．２．２ Ｍ０５７含量测定条件及供试液制备 色谱条件：ＳｉｎｏＣｈｒｏｍ ＯＤＳ—ＡＰ分析柱（４．６× ２５０ ｍｍ，５ ｔｘｍ）；流动相甲醇一水（ｖ：ｖ＝７５：２５）；流 速１．０ ｍＬ／ｍｉｎ；检测波长（ＶＷＤ检测器）２３１ ｎｍ； 柱温３０ｏＣ；进样量１Ｏ Ｌ。 Ｍ０５７对照品溶液制备：取Ｍ０５７对照品２０ ｍｇ， 精密称定，置１０ ｍＬ量瓶中，加二氯甲烷一甲醇 （口： ＝１：１）超声处理使溶解完全，定容至刻度，摇 匀．从中精密吸取适量加甲醇稀释ｌＯ倍，作为对 第３期 曹佩雪，等：ＨＰＬＣ测定＾ｒ．（Ⅳ一苯甲酰基一０一苯甲酰基 一酪氨酰基） 一苯丙氨醇及其三种杂质 ６７ 照品储备液。 不低于４ ０００，结果见图４～图６。 供试品溶液制备：取中间体样品。研细，取约 ２０ｍｇ，精密称定，置１０ｍＬ量瓶中，加二氯甲烷一 ＼ 甲醇（ ： ：１：１）超声处理使溶解完全，定容至刻 度，从中精密吸取适量加甲醇稀释成浓度约０．２ ｍｇ／ｍＬ的样品溶液，取续滤液，即得。 ２．２．３杂质ＢＢ、Ａ０５９、Ａ０４２含量测定条件及试验 越 督 ２００ ２２５ ２５０ ２７５ ３００ ３２５ ３５０ 波长／ｎｍ 溶液制备 色谱柱：ＳｉｎｏＣｈｒｏｍ ＯＤＳ—ＡＰ柱（４．６ｘ２５０ ｍｍ． ５ ｍ）；流动相：甲醇一０．０１％磷酸梯度洗脱（甲醇 比例０～３０ ｒａｉｎ，６０％～８０％；３Ｏ～５０ ｍｉｎ．８０％～ ９０％）；流速：０．８ ｍＬ／ｍｉｎ；柱温：３０℃：检测波长 （ＤＡＤ检测器）：２２８ ＢＩＴＩ；进样量：５ Ｌ。 杂质对照品溶液制备：取杂质对照品适量，精 密称定，加甲醇溶解配制成质量浓度为每１ ｍＬ含 ＢＢ、Ａ０５９、Ａ０４２分别为０．０４２ ７１、０．０４１ １１、 ０．０３８ １０ ｍｇ的对照品储备液，备用。 杂质供试品溶液制备：取中间体样品．精密称 定，加二氯甲烷一甲醇（ ： ＝１：１）溶解配制成每 １ ｍＬ中约含１．６ ｍｇ的样品溶液，作为杂质检测用 供试品溶液。 ３结果与分析 ３．１分离条件考察 经ＤＡＤ扫描，Ｍ０５７最大吸收波长２３１ ｎｍ． 杂质ＢＢ、Ａ０５９、Ａ０４２最大吸收波长分别为２２６、 ２２６、２３１ ｎｍ，各成分均有明显的紫外吸收，首选 液相色谱法作为含量测定方法。分别以水、酸水、 碱水或缓冲盐与有机相组成适当比例的流动相等比 洗脱，均适用于Ｍ０５７分离定量，但已知杂质峰保 留时间过早，不能分离，梯度洗脱虽能满足各成分 的有效分离，在杂质获得适中的峰面积时．主成分 峰过饱和，不便于准确定量，且主峰出峰相对较 晚，分析时间过长，因此考虑采用不同的分离条件 更便于主成分及其杂质的测定．即Ｍ０５７的检测选 用流动相组成相对简单的甲醇一水等比洗脱。杂质 以梯度洗脱方式为好。 经４种填料类型的Ｃ１８色谱柱分析比较。在 ２３１ ｎｍ波长下Ｍ０５７均获得了理想的分离效果。确 定以主峰保留时间适中，市场售价相对较低的 ＳｉｎｏＣｈｒｏｍ ＯＤＳ—ＡＰ柱作为试验用柱，系统适用性 实验显示配样溶剂无干扰，理论板数以Ｍ０５７峰计 图４ ＭＯ５７紫外吸收 Ｆｉｇ．４ ＵＶ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ Ｍ０５７ ｄ ｏ ２ ４ ６ ８ ｌ０ １２ １４ 时间／ｒａｉｎ 柱型：ａ．ＳｉｎｏＣｈｒｏｍ ＯＤＳ—ＡＰ Ｃ１８；ｂ．ＳｉｎｏＣｈｒｏｍ ＯＤＳ—ＢＰ Ｃ１８： ｃ．Ｈｙｐｅｒｓｉｌ Ｃ１８；ｄ．Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８ 图５不同色谱柱测定的中间体色谱图 Ｆｉｇ．５ ＨｌＰＬＣ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓ ｏｆ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ Ｏｉｌ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｃｏｌｕｍｎｓ Ｊ 对照品 样品 溶剂 ０ ２．５ ５．０ ７．５ １０ １２．５ １５ 时间／ｒａｉｎ 图６ Ｍ０５７含量测定系统适用性图谱 Ｆｉｇ．６ ＨＰＬＣ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓ ｏｆ ｓｙｓｔｅｍ ｓｕｉｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｍ０５７ 杂质Ａ０４２结构中含有羧基，流动相加酸可获 得对称性较好的峰形；流动相中加入甲酸基线下移 较严重，改用乙酸，基线噪音响应较大。以加人磷 酸体积浓度０．０１％与甲醇配比梯度洗脱。在各杂质 均有较大吸收的２２８ ｎｍ波长下检测，既使得基线 噪音相对减小，响应趋于平稳，各色谱峰又获得较 好的重现性、对称性，测定成分与其他组分峰分离 度大于２，实现了同一色谱条件下３个已知杂质的 含量测定，配样溶剂无干扰。结果见图７。 对照品 ＝＝ ｏ ５ １ｏ １５ ２０ ２５ 时间／ｍｉｎ 图７杂质测定系统适用性图谱 Ｆｉｇ．７ ＨＰＬＣ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓ ｏｆ ｓｙｓｔｅｍ ｓｕｉｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ 精细化工中间体 第４４卷 ３．２提取溶剂选择 回收率及方法耐用性实验 取同一对照品溶液，连续进样测定６次，考察 精密度。取对照品溶液加甲醇逐级稀释，以Ｍ０５７ 色谱峰响应约为基线噪音的３倍和１０倍时的进样 采用本法要实现准确定量，首先要解决样品难 溶问题。本品或主成分对照品仅在Ⅳ，Ⅳ一二甲基甲 酰胺（ＤＭＦ）中有较好的溶解度（ＤＭＦ作溶剂不 适用于液相色谱），在甲醇、无水乙醇、０．１ ｍｏｌ／Ｌ 氢氧化钠溶液、０．１ ｍｏｌ／Ｌ盐酸溶液或水中几乎不 量分别作为检测限和定量限。取中间体样品，按供 试品溶液制备方法平行制备６份供试品溶液，进样 溶，因此实验考察了所处环境温度下不同溶剂能溶 解样品的最大量，即取饱和溶液的续滤液经液相色 测定，考察样品重复性。取同一供试品溶液，分别 于不同时间进样，考察稳定性。精密称取同批样品 ９份．分别按样品含量的约８０％、１００％、１２０％精 密加入Ｍ０５７对照品，得到低、中、高３个加标 组，每组平行备３份，按照供试品溶液处理方法制 谱法测定，计算饱和溶解度（表１），选出对实验 样品溶解性相对较好的溶剂系统．避免溶解不完全 导致测量结果不可靠。结果以二氯甲烷一甲醇（ ＝ ｌ：１）作溶剂为佳，可溶解的最大浓度接近４．５ ｍｇ／ 备，同法测定．计算回收率。在含量测定用色谱条 件基础上流速变化±０．２ ｍＬ／ｍｉｎ、柱温变化范围２０～ ｍＬ，其他溶剂最大溶解度低于１ ｍｇ／ｍＬ（表１）。 表１ Ｍ０５７对照品在不同溶剂中的饱和溶解度 ３５℃、波长变化±７ ｎｍ、流动相甲醇比例变化一７．５％ ～＋２．Ｏ％．及使用不同柱型测定同一样品含量。考 Ｔａｂｌｅ １ Ｓａｔｕｒａｔｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔｓ ｏｆ Ｍ＿０５７．ｎ ｄｉ ｒｅｎｔ ｏｌｓｖｅｎｔｓ 察方法耐用性。结果见表２。 表２方法学考察结果 Ｔａｂｌｅ ２ Ｒｅｓｕｌｓ ｔｏｆ ｍｅｔｈｏｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ３－３ Ｍ０５７含量测定方法学考察 ３．３．１线性关系考察 精密吸取Ｍ０５７对照品储备液０．２、０．４、０．８、 １．２、１．６、２．０ ｍＬ，分别置２ ｍＬ量瓶中，加甲醇稀 释至刻度，摇匀，制成系列浓度的对照品溶液，取 同体积进样．Ｍ０５７峰面积积分值ｙ与对照品浓度 （Ｉｘｇ／ＩｘＬ）进行线性回归，得回归方程：】，＝ ３４ ４８２．９４５ ５Ｘ＋４．１２４ ８１０ ６，，Ｉ＝０．９９９ ９（ ＝６）， Ｍ０５７在０．０２０ １６￣０．２００ ７ ｇ／ Ｌ范围呈良好的线 性关系。 ３．４杂质ＢＢ、Ａ０５９、Ａ０４２含量测定研究 ３．４．１线性关系考察 取杂质对照品储备液０．５、１．０、２．０、３．０、４．０、 ５．０ ｍＬ置５．０ ｍＬ量瓶中．用甲醇稀释至刻度，得 系列浓度对照品溶液，进样测定，以各成分峰面积 积分值ｙ与对应的进样量Ｘ（ ｇ）进行线性回归， 得回归方程。见表３。 ３．３．２精密度、检测限、定量限、重复性、稳定性、 表３ ３种杂质的线性回归方程、相关系数、线性范围、定量限、检测限及进样重复性 Ｔａｂｌｅ ３ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｅｑｕａｔｉｏｎｓ，ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ，ｌｉｎｅａｒ ｒａｎｇｅｓ，ｌｉｍｉｔｓｏｆｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ（ＬＯＱｓ）。ｌｉｍｉｔｓｏｆｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＬＯＤｓ）ａｎｄ ｈｅ ｔＲＳＤ ｏｆ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙ ｆｏｒ ｔｈｒｅｅ ｉｍｐｕｒｉｉｔｅｓ 第３期 曹佩雪，等：ＨＰＬＣ测定＾ｒ＿（＾Ｌ苯甲酰基一Ｏ一苯甲酰基 一酪氨酰基） 一苯丙氨醇及其三种杂质 ３．４．２检测限、定量限、进样重复性 于７７％，已知杂质总量低于４．５％，用其制备得到 取杂质对照品溶液加甲醇逐级稀释，分别以产 生３倍和１０倍信噪比的进样量计算检测限和定量 限。取同一杂质供试品溶液，连续进样６次，考察 样品进样重复性。结果见表３。 ３．５样品含量测定 的后续产物质量合格．提示含量在此限度内的中间 体不必经过纯化即可作为合格品投料。经测定，已 知杂质相对于主成分Ｍ０５７的相对响应因子并不都 在０．９～１．１范围，采用主成分自身对照法定量，结 果不如外标法准确。由于可经并不复杂的合成路线 制备得到杂质．为外标法测定含量提供了对照物。 本法因准确可靠、切实可行。已作为该中间体的质 量内控方法。 参考文献： ［１】 刘玉明，梁光义，徐必学．苗族药马蹄金化学成分的研究 ．天 然产物研究与开发，２００３，１５（１）：１５—１７． 【２］Ｘｕ Ｂ Ｘ，Ｈｕａｎｇ Ｚ Ｍ，Ｌｉａｎｇ Ｇ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ａｎｔｉ—ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｍａｔｉｊｉｎｇ－Ｓｕ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ， ２００９，１７（８）：３ １１８－３ １２５． 【３］ Ｑｉｕ Ｊ Ｙ，Ｘｕ Ｂ Ｘ，Ｈｕａｎｇ Ｚ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｔｉｊｉｎｇ－Ｓｕ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ａｓ ｐｏｔｅｎｔ ａｎｔｉ－ＨＢＶ ａｇｅｎｔｓ 取不同批号的中间体样品，分别制备Ｍ０５７及 杂质检测用供试液，按相应的色谱条件进样测定， 外标法计算含量，结果见表４。 表４ Ｍ０５７及杂质含量测定结果ｌｎ＝２） Ｔａｂｌｅ ４ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆＭ０５７ ａｎｄ ｔｈｒｅｅ ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ（ｎ＝２） ［Ｊ】．Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１ １，１９：５ ３５２—５ ３６０． ［４］ 邱净英，黄正明，潘卫东，等．马蹄金素衍生物的合成及抗乙肝 病毒活性［Ｊ］．中国药科大学学报，２０１２，４３（５）：３９０－３９４． 【５】 刘青川，王晨吟，何书桃，等．苯丙氨酸二肽类化合物Ｙ１０１对 ＤＨＢＶ—ＤＮＡ的影响叨．中国药理学通报，２０１２，２８（１０）：ｌ ３８９－ １ ３９３． 【６］ ＨｕＺＸ，ＡｎＱ，ＬｉＫＦ，ｅｔ ａ１．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄ ｓｔｒａｔｅｇｙ ４结 论 ｆｏｒ ｍｉｎｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｔｅｎｔｉｌ ｉａｍｐｕｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｔｉ— ＨＢＶ ｄｒｕｇ ＹＩＯ１［Ｊ】．Ｏｒｇａｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， 根据测定结果推知未知杂质含量比重约占样品 ２０１３，１７（９）：１ １５６－１ １６７． 【７】 曹佩雪，胡占兴，曹运记，等．Ⅳ－ｆ』 苯甲酰基一０一苯甲酰基一Ｌ一 酪氨酰基卜Ｌ一苯丙氨醇及其异构体的手性高效液相色谱分析 量的１０％～２０％，由于富集难度较大，结构未能阐 明。采用本法测定各批中试样品，Ｍ０５７含量不低 （上接第５６页） 叨．广东化工，２０１３，４Ｏ（２４）：１３０—１３１． Ｃｏｎｎｏｒ Ｅ Ｆ，Ｎｙｃｅ Ｇ Ｗ，Ｍｙｅｒｓ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｆｉｍｔ ｅｘａｍｐｌｅｏｆ Ｎ— ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ ｃａｒｂｅｎｅｓ ａｓ ｃａｔｌｙｓａｔｓ ｆｏｒ ｌｉｖｉｎｇ ｐｏｌｙ—ｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ： 【３】 Ｒｙａｎ Ｊ Ｐ，Ａｎｄｒｅｗ Ｐ Ｄ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｏｒｇａｎｏｃａｔａｌｙｔｉｃ ｒｉｎｇ—ｏｐｅｎｉｎｇ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｃｌｉｃ ｅｓｔｅｒｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ １－ｍａｌｉｃ ａｃｉｄ［Ｊ】． Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｅｕｌａｒｓ，２０１０，１ １：１ ９３０－Ｉ ９３９． ｏｒｇａｎｏｃａｔｌｙｔｉａｃ ｒｉｎｇ－ｏｐｅｎｉｎｇ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆｃｙｃｌｉｃ ｅｓｔｅｒｓ［Ｊ］．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ，２００２，１２４（６）：９１４－９１５． Ｎｙｃｅ Ｇ Ｗ，Ｇｌａｕｓｅｒ Ｔ，Ｃｏｎｎｏｒ Ｅ Ｆ，ｅｔ ａ１．Ｉｎ ｓｉｔｕ ｇｅｎｅｒａ－ｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｂｅｎｅｓ：Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ａｎｄ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｏｒｆ ｏｒｇａｎｏｃａｔａｌｙｔｉｃ ｌｉｖｉｎｇ 【４】 ｎ Ｊ Ｐ，Ａｎｄｒｅｗ Ｐ Ｄ．ａＯｒｇａｎｉｃ ｃａｔａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｒｉｎｇ—ｏｐｅｎｉｎｇ ｐ０ｌｙｍｅｒｉｚａＩｉ０ｎ【Ｊ】．Ｍａｃｒｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２０１２，１：１ ４０９—１ ４１２． ［５】Ｈｏｙｌａｎｄ，Ｊｕｄｉｔｈ Ａ，Ｃｏｖｉｎｇｔｏｎ，ｅｔ ａ１．Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ３－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ｖ／ａ ｍｉｅｒｏｓｔｅｒｅｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ ｕｓｉｎｇ ａ ｓｉｍｐｌｅ， ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ，２００３，１２５：３ ０４６—３ ０５６． Ｃｏｕｌｅｂｉｅｒ Ｏ，Ｄｏｖｅ Ａ Ｐ，Ｐｒａｔｔ Ｒ Ｃ．Ｌａｔｅｎｔ，ｔｈｅｒｍａｌｌｙ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｔｈｒｅｅ－ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ，ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏ１）ａｃｒｙｌａｔｅ－ｂａｓｅｄ ｓｙｓｔｅｍ【Ｊ】． Ｂｉｏｍａｅｒｏｍｏｌｅｃｕｌｒｓ，２０１３，１４：１８６－１９２．ａ ｏｒｇａｎｉｃ ｃａｔａｌｙｓｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｏｎ－ｄｅｍａｎｄ ｌｉｖｉｎｇ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｃｔｉｄｅ ［Ｊ］．Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ，２００５，４４：４ ９６４—４ ９６８． Ｃｓｉｈｏｎｙ Ｓ，Ｃｕｌｋｉｎ Ｄ Ａ，Ｓｅｎｔｍａｎ Ａ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ［６］Ｐｒａｔ Ｒ Ｃ，Ｈｅｄｒｉｃｋ Ｊ Ｌ．Ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ，ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｐｒａｍｏｌｅｅｕｌａｒ ｔｈｉｏｕｒｅａ－ａｍｉｎｅ ｃａｔａｌｙｓｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｃａｔａｌｙｓＶｉｎｉｔｉａｔｏｒｓｆｏｒｔｈｅｏｒｇａｎｏｅａｔｌｙｔｉａｃ；￣ｇ－－ｏｐｅｎｉｎｇｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｌａｃｔｉｄｅ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ［Ｊ］．Ｍａｃｍｍｏｌｅｃｕｌａｒｓ，２００６，３９：７ ８６３—７ ８７１． 【８】Ｄｏｖｅ Ａ Ｐ，Ｐｒａｔｔ Ｒ Ｃ，Ｌｏｈｍｅｉｊｅｒ Ｂ Ｇ Ｇ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｉｏｕｒｅａ—ｂａｓｅｄ ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｏｒｇａｎｏｃａｔａｌｙｓｉｓ：ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｆｏｒ ｌｉｖｉｎｇ ｏｆｌａｃｔｉｄｅ叨．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ，２００５，１２７：９ ０７９—９ ０８４． Ｃｈｅｎ Ｈ Ｙ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｌ ｓｔａｕｄｉｅｓ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｂｉｍｅｔｌｌａｉｃ ｌａｋｏｘｉｄｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ ｂｉｓ（ｐｈｅｎｏｌａｔｅ）ｌｉｇａｎｄｓ ｅｆｉｆｃｉｅｎｔ ｃａｔｌｙｓｔａｓ ｆｏｒ ｒｉｎｇ—ｏｐｅｎｉｎｇ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ￡一ｌａｃｔｉｄｅ［Ｊ】．Ｇｒｅｅｎ Ｃｈｅｍ，２００７，９：１ ０３８—１ ０４０． ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ，２００５，１２７：１３ ７９８—１３ ７９９． 【９】Ｄｏｖｅ Ａ Ｐ，Ｐｒａｔｔ Ｒ Ｃ，Ｌｏｈｍｅｉｊｅｒ Ｂ Ｇ．Ｎ－Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ ｃａｒｂｅｎｅｓ： Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｏｒｇａｎｉｃ ｃａｔｌｙｓｔａｓ ｆｏｒ ｌｉｖｉｎｇ ｐ０ｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ…．Ｐｏｌｙｍｅｒ， ２ｏｏ６．４７：４０１８—４０２５． Ａｒｄｕｅｎｇｏ Ａ Ｊ＇Ｋｒａｆｃｚｙｋ Ｒ．Ｉｍｉｄａｚｏｌｙｌｉｄｅｎｅｓ，Ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｙｌｉｄｅｎｅｓ ｎｄ ａＩｍｉｄａｚｏｌｉｄｅｎｅｓ［Ｊ］．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９９，５５：１４ ５２３－１４ ５３４．