山东医药２０１７年第５７卷第２０期 ｍｉＲ．．１０６ｂ 在鼻咽癌组织中表达及对鼻咽癌 ＣＮＥ一２细 胞生物学特性的影响 周士霞，王海莉，王豪勋 （郑州大学第；附属医院，郑州４５００１４） 摘要：目的探讨ｍｉＲ－１０６ｂ在鼻咽癌组织中的表达及其对鼻咽癌ＣＮＥ－２细胞生物学特性的影响。方法选 取６８例份初治鼻咽癌患者的手术切除标本和４５例份鼻咽炎患者的鼻咽部活检组织标本，采用实时荧光定量ＰＣＲ 法检测ｍｉＲ一１０６ｂ表达，分析ｍｉＲ－１０６ｂ表达与鼻咽癌患者临床病理参数的关系。取体外培养的对数生长期人鼻咽 癌细胞株ＣＮＥ－２分为四组（１×１０ 个／组）。ｍｉＲ一１０６ｂ模拟物组、ｍｉＲ．１０６ｂ抑制物组分别转染ｍｉＲ．１０６ｂ模拟物及 ｍｉＲ－１０６ｂ抑制物序列，阴性对照组转染阴性对照序列，空白对照组不处理；采用实时荧光定量ＰＣＲ技术检测各组 ｍｉＲ一１０６ｂ表达，ＭＴＹ法检测各组细胞增殖情况（以吸光度值表示），流式细胞仪检测各组细胞周期，Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ试验 检测各组细胞迁移和侵袭能力。结果鼻咽癌及鼻咽炎组织ｍｉＲ－１０６ｂ相对表达量分别为１．５７±０．１５、１．１４± ０．１２，二者比较Ｐ＜０．０５；ｍｉＲ一１０６ｂ相对表达量与鼻咽癌患者淋巴结转移、侵犯颈动脉鞘和侵犯颅底有关（Ｐ均＜ ０．０５）。各组ｍｉＲ．１０６ｂ相对表达量：ｍｉＲ－１０６ｂ模拟物组高于ｍｉＲ．１０６ｂ抑制物组、阴性对照组和空白对照组，ｍｉＲ一 １０６ｂ抑制物组低于阴性对照组和空白对照组，Ｐ均＜０．０５；各组细胞增殖情况：ｍｉＲ一１０６ｂ模拟物组细胞接种后２４、 ４８、７２和９６ ｈ时吸光度值均高于ｍｉＲ－１０６ｂ抑制物组、阴性对照组和空白对照组，而ｍｉＲ－１０６ｂ抑制物组低于阴性对 照组和空白对照组，Ｐ均＜０．０５；各组细胞周期：ｍｉＲ－１０６ｂ模拟物组Ｓ期细胞比例高于ｍｉＲ一１０６ｂ抑制物组、阴性对 照组和空白对照组，而ｍｉＲ一１０６ｂ抑制物组细胞Ｓ期比例低于阴性对照组和空白对照组，Ｐ均＜０．０５；各组细胞迁移 和侵袭情况：ｍｉＲ一１０６ｂ模拟物组迁移和侵袭细胞数均高于ｍｉＲ－１０６ｂ抑制物组、阴性对照组和空白对照组，且ｍｉＲ一 １０６ｂ抑制物组均低于阴性对照组和空白对照组，Ｐ均＜０．０５。结论ｍｉＲ一１０６ｂ在鼻咽癌组织中呈高表达；ｍｉＲ一 １０６ｂ过表达可促进鼻咽癌ＣＮＥ－２细胞增殖、迁移和侵袭能力。 关键词：鼻咽癌；微小ＲＮＡ－１０６ｂ；ＣＮＥ－２细胞；细胞增殖；细胞迁移 ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２—２６６Ｘ．２０１７．２０．００３ 中图分类号：Ｒ７３９．６ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２—２６６Ｘ（２０１７）２０－０００９－０４ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｉＲ－－１０６ｂ ｉｎ ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｉｓｓｕｅｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ＣＮＥ－２ ｃｅｌｌｓ ＺＨＯＵ Ｓｈｉｘｉａ．ＷＡＮＧ Ｈａｉｌｉ。ＷＡＮＧ Ｈａｏｘ，ｕｎ （Ｔｈｅ Ｓｅｃｏｎｄ Ａｆｉｆｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆＺｈｅｎｇｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ ４５００１４，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｉＲ・１０６ｂ ｉｎ ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ＇ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｉｓｓｕｅｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ＣＮＥ－２ ｃｅｉｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｓｉｘｔｙ－ｅｉｇｈｔ ｃａｓｅｓ ｏｆ ｓｕｒｇｉｃａｌ ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ ｆｒｏｍ ｆｉｒｓｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｎｄ ４５ ｃａｓｅｓ ｏｆ ｎａｓ０ｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｂｉｏｐｓｙ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｈｒｏｎｉｃ ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｉｔｉｓ ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｉＲ－１０６ｂ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｉＲ一１０６ｂ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｎｉｌ，ｓＯ— ｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ．Ｔｈｅ ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ＣＮＥ－２ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｈｔｅ ｌｏｇａｒｉｔｈｍｉｃ ｇｒｏｗｔｈ ｐｈａｓｅ ｗｅｒｅ ｄｉｖｉｄ－ ｅｄ ｉｎｔｏ ｆｏｕｒ ｇｒｏｕｐｓ（１ Ｘ １０ ｃｅｌｌｓ／ｇｒｏｕｐ）．Ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｉＲ一１０６ｂ ｍｉｍｉｃｓ ｇｒｏｕｐ ｎａｄ ｍｉＲ－１０６ｂ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｇｒｏｕｐ ｗｅｒｅ ｔｒｎａｓｅｃ－ ｔｅｄ ｗｉｔｈ ｍｉＲ １０６ｂ ｍｉｍｉｃｓ ａｎｄ ｍｉＲ一１０６ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ｗｅｒｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ，ｗｈｉｌｅ ｃｅｉｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｂｌａｎｋ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ｗｅｒｅ ｎｏｔ ｔｒｅａｔｅｄ．Ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｅａｃｈ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｒｇｏｕｐ ｗ ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ＭＴＹ ａｓｓａｙ．Ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ Ｏｆ ｅａｃｈ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｇｒｏｕｐ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｏｆ ｅａｃｈ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｇｒｏｕｐ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｍｉＲ－１０６ｂ ｉｎ ｈｔｅ ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｉｓｓｕｅｓ ａｎｄ ｃｈｒｏｎｉｃ ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｉｔｉｓ ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｔｉｓｓｕｅｓ 基金项目：河南省科技发展计划（１４２１０２３１００８７）。 第一作者简介：周士霞（１９７９一），女，主治医师，主要研究方向为恶性肿瘤的临床及基础研究。Ｅ—ｍａｉｌ：１５４１４２１０４２＠ｑｑ．ｃｏｒｎ ９ 山东医药２０１７年第５７卷第２０期 ｗｅｒｅ １．５７±０．１５ ａｎｄ １．１４±０．１２．ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，Ｐ＜０．０５．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｉＲ一１０６ｂ ｉｎ ｔｈｅ ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｉｓｓｕｅｓ ｗａｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．ｃａｒｏｔｉｄ ｓｈｅａｔｈ ｖｉｏｌａｔｉｏｎｓ，ａｎｄ ｓｋｕｌｌ ｂａｓｅ ｖｉｏｌａｔｉｏｎｓ（ａｌｌ Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｉｎ ｅａｃｈ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ：ｔｈｅ ｍｉＲ一１０６ｂ ｍｉｍｉｃ ｇｒｏｕｐ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｍｉＲ一１０６ｂ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｂｌａｎｋ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ，ａｎｄ ｔｈｅ ｍｉＲ一１０６ｂ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｇｒｏｕｐ ｗａｓ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｂｌａｎｋ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ．ａｌｌ Ｐ＜０．０５．Ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｅａｃｈ ｔｒａｎｓｆｅｅｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ：Ａ ｖａｌｕｅｓ ａｆｔｅｒ ｃｅｌｌ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ２４，４８，７２ ａｎｄ ９６ ｈ ｉｎ ｔｈｅ ｍｉＲ一１０６ｂ ｍｉｍｉｃ ｇｒｏｕｐ ｗｅｒｅ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｏｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉＲ一１０６ｂ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｇｒｏｕｐ， ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｂｌａｎｋ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ，ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｍｉＲ一１０６ｂ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｇｒｏｕｐ ｗａｓ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｂｌａｎｋ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ．ａｌ１ Ｐ＜０．０５．Ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｏｆ ｅａｃｈ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ：ｔｈｅ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ ｏｆ Ｓ ｐｈａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｍｉＲ一１０６ｂ ｍｉｍｉｃｓ ｇｒｏｕｐ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉＲ一１０６ｂ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｂｌａｎｋ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ．ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｍｉＲ一１ ０６ｂ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｇｒｏｕｐ ｗａｓ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｂｌａｎｋ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ，ａｌｌ Ｐ＜０．０５． Ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｍｉｒａｔｇｉｏｎ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｉｎ ｅａｃｈ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ：ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｍｉｒａｔｇｉｏｎ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｉＲ一 １０６ｂ ｍｉｍｉｃｓ ｇｒｏｕｐ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉＲ一１０６ｂ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｇｒｏｕｐ，ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｂｌａｎｋ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ， ａｎｄ ｔｈｅ ｍｉＲ一１０６ｂ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｇｒｏｕｐ ｗａｓ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｂｌａｎｋ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ．ａｌｌ Ｐ＜０．０５． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ｍｉＲ一１０６ｂ ｉｓ ｈｉｇｈｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｃ￣ｃｉｎｏｍａ ｔｉｓｓｕｅ，ａｎｄ ｔｈｅ ｍｉＲ一１０６ｂ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍａｙ ｐｒｏｍｏｔｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｍｉｇｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｏｆ ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｅ￣ｃｉｎｏｍａ ＣＮＥ一２ ｃｅｌｌｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ；ｍｉＲ一１０６ｂ；ＣＮＥ－２ ｃｅｉｌｓ；ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ；ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ 微小ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）是广泛存在于生物体内的 高度保守的短小ＲＮＡ，在细胞增殖、分化、迁移等多 种生物学过程中发展重要作用，且参与了多种恶性 肿瘤的发生、侵袭、转移过程 －３］。ｍｉＲ．１０６ｂ作为 ｍｉＲＮＡ的重要成员，与原癌基因簇成员ｍｉＲ一１７、 ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ流式细胞仪购自美国ＢＤ公司。ＴＲＩｚｏｌ 总ＲＮＡ提取试剂盒购自加拿大ＢＢＩ公司，逆转录试 剂盒和ＰＣＲ试剂盒均购自大连宝生物公司，ｍｉＲ一 １０６ｂ及内参Ｕ６引物、ｍｉＲ．１０６ｂ模拟物、ｍｉＲ一抑制 物和阴性对照均由上海生工公司设计合成。 １．２鼻咽组织ｍｉＲ．１０６ｂ表达检测采用实时荧光 ｍｉＲ一２０有高度同源性，高表达于多种恶性肿瘤 Ｊ， 且与肿瘤细胞增殖关系密切 。但有关ｍｉＲ一１０６ｂ 与鼻咽癌发病的相关性鲜有报道。本研究对鼻咽癌 组织中ｍｉＲ．１０６ｂ表达变化进行分析，并通过转染 ｍｉＲ．１０６ｂ模拟物和抑制物，探讨其对人鼻咽癌细胞 株ＣＮＥ．２增殖、迁移及侵袭能力的影响，以期为鼻 定量ＰＣＲ法。取鼻咽癌及慢性鼻咽炎患者鼻咽部活 检组织，研磨后加入细胞裂解液进行裂解，用ＴＲＩｚｏｌ 总ＲＮＡ提取试剂盒对总ＲＮＡ进行提取，并检测其纯 度，取Ａ瑚／Ａ 。≥１．８０的标本作为合格样品。将总 ＲＮＡ逆转录为模板单链ｃＤＮＡ，以ｃＤＮＡ为模板，用 咽癌发病机制的研究提供依据。 １材料与方法 ＰＣＲ仪进行ＰＣＲ扩增。ＰＣＲ反应条件：９４℃、６０ ｓ， ９２℃、３０ ｓ，５６℃、３０ ｓ，７４℃、３０ ｓ，连续进行３８个循 环。每个样品均设置３个平行反应复孔。采用２ Ｉ△ 法获得不同组织中ｍｉＲ．１０６ｂ相对表达量。分析ｍｉＲ－ １．１材料选取６８例份２０１４年２月有一２０１６年 ２月我院初治鼻咽癌患者［男４３例、女２５例，年龄 ２７～８１（４７．６－４－１１．５）岁；排除心肝肾等重要脏器严 重功能障碍者以及糖尿病、恶性肿瘤患者］手术切 除的癌组织标本，经病理学检查确诊。临床分期：Ｉ ～１０６ｂ表达与鼻咽癌患者临床病理参数的关系。 １．３ ｍｉＲ．１０６ｂ对ＣＮＥ－２细胞生物学特性影响的 观察 Ⅱ期３１例，Ⅲ～Ⅳ期３７例；发生颈淋巴结转移 １．３．１ ＣＮＥ一２细胞培养及分组处理胞培养于含１００ 将ＣＮＥ一２细 ５１例。选取同期行鼻咽部活检的４５例慢性鼻咽炎 患者［男２９例、女１６例，年龄（４８．０±１２．１）岁］手 术切除的正常胃咽部组织标本，经病理学检查确诊。 鼻咽癌患者与鼻咽炎患者性别、年龄具有可比性（Ｐ ｍＬ链霉素、１００ Ｕ／ｍＬ青霉素 和１０％ＦＢＳ中的ＤＭＥＭ完全培养基中，于５％ＣＯ 、 ３７℃恒温培养箱中培养，待细胞生长丰度达到８０％ 以上时，胰酶消化后传代培养。取对数生长期的 ＣＮＥ一２细胞，用无血清ＤＭＥＭ培养基重悬后，接种 均＞０．０５）。人鼻咽癌细胞株ＣＮＥ一２购自中科院上 海生科院细胞资源中心，ＦＢＳ、ＤＭＥＭ培养基、Ｌｉｐｏ． ｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００转染试剂盒均购自美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公 司，ＭＴＴ细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒购自上海 威奥生物公司，Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室购自美国Ｃｏｍｉｎｇ公 于６孑Ｌ板，细胞密度５×１０ ／ｍＬ，待细胞贴壁生长融 合度达到５０％以上后，用Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００转染试 剂盒按照操作说明对细胞进行转染。将细胞分成四 组（１×ｌＯ。个／组）：ｍｉＲ．１０６ｂ模拟物组：转染ｍｉＲ一 １０６ｂ模拟物序列：５ ．ＴＡＡＡＧＴＧＣＴＧＡＣＡＧＴＧ． 司，实时荧光定量ＰＣＲ仪购自美国Ｂｉｏ—ｒａｄ公司， １ ０ 山东医药２０１７年第５７卷第２０期 ＣＡＧＡＴ￣ ；ｍｉＲ一１０６ｂ抑制物组：转染ｍｉＲ．１０６ｂ抑制 析，组间两两比较采用ＬＳＤ—ｔ检验。Ｐ＜０．０５为差 物序列：５ 一ＡＵＣＵＧＣＡＣｕＧｕＣＡＧＣＡＣｕｕｕＡ－３ ；阴性 异有统计学意义。 对照组：转染阴性对照序列：５ ．ＣＡＧＵＡＣｕｕｕＵＧＵ． ２结果 ＧＵＡＧＵＡＣＡＡ一３ ；空白对照组：不做任何处理。 ２．１ 鼻咽癌及鼻咽炎组织ｍｉＲ．１０６ｂ表达比较鼻 １．３．２ ｍｉＲ－１０６ｂ表达检测各转染组细胞培养４８ 咽癌组织、慢性鼻咽炎鼻咽组织中ｍｉＲ．１０６ｂ相对表 ｈ后加入细胞裂解液进行裂解，采用实时荧光定量 达量分别为１．５７±０．１５、１．１４±０．１２，二者比较差 ＰＣＲ法检测ｍｉＲ・１０６ｂ相对表达量。 异有统计学意义（￡＝１５．４３３，Ｐ＜０．０５）。ｍｉＲ．１０６ｂ １．３．３细胞增殖率的测算采用ＭＴｒ法。取转染 表达与鼻咽癌患者年龄、性别、临床分期无关（Ｐ均 ２４ ｈ细胞，胰酶消化后，接种于９６孔板内，细胞数２．０ ＞０．０５），而与淋巴结转移、侵犯颈动脉鞘和侵犯颅 ｘ １０ ／孔，分别于接种后１２、２４、４８、７２和９６ ｈ时，将 底有关（Ｐ均＜０．０５），详见表１。 孔板中液体吸出，加入新鲜培养基和ＭＩＴ，置于５％ 表１ ｍｉＲ－１０６ｂ表达与鼻咽癌患者临床病理参数的关系 ＣＯ 、３７℃恒温箱中培养４ ｈ，加入二甲基亚砜（ＤＭ． ＳＯ），振荡１２ ｍｉｎ后，用酶标仪进行检测，取４９０ ｎｍ 处吸光度（Ａ）值。重复实验３次，取平均值。 １．３．４．细胞周期检测采用流式细胞仪检测。取 各转染组对数生长的细胞，接种于６孑Ｌ板，细胞数１ ×１０ ／孔，培养２４ ｈ后，胰酶消化后收集细胞，用预 冷ＰＢＳ洗涤３次，用乙醇固定，４℃下过夜孵育。加 入碘化丙啶避光染色２５ ｍｉｎ，利用流式细胞仪检测 各转染组细胞周期。重复实验３次，取平均值。 １．３．５细胞迁移能力及侵袭能力检测采用Ｔｒａｎ． ｓｗｅｌｌ试验。细胞迁移能力：取各组转染后培养４８ ｈ 细胞，胰酶消化后收集细胞，用无血清ＤＭＥＭ培养基 重悬，调整细胞浓度为５×１０ 个／ｍＬ，取２００ 细胞 加入Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室的上室，将含１０％胎牛血清的 ＤＭＥＭ培养基加入下室，于３７℃培养箱中培养２４ ｈ， ２．２ ｍｉＲ－１０６ｂ对鼻咽癌细胞生物学特性的影响 用甲醛进行固定，结晶紫染色后，用显微镜进行观察， ２．２．１各组细胞中ｍｉＲ．１０６ｂ表达比较ｍｉＲ．１０６ｂ模 随机选取５个高倍视野对穿膜细胞数进行计数，取平 拟物组ｍｉＲ．１０６ｂ相对表达量为１．８２￣０．１６，显著高于 均数。重复实验３次。细胞侵袭能力：将５０ ｇ的 ｍｉＲ．１０６ｂ抑制物组、阴性对照组和空白对照组，分别为 Ｍａｔｉｆｇｅｌ胶将Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室底部膜包被，３７℃成胶 １．０７±０．０９、１．３１±０．１３和１．３３±０．１４，且ＩＩｌｉＲ－１０６ｂ抑 ３０ ｍｉｎ，其余步骤同上。重复实验３次，取平均值。 制物组低于阴性对照组和空白对照组（Ｐ均＜０．０５）。 １．４统计学方法采用ＳＰＳＳ２１．０统计学软件。计 ２．２．２各组细胞增殖情况比较见表２。 量资料以 ±ｓ表示，多组间比较采用单因素方差分 ２．２．３各组细胞周期比较见表３。 表２各组细胞增殖情况比较（ｉ± ） 注：与空白对照组相比，’Ｐ＜０．０５；与阴性对照组相比， Ｐ＜０．０５；与ｍｉＲ－１０６ｂ抑制物组相比， Ｐ＜Ｏ．０５。 ２．２．４各组细胞迁移和侵袭能力比较见表４。 表达于喉鳞状细胞癌，通过负性调控ＡＰＣ基因而促 ３讨论 进喉鳞状细胞癌Ｈｅｐ－２细胞增殖 。本研究结果显 ｍｉＲ．１０６ｂ为ｍｉＲＮＡ的重要类型，参与了细胞 示，鼻咽癌组织中ｍｉＲ一１０６ｂ相对表达量显著高于慢 增殖、分化、凋亡过程。研究发现，ｍｉＲ．１０６ｂ过表达 性鼻咽炎组织，提示ｍｉＲ・１０６ｂ可能参与了鼻咽癌的 可促进肝细胞肝癌细胞增殖和转移 ；ｍｉＲ一１０６ｂ高 发生过程；ｍｉＲ．１０６ｂ表达量与鼻咽癌患者年龄、性 表３各组细胞周期情况比较（％，ｘ± ） 注：与空白对照组相比， Ｐ＜０．０５；与阴性对照组相比， Ｐ＜ ０．０５；与ｍｉＲ一１０６ｂ抑制物组相比， Ｐ＜Ｏ．０５。 表４各组细胞迁移和侵袭能力比较（个， ± 注：与空白对照组相比， Ｐ＜０．０５；与阴性对照组相比， Ｐ＜ ０．０５；与ｍｉＲ一１０６ｂ抑制物组相比， Ｐ＜０．０５。 别、原发灶大小和临床分期无关，而与淋巴结转移、 侵犯颈动脉鞘和侵犯颅底有关，提示鼻咽癌患者发 生颈淋巴结转移、出现侵犯颈动脉鞘和侵犯颅底时， 肿瘤组织中ｍｉＲ．１０６表达水平显著升高，ｍｉＲ一１０６ｂ 可能与鼻咽癌局部侵袭和淋巴结及远处转移有关。 本研究为进一步研究ｍｉＲ一１０６ｂ对鼻咽癌细胞 株ＣＮＥ．２增殖、迁移及侵袭能力的影响，利用细胞 转染技术，特异性上调或抑制细胞中ｍｉＲ一１０６ｂ表 达，结果显示，ｍｉＲ．１０６ｂ模拟物组细胞中ｍｉＲ一１０６ｂ 相对表达量显著高于ｍｉＲ一１０６ｂ抑制物组、阴性对照 组和空白对照组，且ｍｉＲ一１０６ｂ抑制物组明显低于阴 性对照组和空白对照组，说明转染ｍｉＲ－１０６ｂ模拟物 或抑制物可特异性使细胞中ｍｉＲ一１０６ｂ表达上调或 抑制。ｍｉＲ．１０６ｂ模拟物组细胞接种后２４、４８、７２和 ９６ ｈ时Ａ值均明显高于ｍｉＲ．１０６ｂ抑制物组、阴性 对照组和空白对照组，而ｍｉＲ一１０６ｂ抑制物组明显低 于阴性对照组和空白对照组，说明上调ｍｉＲ．１０６ｂ可 加速ＣＮＥ－２细胞增殖，而抑制ｍｉＲ一１０６ｂ表达则可 抑制ＣＮＥ．２细胞增殖，提示ｍｉＲ．１０６ｂ参与了ＣＮＥ．２ 细胞增殖过程。ｍｉＲ．１０６ｂ模拟物组细胞Ｓ期比例 明显高于ｍｉＲ一１０６ｂ抑制物组、阴性对照组和空白对 照组，ｍｉＲ一１０６ｂ抑制物组细胞Ｓ期比例明显低于阴 性对照组和空白对照组，说明ｍｉＲ．１０６ｂ可能通过调 控细胞周期而参与细胞增殖过程，与叶敏华等 研 究结论相同。近年来文献报道，ｍｉＲ一１０６ｂ调控细胞 周期的机制可能与调控了细胞周期中的一些相关因 子有关¨ 。有研究通过对调控细胞周期的相关基 １２ 山东医药２０１７年第５７卷第２０ 因进行筛选发现，ｐ２１／ＣＤＫＮ１ Ａ是ｍｉＲ一１０６ｂ的直接 作用靶位 ；ｍｉＲ．１０６ｂ可通过激活转录因子Ｅ２Ｆ１ 而促使Ｇ ／ｓ期的转化 。本研究结果显示，ｍｉＲ一 １０６ｂ模拟物组迁移细胞数和侵袭细胞数均明显高 于ｍｉＲ．１０６ｂ抑制物组、阴性对照组和空白对照组， 且ｍｉＲ．１０６ｂ抑制物组均低于阴性对照组和空白对 照组，说明ｍｉＲ一１０６ｂ可能参与了ＣＮＥ一２细胞迁移 和侵袭过程，但具体机制尚待进一步研究明确。 综上所述，ｍｉＲ．１０６ｂ在鼻咽癌组织中呈高表 达，过表达ｍｉＲ．１０６ｂ可促进鼻咽癌ＣＮＥ－２细胞增 殖、迁移和侵袭能力，其机制可能与促进细胞进入ｓ 期有关；提示ｍｉＲ．１０６ｂ有望成为鼻咽癌基因治疗的 潜在靶点。 参考文献： ［１］王盼盼，季明芳，吴标华．鼻咽癌高发区人群患鼻咽癌风险率的 动态观察［Ｊ］．中华肿瘤防治杂志，２０１４，２１（１５）：１１４４－１１４７． ［２］Ｋｉｍ Ｗ，Ｌｅｅ ＷＢ，Ｌｅｅ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｈｅｒｂａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｓ ａｄ－ ｊｕｎｃｔｉｖｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ：ａ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ ａｎｄ ｍｅｔａ—ａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．Ｉｎｔｅｇｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ，２０１５，１４（３）：２１２・２２０． ［３］Ｍｏｒｉ Ｍ，Ｔｒｉｂｏｕｌｅｔ Ｒ，Ｍｏｈｓｅｎｉ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｈｉｐｐｏ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｍｉｃｒｏｐｒｏｃｅｓｓｏｒ ａｎｄ ｌｉｎｋｓ ｃｅｌｌ・ｄｅｎｓｉｔｙ・－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｉＲＮＡ ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｔｏ ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ，２０１４，１５６（５）：８９３－９０６． ［４］董曦，孙桂波，邢小燕，等．Ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ一１０６ｂ－２５簇与肿瘤［Ｊ］．中 国药理学通报，２０１４，３０（１２）：１６３９—１６４１． ［５］Ｔａｎ Ｗ，Ｌｉ Ｙ，Ｌｉｍ ＳＧ，ｅｔ ａ１．ｍｉＲ－１０６ｂ－２５／ｍｉＲ一１７－９２ ｃｌｕｓｔｅｒｓ： ｐｏｌｙｃｉｓｔｒｏｎｓ ｗｉｔｈ ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ｒｏｌｅｓ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ［Ｊ］． Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，２０１４，２０（２０）：５９６２－５９７２． ［６］Ｔｉａｎ Ｙ，Ｔｉａｎ Ｙ，Ｚｈａｎｇ Ｗ，ｅｔ ａ１．Ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ—Ａ， ａｎ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ—ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｒ，ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｍｅ— ｔａｓｔａｓｉｓ ａｎｄ ｐｏｏｒ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］． Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，２０１５，３６（１）：４１－４８． ［７］申刚，嘉红云，陈德基，等．ｍｉＲ一１０６ｂ表达对人肝细胞肝癌细胞 增殖能力的影响［Ｊ］．中华肿瘤杂志，２０１４，３６（７）：４８９－４９５． ［８］段继惠，杨磊，王巍，等．微小ＲＮＡ－１０６ｂ靶向下调腺瘤性息肉 病基因表达促进Ｈｅｐ．２细胞的增殖［Ｊ］．中华实验外科杂志， ２０１５，３２（７）：１６５０－１６５２． ［９］叶敏华，张安玲，吴雷，等．反义抑制ｍｉＲ一１０６ｂ表达对人脑胶质瘤细 胞增殖和侵袭的影响［Ｊ］．中华神经外科杂志，２０１５，３１（１）：６０－６５． ［１Ｏ］Ｘｉａｎｇ Ｗ，Ｈｅ Ｊ，Ｈｕａｎｇ Ｃ，ｅｔ ａ１．ｍｉＲ一１０６ｂ－５ｐ ｔａｒｇｅｔｓ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐ－ ｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅ ＳＥＴＤ２ ｔｏ ｉｎａｃｔｉｖｅ ｉｔｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ［Ｊ］．Ｏｎｃｏｔｒａｇｅｔ，２０１５，６（６）：４０６６－４０７９． ［１ １］Ｐｒａｓａｄ Ｒ，Ｋａｔｉｙａｒ ＳＫ．Ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉＲＮＡ－１ ０６ｂ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ＧＩ－ｐｈａｓｅ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ａｒｒｅｓｔ ａｎｄ ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｐ２１／ＷＡＦＩ／Ｃｉｐｌ ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｊ］．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ， ２０１４，５（２１）：１０６３６－１０６４９． ［１２］Ｚｈａｎｇ Ｈ，Ｙａｎ Ｘ．Ｃａｎｔｈａｒｉｄｉｎ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ Ｅ２Ｆ１／ＭＣＭ７－ｍｉＲ一 １０６ｂ－９３／ｐ２１－ＰＴＥＮ ｓｉｎｇａｌｉｎｇ ａｘｉｓ ｉｎ ＭＣＦ－７ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ［Ｊ］．Ｏｎｃｏｌ Ｌｅｔｔ，２０１５，１０（５）：２８４９－２８５５． （收稿日期：２０１６－０７－０５）