蓝白斑筛选

基因工程(gene engineering)是20世纪70年代

以后兴起的一门新技术，即用人工的方法，把遗传物质DNA分离出来，在体外进行基因切割、连接、重组，然后再转移到生物体内并进行表达的技术。基

因工程中的关键一步是将目的基因与DNA载体连

接成重组DNA，获得重组子，并把重组子筛选出来。近年来，建立了许多方法来筛选重组子，其中较为常用的是利用a互补原理，根据菌落的蓝白颜色进行

筛选‘1|。

oL一互补是指E．coli B一半乳糖苷酶的两个无活 性片段(N端片段和c端片段)组合而成为功能完 整的酶的过程。现在使用的许多质粒载体都带有 一个E．coli DNA的短片段，其中含有B．半乳糖苷 酶N端146个氨基酸的编码信息及调控序列。在 这个编码区中插入了一个多克隆位点，可在此处 插入外源DNA片段。这种类型的载体适用于可编 码B．半乳糖苷酶c端部分的宿主细胞。尽管宿主 和载体编码的两个片段都没有活性，但他们能够 融合为具有酶活性的蛋白质，在含有底物X—gal的 培养基中形成蓝色菌落。当外源DNA片段插入到 质粒的多克隆位点后，导致N端片段丧失仪．互补 能力，因此，带有重组质粒的宿主细胞将形成白色 菌落。

基因重组与蓝自斑筛选是现代基因工程的关键 技术之一，因此也是目前我国高校生命科学专业开 设的基础实验之一。笔者在教学实践中，针对基因 重组这一实验分别参考了魏群主编的《分子生物学

实验指导》第1版和第2版旧一o，结果却显著不同：按第一版

的方案，将目的基因和载体用单一酶切后，简单地沉淀回收，连接转化，在LB平板上长出了

蓝、白斑，取得了预期的结果；而按照第2版方案，将目的基因和载体用双酶切，产物经电泳分离、切胶回收，再连接、转化，结果在LB平板上只长出了白斑，而不能长出如教材中所预期的蓝斑。由此，笔者认为，有必要对蓝白斑筛选的机制问题进行一次探讨，诸如：在转化与蓝白斑筛选操作中，线性的载体能否够成功转化，形成蓝斑的载体从哪里来，重组载体转化后是否一定会形成白斑，为何有些白斑会变蓝，重组转化只有白斑出现是否属于正常现象，为了回答

这些问题，设计了本试验。 1材料与方法

1．1 试剂、质粒及茵株

DNA聚合酶、限制性内切酶Spe I和Nco I、L DNA连接酶等来源于大连宝生物TaKaRa公司，核 酸分子量标准为TIANGEN公司产品，琼脂糖为上

海Sangon公司产品；LB培养基、氨苄青霉素、IPTG、X—gal为北京鼎国公司产品；其余试剂均为国产分析纯。克隆载体pGEM-T Vector为Promega公司产品；

受体菌E．coli TOPIO为TIANGEN公司产品。杜仲

过氧化物酶Eucommia ulmoides peroxidase a基因(PODa，AY714072)片段(3’端，长度为630 bp的

一段序列，下同)。重组质粒(PODa片段+pGEM Vector)o 1．2 PODa片段、pGEM．T Vector的重组与转化 利用PCR技术，将目的基因PODa从重组质粒 (PODa片段+pGEM Vector)中扩增出来，经琼脂糖 凝胶电泳分离并切胶回收后，T。DNA连接酶，于 16。C温度下与载体pGEM-T Vector连接过夜。然后

将连接产物转化E．coli TOPl0菌株，在含有IPTG和x．gal的LB平板上筛选重组子。

1．3 空载体pGEM-T Vector的转化

将商品载体pGEM．T Vector转化E．coli TOPl0 菌株；pGEM．T Vector用T。DNA连接酶作用后，转 化E．coli TOPl0菌株，方法同1．2。 1．4重组质粒的转化

将重组质粒(PODa片段+pGEM Vector)直接

转化E．coli TOPl0菌株，然后筛选重组子，方法同1．2。待菌落长出来后，提取重组质粒?。

1．5含目的基因PODa的重组质粒的酶切、连接、 转化

将重组质粒(PODa片段+pGEM Vector)采用 Spe I和Nco I双酶切后，经琼脂糖凝胶电泳分离并 分别回收，获得PODa基因片段和线性质粒。再将

二者用T。DNA连接酶重新连接、转化后，筛选重组子，方法同1．2。

1．6线性质粒的转化

将1．5中双酶切后获得的线性质粒转化E．coli TOPl0菌株，方法同1．2。

2结果与分析

2．1 目的基因PODa与载体pGEM—T Vector的重组 转化

基因PODa与载体pGEM．T Vector重组后，在

LB平板上筛选重组子。结果显示，在平板上长出两种颜色的菌落。重组质粒转化子为白斑，而未重组质粒转化子为蓝斑。

2．2栽体pGEM．T Vector的转化

将商品载体pGEM-T Vector转化E．coli TOPl0

菌株，结果显示，只在LB平板上长出少数几个蓝色的菌落。说明商品载体pGEM．T Vector中存在着非线性的环化载体。在T．DNA连接酶作用后，蓝斑

显著增多，说明部分载体发生自连环化。 2．3重组质粒的转化

重组质粒(PODa片段+pGEM Vector)的转化

效率要比连接产物的转化效率高，涂板16 h后，E．coli TOPl0菌落出现白斑，几乎长满了整个平板，继续培养至40 h，菌落中有些白斑变为蓝斑，说明培养基中有少量的X．gal被降解。

2．4含目的基因PODa的重组质粒的酶切、连接、 转化

__重组质粒经Spe I和Nco I双酶切后，获得 PODa基因片段和线性质粒(图1)。将二者对应

的条带进行切胶、回收、纯化，再连接、转化后培养，在LB平板上长出白色的菌落，但无蓝色菌落

出现。

2．5线性质粒的转化

将1．5中双酶切后获得的线性质粒转化E．coli TOPl0菌株，在LB平板上没有长出任何菌落，说明

线性质粒不能成功转化。 万方数据 3讨论

在基因工程技术中，将外源基因DNA插入到质 粒载体上，构建重组质粒时，外源DNA片段与质粒

载体的连接以及转化过程都存在一定的效率，因此最后生长出来的菌落并不是都带有目的基因的。这就需要采用特殊的方法筛选出可能含有目的基因的重组体克隆。

本试验通过5种方案来研究质粒的转化过程及 Q．互补与蓝白筛选机制。试验结果证明： (1)线性质粒载体转化不成功。经双酶切的质

粒载体自身不能环化，也不能成功转化。在大肠杆菌中尚未发现线性质粒的存在，酶切后的线性质粒载体如果进入大肠杆菌后有可能遇到自身复制上的障碍，或者被宿主细胞中的酶所降解，因而其转化菌在筛选培养基上不能长成菌落。

(2)蓝斑是环状质粒转化子形成的。pGEM．T

Vector载体是在pGEM载体的基础上改造而成，两 个3’端都有突出T，很多DNA聚合酶在进行PCR扩 增时会在PCR产物双链DNA每条链的3’端加上一

个突出的碱基A，刚好能与pGEM—T Vector 3’端的T 互补连接，可以提高PCR产物的连接和克隆效率。

进行转化后，在含有IPTG、X．gal的平板上培养时，可以通过蓝白筛选，判断载体中有无DNA片段的插入。理论上讲，末端带有T碱基的载体是无法自我

连接成环状的，而试验又证明线性质粒又不能成功转化，所以，蓝斑只能是环化质粒转化子形成的。由此，可能的接近合理的解释是商品pGEM．T Vector

载体中存在少量环状质粒和平末端的线性载体(末 端无突出的T碱基，在L连接酶作用下少数可以自

连成环状)；在参考魏群的方法旧一1进行基因重组时，单酶切方案中有蓝斑出现，是由于载体自连；而双酶切方案中，只有白斑而不能长出蓝斑的原因是：双酶切后的载体无法自连，非重组的线性载体又不能转化。

(3)一般转化后的重组子会形成白斑，有些情 况下这些白斑会逐渐转变成蓝斑。白斑是由于外 源DNA插入LacZ基因中，造成Ⅸ-互补失败，以至

于不能降解生色底物X．gal；对于时间长了白斑会变成蓝斑的现象，这里给出一个合理的解释：DNA 插入后，LacZ会表达并合成出融合蛋白，在一定条件下(如插入DNA序列不长，且不改变LacZ的读

码框)，融合蛋白还有着较低的酶活性，经过较长

时间后，也会有少量X．gal被降解，释放出蓝颜色来。在试验中，有些白色菌落并不一定是真正的

重组子，因为载体自身的缺失或非目的基因的插入，都有可能使转化的细胞获得相同的特征，所以，重组质粒转化宿主细胞后，对转化菌落必须进一步筛选和鉴定。