蛋白质 进行改造，利用基因操作技术对DNA或mRNA进行 改造 和 修饰以期获得化学结构更为合理的蛋白质。
2酶的固定化方法主要可分为四类分别为： 吸附法 、 包埋法 、 共价键结合法、和 交联法。
3、吸附法是通过载体表面和 酶分子 表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法，是固定化中 最简单 的方法。吸附法又可分为 物理吸附 法 和 离子吸附 法。
4、 重氮法是将 酶蛋白 与水不溶性载体的重氮基团通过 共价键 相连接而固定化的
方法，是共价键法中使用最多的一种。
5、酶反应器有两种类型：一类是直接用游离酶进行反应，即 均相酶反应器；另一类是应用固定化酶进行的 非均相酶反应器 。
6、酶联免疫测定（即ELISA）的基本原理包括以下两点：（1）利用 抗原与抗体 的特异反应将待测物与酶连接；（2）通过酶与底物产生 颜色反应 ，用于定量测定。 二、名词解释
1、同工酶：同工酶的命名 ：
同工酶是指在生物体内或组织中催化相同反应而具有不同分子形式（包括不同的氨基酸序列、空间结构等）的酶，这种分子形式差异是由于酶蛋白的编码基因不同，或者虽然基因相同，但基因转录产物mRNA或者其翻译产物是经过不同的加工过程产生的。
2、产酶促进剂：产酶促进剂是指在培养基中添加某种少量物质，能显著提高酶的产率，这类物质称为产酶促进剂。
3、酶活力：酶活力是指酶催化反应的能力，它表示样品中酶的含量。1961 年国际酶学会规定，l min 催化lμmol 分子底物转化的酶量为该酶的一个活力单位 ( 国际单位 ) ，温度为25 ℃ ，其它条件 (pH 、离子强度) 采用最适条件。
4、溶菌酶:溶菌酶又称为胞壁质酶，是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶。溶菌酶是由129个氨基酸构成的单纯碱性球蛋白，化学性质非常稳定。 三、简答题
1、酶学对食品科学有哪些重要性?
答：（1）酶对食品加工和保藏的重要性（2）酶对食品安全的重要性（3）酶对食品营养的重要性（4）酶对食品分析的重要性（5）酶与食品生物技术
2、在酶的纯化方法中，酶和杂蛋白根据它们的性质差异有哪些分离方法？
答：酶和杂蛋白的性质差异大体有以下几个方面，它们的分离方法根据这个基础分为： (1) 根据分子大小而设计的方法。如离心分离法、筛膜分离法、凝胶过滤法等。
(2) 根据溶解度大小分离的方法、如盐析法、有机溶剂沉淀法、共沉淀法、选择性沉淀法、等电点沉淀法等。
(3) 按分子所带正负电荷多少分离的方法，如离子交换分离法、电泳分离法、聚焦层析法等。 (4) 按稳定性差异建立的分离方法，如选择性热变性法、选择性酸碱变性法、选择性表面变性法等。 (5) 按亲和作用的差异建立的分离方法，如亲和层析法、亲和电泳法等。 3、固定化酶有哪些优点？ 答：固定化酶的优点：
（1 ）同一批固定化酶能在工艺流程中重复多次地使用 ；
（2 ）固定化后，和反应物分开，有利于控制生产过程，同时也省去了热处理使酶失活的步骤 ；
1、酶分子修饰生物法是通过 基因工程 的手段改变蛋白质，即基于核酸水平对
（3 ）稳定性显著提高 ；
（4 ）可长期使用 ，并可预测衰变的速度； （5 ）提供了研究酶动力学的良好模型。 4、固定化细胞有哪些优越性？
答：①无需进行酶的分离和纯化，减少酶的活力损失，同时大大降低了成本；
②可进行多酶反应，且不需添加辅助因子，固定化细胞不仅可以作为单一的酶发挥作用，而且可以利用菌体中所含的复合酶系完成一系列的催化反应，对于这种多酶系统，辅助因子再生容易； ③对于活细胞来说，保持了酶的原始状态，酶的稳定性更高，对污染的抵抗力更强；
④细胞生长停滞时间短，细胞多，反应快等等。正是由于固定化细胞的这些无可比拟的优势，尽管其出现远远晚于固定化酶，但其应用范围比固定化酶更为广泛。
当然，固定化细胞也有其自身的缺点，如：必须保持菌体的完整，需防止菌体的自溶，否则影响产物的纯度；必须抑制细胞内蛋白酶对目的酶的分解；胞内多酶的存在，会形成副产物；载体、细胞膜或细胞壁会造成底物渗透与扩散的障碍等。 5、酶的一般特征有哪些?
答：1、酶的催化效率高。酶的一个突出的特点是催化效率极高。同一反应，酶催化反应的速度比一般催化剂催化的反应速度要大10～10倍。有极少量酶就可催化大量反应物发生转变。
2、酶作用的专一性。酶的另外一个特点是它具有高度的专一性。酶对其所作用的物质（称为底物）有着严格的选择性。一种酶仅能作用于一种物质，或一类分子结构相似的物质，促其进行一定的化学反应，产生一定的反应产物，这种选择性作用称为酶的专一性。酶的专一性是酶的特性之一。 6、在酶的提取中，生物组织的破碎方法有哪些？
答：1) 机械 (匀浆) 法，利用机械力的搅拌、剪切、研碎细胞。 (2) 超声波法 (3) 冻融法 (4) 渗透压法(5) 酶消化法 (6) 化学破碎法
7、固定化酶的活力在多数情况下比天然酶的活力低，其原因有哪些？
答：固定化酶的活力在多数情况下比天然酶的活力低，其原因可能是：①酶活性中心的重要氨基酸残基与水不溶性载体相结合； ②当酶与载体结合时，它的高级结构发生了变化，其构象的改变导致了酶与底物结合能力或催化底物转化能力的改变； ③酶被固定化后，虽不失活，但酶与底物间的相互作用受到空间位阻的影响。 也有在个别情况下，酶经固定化后其活力升高，可能是由于固定化后酶的抗抑能力提高使得它反而比游离酶活力高。
8、利用微生物产酶的优点有哪些？
答：1) 微生物种类多、酶种丰富，且菌株易诱变，菌种多样。(2) 微生物生长繁殖快，易提取酶，特别是胞外酶。(3) 微生物培养基来源广泛、价格便宜。(4) 可以采用微电脑等新技术，控制酶发酵生产过程，生产可连续化、自动化，经济效益高。(5) 可以利用以基因工程为主的现代分子生物学技术，选育菌种、增加酶产率和开发新酶种。 四、论述题
1、溶菌酶在食品上的应用？
答：（1）溶菌酶用于水产类熟制品、肉类制品的防腐和保鲜。溶菌酶可作为鱼丸等水产类熟制品和香肠、红肠等肉类熟制品的防腐剂。只要将一定浓度(通常为0.05%)的溶菌酶溶液喷洒在水产品或肉类上，就可起到防腐保鲜的作用。（2） 用于新鲜海产品和水产品的保鲜 一些新鲜海产品和水产品( 如：虾、蛤蜊肉等) 在0.05% 的溶酶菌和3% 的食盐溶液中浸渍5min 后，沥去水分，进行常温或冷藏储存，均可延长其储存期。 （3） 在乳制品中的应用。溶菌酶是婴儿生长发育必需的抗菌蛋白。因为溶菌酶是人体的一种非特异性免疫因子 ，对杀死肠道腐败球菌有特殊作用 。溶菌酶 也 可以促进人工喂养婴儿肠道细菌群的正常化；它能够加强对血清灭菌蛋白，r- 球蛋白等体内防御因子，以增加对感染的抵抗力，特别是对早产婴儿有预防体重减轻，预防消化器官疾病，增加体重的功效 。所以溶菌酶是婴儿食品、婴儿配方奶粉等的良好添加剂。 溶菌酶还可用于乳制品防腐，尤其适用于巴氏杀菌奶，能有效地延长其保存期，由于溶菌酶具
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有一定的耐高温性能，也适用于超高温瞬时杀菌奶。
（4） （5） （6）
在糕点和饮料上的应用。在糕点中加入溶菌酶，可防止微生物的繁殖，起到防腐作用。 用于制备细胞浸提物 用溶菌酶制备酵母膏，不仅可以提高浸膏量的收率，还可以大大缩短酵母膏
的制备时间。
溶菌酶在食品包装工业中的应用 将溶菌酶固定化在食品包装材料上，生产出有抗菌功效的食品
包装材料，以达到抗菌保鲜功能。目前许多肉制品软包装都需要经过高温灭菌处理。经过处理的肉制品脆性变差甚至产生蒸煮味。如果在产品真空包装前添加一定量的溶菌酶(1%～3%)，然后巴氏杀菌(80～100℃，25～30min)，可获得很好的保鲜效果。
（7）、在功能性食品中的应用 溶菌酶是一种无毒、无害的高盐基蛋白质，且具有一定的保健作用，有抗感染和增强抗生素作用效力，促进血液凝固及止血作用，有组织再生作用。因此，可以在保健食品中添加一定量以提高保健效果。
2、超氧化物歧化酶SOD在食品中的应用？
答： 1 、SOD可制成口服液、化妆品使用2 、SOD作为抗氧化剂3、 作为食品营养强化剂 3、ELISA技术在食品分析中的应用? 答：（1）毒素检测
真菌毒素是真菌产生的次级代谢产物，其中的十几种对人类危害较大，它们一般同时具有毒性强和污染
频率高的特点。其中毒性最大、致癌能力最强的是黄曲霉毒素。它在自然界中分布十分广泛，黄曲霉常常和其他多种微生物在一起，生长在粮食、油料作物的种子、各种食品和饲料中。
自1977年抗黄曲霉素B1的单克隆问世至今，几乎所有重要真菌毒素如伏马毒素、赭曲毒素、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯酮、展青霉素等的ELISA 检测方法均已建立。在对黄曲霉素B1(AFT B1)的检测中，其检测AFT B1的线性范围0.25～5.Oμg/mL，灵敏度为12.5 Pg，整个测定过程仅为4h。另外该方法也正在被广泛地应用于各种藻类和贝类毒素的检测。 黄曲霉素B1 ELISA试剂盒
本试剂盒包括用于定量检测黄曲霉素B-G的试剂和方法。 检测数量：96孔（包括标准） 检测时间：20分钟 （2）农药残留检测
酶联免疫测定已成为许多国际权威分析机构如AOAC分析农药残留的首选方法。迄今为止，应用酶联免
疫测定检测食品中的残留农药主要为除草剂、杀虫剂和杀菌剂。草甘膦的ELISA检出下限为0.07μg/mL，与色谱法测定的结果一致。
从目前来看，尽管ELISA检测限度还不能完全达到国外发达国家技术法规和限量标准的要求，而且抗体
制备不易和不能同时完成多种农药残留检测等缺点，但是由于该技术具有样本前处理简单，纯化步骤少，大量样本分析时间短，适合于做成试剂盒现场筛选等优点，使其可在蔬菜产区、蔬菜批发市场和海关配备，工商人员可随身携带或建立固定的农药残留速测点，随时把残毒超标的蔬菜、水果杜绝在食用之前。 （3）细菌污染检测
食品中的有害细菌数量达到一定数目，食用后会引起各种疾病。为了有效地控制其传播，就必须有快速
和可靠的检测方法。目前有许多种方法，其中通过制备单克隆抗体分析食品中细菌的酶联免疫测定技术研究最多，检测结果准确可靠。 沙门氏菌的ELISA检测
例如对沙门氏菌最低检测量可达500CFU/g，仅需22h，比常规方法缩短了3～4 d，与金黄色葡萄球菌、
大肠杆菌无交叉反应。此外以ELISA技术为基础的全自动沙门氏菌检测系统，实现了整个过程的自动化，全程耗时仅为45min。其原理是将捕捉抗体包被到凹形金属片的内面，可以从前增菌液中吸附被检的沙门氏菌，对于该系统来说，需要做的只是加样。 李斯特氏菌的快速检测
在对李斯特氏菌的快速检测中，利用三株针对单核细胞增生李斯特氏菌、无害李斯特氏菌和西里杰氏李
斯特氏菌共同表位的单抗，以夹心ELISA法，在48h内，可从人工模拟肉中检测下限为5CFU/g样品。 （4）肉类品质检测
ELISA在肉类食品品质检测中的应用主要包括加热终温判定分析和掺入异种肉的检测两个方面。肠道疾
病的爆发和动物性食品有很大关系，而肉食品加热煮制不当是引起该疾病爆发的一个主要原因。在加热过程中一些成分的含量会降低，而一些产物的浓度会提高。
当用蛋白质做指示剂时，可制备抗体，这种抗体对单一蛋白质的天然状态或变性状态均具有专一性，这
样它就可以指示蛋白质在加热过程中变化。因而ELISA可作为商业上快速判定分析肉品终温的一种方法。目前用的最多的是对乳酸脱氢酶的免疫检测。其次是对掺入异种肉的检测，利用多克隆抗体对血清白蛋白的酶联免疫测定法，对鲜肉进行掺假检测。
几种以单克隆抗体为基础的ELISA反应已得到应用，可以检测出1%～2%的掺假率。目前在商业上，酶联免疫测定已可以检测十多种动物肉，该方法已为美国农业部使用。同时，ELISA技术也可以利用对热稳定的肌肉抗原来检测加热处理后的肉掺假情况。目前，该技术可以检测6种家畜熟肉制品。 （5）动物性食品中药物残留检测
利用ELISA技术测定动物性食品中有害残留成分只是近几年的事。随着研究的深入，由原样品的复杂处理和抽提发展为只需要高度纯化过程，加速了其在实际检测中的应用。特别是对猪肉、禽肉和水产品中重要禁用兽药的检测。
如瘦肉精（盐酸克伦特罗）酶联免疫检测法，基于抗原抗体反应进行竞争性抑制测定，不仅可作为一个定性筛选过程，也可以进一步进行定量测定。检测灵敏度可达到0.5×10-9，完全达到我国农业部目前的1×10-9监督检测标准。ELISA法作为盐酸克伦特罗残留量的筛选方法具有操作简便、准确快速的特点，适用于大量样品的测定，并可能成为国家标准检测方法。 配 置 对 照 设 置
阴性：0 ng/ml 阳性：5 ng/ml
（6） 人畜共患疾病病原体检测
在禽流感病毒检测方面，我国已完成了禽流感流行株的分离和鉴定、禽流感重组核蛋白诊断抗原的研制
及应用，建立了禽流感免疫酶诊断方法和技术，已形成试剂盒生产能力。此外，采用ELISA法可以有效检测牛及羊朊病毒蛋白，该蛋白可引起牛的病理性海绵状病毒，是一种致死性神经系统疾病（疯牛病，BSE），与人群发生变异型克雅氏病（VCJD）有关。 取胴体肌肉 加水剪碎 插入试纸约30秒 取出平放1—5分钟 试纸条检测结果的显示 （7） 重金属污染检测
金属硫蛋白遍存于自然界，细菌、植物、动物以及人类肌体中，是一类对重金属离子有很强亲和力，含
丰富的半胱氨酸（约1/3），不含芳香族氨基酸和组氨酸的低分子量蛋白质。金属硫蛋白含有大量的-SH，能与Hg、Cd、Cu、Ag等重金属离子结合掩蔽金属的毒性，对细胞内的金属离子有重要的解毒作用。
生物细胞，在环境受重金属污染（Cu、Hg、Cd、Pb、Zn与金属离子）的情况下，可被诱导合成出大量
的金属硫蛋白，且在一定范围内成正比，是一项对金属污染具特异性的指标。用纯化的金属硫蛋白对兔进行免疫，兔抗血清纯化后并标记辣根过氧化酶，可实现对食品中重金属污染的超微量检测。 （8） 食物中其它成分检测
ELISA技术同时可以用于食品中其它成分的检测，如:(1)检测某些特定的转移基因表达蛋白，以分析食品
是否来自转基因生物或者含有转基因成分；（2）食品中营养素的测定，最小检出限可达0.05μg/g；（3）通过合成不同异黄酮的羟酸半抗原，分析植物中含量很低的雌激素；（4）可用于检测食品加工过程中的酶（如磷酸丙糖异构酶和转谷氨酰胺酶）含量的变化等。
4、酶的固定会根据酶自身的性质、应用目的、应用环境来选择固定化载体和方法，在具体选择时，一般应遵循以的原则是什么？
答: 在具体选择时，一般应遵循以下几个原则。
（1 ）必须注意维持酶的构象 ，特别是活性中心 的构象。酶的催化反应取决于酶本身蛋白质分子所
特有的高级结构和活性中心，为了不损害酶的催化活性及专一性，酶在固定化状态下发挥催化作用时，既需要保证其高级结构，又要使构成活性中心的氨基酸残基不发生变化。
这就要求酶与载体 的结合部位不应当是酶的活性部位 ，应避免活性中心的氨基酸残基参与固定化反
应；另外，由于酶蛋白的高级结构是凭借疏水键、氢键、盐键等较弱的键维持的，所以固定化时应采取尽可能温和的条件，避免那些可能导致酶蛋白高级结构破坏的条件 ，如高温、强酸、强碱、有机溶剂等处理。
（2 ）酶与载体必须有一定的结合程度 。酶的固定化既不影响酶的原有构象，又能使固定化酶能有效
回收贮藏，利于反复使用。
（3 ）固定化应有利于自动化、机械化操作 。这要求用于固定化的载体必须有一定的机械强度，才能
使之在制备过程中不易破坏或受损。
（4 ）固定化酶应有最小的空间位阻 。固定化应尽可能不妨碍酶与底物的接近，以提高催化效率和产
物的量。
（5 ）固定化酶应有最大的稳定性 。在应用过程中，所选载体应不和底物、产物或反应液发生化学反
应。
（6 ）固定化酶的成本适中 。工业生产必须要考虑到固定化成本，要求固定化酶应是廉价的，以利于
工业使用。
5、蛋白酶作为食品添加剂的应用？
•答：1、作为肉类嫩化剂，多使用木瓜蛋白酶。从宰杀老龄的动物得到的肉类，经烧煮后口感粗糟和坚硬。
肉类中存在一定数量的胶原蛋白质，胶原蛋白质中的交联数目和强度随动物年龄的增加而提高。木瓜蛋白酶作用效果从肉类感官评定和剪切力测定中可以看出。
适合于配制肉类嫩化剂的蛋白酶必须具有较高的耐热性。这是因为嫩化剂的作用主要发生在当肉类被烧煮，温度逐渐升高，而酶尚未失活之前的这个阶段。烧煮导致肉类结缔组织中胶原蛋白质和强性蛋白质变性，而蛋白酶较易作用于变性的胶原蛋白质和弹性蛋白质。木瓜蛋白酶在60~65度时使胶原蛋白质增溶的速度最快。
•2、绿茶饮料浑浊：浑浊物质主要是由蛋白质（15~65%）和多酚类化合物（10~35%），通称茶乳酪（creamy）,
是绿茶饮料生产中的关键，添加木瓜蛋白酶除去绿茶浸提液中的蛋白质，对稳定绿茶饮料十分有利。 6、酶联免疫测定（ELISA）试剂盒的组成。
答：（1）包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；（2）酶标记的抗原或抗体（标记物）；（3）酶作用的底物（显色剂）；（4）阴性和阳性对照品（定性测定），参考标准品和控制血清（定量测定）；（5）结合物及标本的稀释液；（6）洗涤液；（含吐温20磷酸盐缓冲液） （7）酶反应终止液。（常用硫酸）酶标仪和酶标板
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