ActaPhysiologicaSinica
促肾上腺皮质激素对慢痛大鼠脊髓
生长抑素、c2fos表达及痛反应的影响
武 强 李希成 阮怀珍 黎海蒂
(第三军医大学生理教研室,重庆400038)
摘 要 本研究应用免疫组化、原位杂交和痛级均数测定法,探讨鞘内注射促肾上腺皮质激素
(ACTH)对甲醛引起大鼠脊髓内生长抑素(Som)、c2fos表达及痛反应的影响。结果表明,足底注
射甲醛可使大鼠脊髓内c2fos样免疫反应(FLI)、Som样免疫反应(Som2LI)、FLI/Som2LI及前
Som原mRNA(PPS2mRNA)神经元数目显著增多以及痛级均数(PIR)显著升高。而鞘内注射ACTH可显著抑制甲醛引起的大鼠脊髓内FLI、Som2LI、FLI/Som2LI及PPS2mRNA增多和PIR
升高效应。鞘内预先注射赛庚啶可阻断ACTH的抑制效应,而荷包牡丹碱、纳洛酮则无影响。结果提示,52羟色胺受体可能参与ACTH抑制甲醛引起的痛反应。关键词:ACTH;生长抑素;原癌基因c2fos;脊髓;免疫组化;原位杂交学科分类号:R33813
ACTH在中枢神经系统作用广泛,并参与痛觉调制。据报道,ACTH不仅可通过脑内52
HT和GABA产生镇痛作用[1,2],脊髓表面滴注ACTH也有镇痛效应,并有量效关系[3]。而脊髓内的生长抑素(somatostatin,Som)作为第一级伤害性传入神经末梢释放的一种神经递
[6]
质或神经调制物,已被众多学者所公认[4,5]。本研究用c2fos为伤害性刺激的“标志物”,观察鞘内注射ACTH对甲醛引起的痛反应和脊髓Som神经元的影响,探讨ACTH在脊髓痛觉调制中的作用。
1 材料和方法
实验用Wistar大鼠60只,体重200～220g,雌雄不拘。111 药品和试剂 ACTH,天津生物制品公司产品,溶于人工脑脊髓液(ACSF)内;c2fos抗血清(1∶2000),CambridgeResearchBiochemicals产品;Som抗血清(1∶5000),Sigma产品。前Som原mRNA(perprosomatostatinmRNA,PPS2mRNA)原位杂交试剂盒由第三军医大学组织胚胎教研室提供。ABC试剂盒,Vector公司产品;赛庚啶(cyproheptadine),荷包牡丹碱(bicuculline)和纳洛酮(naloxone)皆为Sigma产品,均溶于ACSF内。112 实验分组 实验分7组:(1)正常对照组(10例),2例动物不给任何刺激,作为空白对照;4例右后足内注射150μl生理盐水;4例鞘内注射ACSF15μl。(2)甲醛组(10例),大鼠右后足底注射5%甲醛液150μl。(3)ACTH小剂量组(9例),鞘内注射ACTH(015U/10μl)的同时,足底皮下注射5%甲醛液150μl。(4)ACTH大剂量组(9例),鞘内注射ACTH(1U/10μl)的同时,足底皮下注射5%甲醛液150μl。(5)赛庚啶组(8例),鞘内预
1997209215收稿 1998203212修回
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1期 武 强等:促肾上腺皮质激素对慢痛大鼠脊髓生长抑素、c2fos表达及痛反应的影响61
先注射赛庚啶(5mg/ml,5μl),5min后再向鞘内注射ACTH(1U/10μl)+F(Formalin)。(6)荷包牡丹碱组(7例),鞘内预先注射荷包牡丹碱(1mg/ml,5μl),5min后再向鞘内注射ACTH(1U/10μl)+F。(7)纳洛酮组(7例),鞘内预先注射纳洛酮(1mg/ml,5μl),5min后再向鞘内注射ACTH(1U/10μl)+F。113 鞘内注射 动物麻醉后按文献[7]方法进行脊髓蛛网膜下腔插管。待动物清醒后观察确无肢体功能损害后继续饲养,5～7d后,在脊髓蛛网膜下腔注射药物,药物容量15μl,并用生理盐水冲洗管道,总容量20μl,5mim注射完毕。114 甲醛足内注射行为法 在大鼠右后足底皮下注射5%甲醛溶液150μl,注药后将大鼠置于笼内观察其行为反应,按Dubuisson[8]痛反应程度的四级记分法计算其痛级均数(painintensityrating,PIR),作为衡量痛反应的标准。PIR越大痛反应越明显。
115 前生长抑素原mRNA原位杂交法 以地高辛标记的反意cRNA探针按文献[9]叙述
步骤进行原位杂交前、杂交和杂交后处理。抗地高辛抗体工作浓度为1∶1000,以NBT/BCIP(每毫升400μg/200μg)反应液显色。对照实验包括用2μg/mgRNA酶A预处理切片30min和用不含探针杂交缓冲液杂交,结果均检测不到明显的杂交信号。116 免疫组化法
11611 c2fos,Som免疫组化法 在鞘内或足底注射药物后2h,按常规进行大鼠组织灌
流、固定,取脊髓腰段进行冰冻切片(40μm),然后进行ABC免疫组化染色。阴性对照分别采用正常羊(或兔)血清和PBS(0101mol/L)代替一抗,随后的步骤完全相同,对照切片上观察不到免疫反应阳性细胞。
11612 c2fos/Som免疫双重染色法 将c2fos免疫组化切片染色后再置入兔抗Som血清
),随后依次进入生物素结合羊抗兔血清(1∶孵育48h(4℃200)和ABC(1∶100)中各孵育2～4h(室温),最后用DAB2H2O2液呈色,Som免疫阳性产物为棕色。
117 数据处理 在每一动物脊髓腰3～4节段随机抽样4片,经图像分析,作阳性细胞计
数,取均数作为该动物的c2fos样免疫反应(FLI)数,Som样免疫反应(Som2LI)数和PPS2
mRNA数。实验数据皆用电子计算机经双样本t检验程序(PDA22)进行统计学处理。结果以均值±标准误(x±sx)表示。
2 结果
211 甲醛引起的大鼠痛反应及对脊髓内c2fos、Som的影响
大鼠右后足底注射甲醛后,动物出现躁动不安、注射足抬起不着地、舔足或咬足等反应,与对照组结果比较,PIR显著升高(图1),2h后免疫组化染色可见脊髓FLI神经元大量出现于右侧背角的浅表层,另外固有核、背角颈部、腹侧部都有许多散在的FLI神经元;与此同时,脊髓Som2LI、PPS2mRNA阳性标记细胞及FLI/Som2LI双染神经元也明显增多,与对照组比较差异显著(P<0101,图2见图版Ⅲ,表1)。
212 鞘内注射ACTH对甲醛引起大鼠痛反应和脊髓内c2fos、Som的影响
鞘内注射ACTH(015U/10μl和1U/10μl)的同时,再注射甲醛2h后,可见PIR降低(图1),脊髓背角FLI神经元、Som2LI、FLI/Som2LI、PPS2mRNA阳性标记细胞数均较甲醛组减少(P<0101,图2见图版Ⅲ,表1)。而鞘内预先分别注射赛庚啶(52HT能受体拮抗
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图 1 鞘内注射ACTH对甲醛引起痛反应
的影响
Fig11 Effectofintrathecallyinjectionof
ACTHonthepainresponsein2ducedbyformalin
剂)、荷包牡丹碱(GABA能受体拮抗剂)和纳洛酮(阿片受体拮抗剂),5min后再向鞘内注
l),同时注射甲醛,将其结果与ACTH(1U/10μl)+甲醛组比较,可见射ACTH(1U/10μ
只有赛庚啶组大鼠脊髓内FLI,Som2LI,FLI/Som2LI及SommRAN有不同程度的增加(P<0101,图2见图版Ⅲ,表1)。
表1 鞘内注射ACTH对慢痛大鼠脊髓FLI、Som2LI、FLI/Som2LI和PPS2mRNA的影响Table1 EffectsofintrathecalinjectionofACTHontheFLI,Som2LI,FLI/Som2LI
andPPS2mRNAneuronsinthespinalcordoftheratreceivingformalininjec2tion
GroupsControl
n
FLI 0
15110±1012333810±419++1710±214++13810±92##1612±3111710±119
Som2LI103±817327±201233205±916++151±613++298±1917##153±514154±419
++
FLI/Som2LIPPS2mRNA42±518135±9183385±718++63±716++108±718##63±41762±512
##
10 0
4510±317331210±311++
Formalin(F)10ACTH(015U/10μl)+
9
F
ACTH(1U/10μl)+F9Cyproheptadine+ACTH(1U/10μl)+FBicuculline+
ACTH(1U/10μl)+FNaloxone+
ACTH(1U/10μl)+F
33
877
610±214++
3710±716## 613±215 518±119
P<0101,comparedwithcontrolgroup;P<0101,comparedwithformalingroup;P<
0101,comparedwithACTH+formalingroup.
3 讨论
本实验观察到鞘内注射ACTH可抑制甲醛引起的痛反应、腰段脊髓背角c2fos、Som2LI和PPSmRAN阳性神经元的增多,提示ACTH在脊髓水平参与痛觉调制,抑制了伤害性刺激的传入,而这种抑制作用与52HT受体有关。
据报道,Som是第一级伤害性传入神经末梢释放的一种神经递质或神经调制物[4,5],如伤害性热刺激和化学刺激可使兔脊髓背角的Som释放增多[10]。而本文在大鼠右后足底皮下注射甲醛来引起持续的紧张性伤害刺激,发现痛级均数显著升高,作为中枢神经系统内伤害
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[6]性刺激“标志物”的c2fos在脊髓背角的表达增多,以及Som2LI和PPS2mRNA阳性细胞均显著增加,这与文献报道一致[7,11,12],表明Som与痛觉传递有关,伤害性刺激可使Som合成加速。
ACTH在中枢神经系统参与痛觉调制,不仅通过脑内52HT和GABA产生镇痛作用[1,2],脊髓表面滴注ACTH也有镇痛效应,并有量效关系[3]。本实验在鞘内注射ACTH后,观察到能显著地抑制甲醛引起的脊髓c2fos表达,Som2LI和PPS2mRNA神经元的增多,这在脊髓水平抑制了伤害性刺激的传入,使痛反应减小。
有资料指出,腹腔注射ACTH产生镇痛作用时,海马、下丘脑内52HT含量增加[1],说明ACTH在脑内可通过52HT产生镇痛作用。为进一步了解ACTH在脊髓水平通过何种途径
产生镇痛作用,我们在实验中观察了几种受体拮抗剂的作用,发现赛庚啶能大部分翻转鞘内注射ACTH的作用,提示ACTH在脊髓水平可能也是通过52HT能途径产生镇痛作用的。
3 3 3
图2 脊髓免疫组化,原位杂交染色显微照相
Fig12 Photomicrographofimmunohistochemistryandinsituhybridizationoftheratspinalcord
(rightspinaldorsalhornofL3～4segment)
A.Afterinjectionofisotonicsalineinthehindpaw,someSom2LIweredistributedinthespinaldorsalhorn(×75).B.Afterformalinwasinjectedinthehindpaw,theSom2LIweredensedlydistributedinspinaldorsalhorn(×75).C.I1t1ofACTHafterscformalin,theSom2LIofdorsalhorndecreased(×75).D.TheSom2LIofdorsalhornincreased5minafteri1t1cyproheptadine,ACTHandscformalin(×75).E.SomePPS2mRNAweredistributedinspinaldorsalhornafterinjectionofisotonicsalineinthehindpaw(×75).F.FormalininjectioninthehindpawledtoPPS2mRNAincreaseinspinaldorsalhorn(×75).G.ThePPS2mRNAofdorsalhorndecreasedfollowingi1t1ofACTHafterscformalin(×75).H.Doubleimmunohistochemicalstainingofc2fosandSom,formalininjectedinthehindpaw,FLI/
Som2LIwasincreasedinspinaldorsalhorn(×300).
参 考 文 献
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Feb.1999,51(1),60～64
EFFECTOFACTHONTHEEXPRESSIONOF
SOMATOSTATINANDc2fosINTHESPINALCORDAND
FORMALINEVOKEDPAINRESPONSE
WU
QIANG,
LI
XI2CHENG, RUANHUAI2ZHEN, LIHAI2DI
(DepartmentofPhysiology,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038)
ABSTRACT
Inthepresentstudy,theeffectofACTHontheexpressionofsomatostatinand
c2fosinthespinalcordandformalininducedpainresponsesinratswerestudiedusing
immunohistochemistryandinsituhybridization.Theresultsshowedthatsubcuta2neousinjectionofformalinintherighthindpawincreasedc2fos2likeimmunoreactivity
(FLI),somatostatin2likeimmunoreactivity(Som2LI),Som2LI/FLIandperproso2matostatinmRNA(PPS2mRNA)inneuronesofrightspinaldorsalhornandsignifi2cantlyenhancedpainintensityrating.ACTHdecreasedtheFLI,Som2LI,Som2LI/FLIandPPS2mRNAlevelsofthespinalcordevokedbyformalin.Thedecreaseofc2
fosorSomlevelduetointrathecalinjectionofACTHinratswithchronicpainwas
preventedbyinjectionofcyproheptadine,butnotbybicucullineandnaloxone.TheresultsindicatethattheserotoninreceptormaybeinvolvedinACTHinducedanalge2sia.
Keywords:ACTH;somatostatin;proto2oncogenec2fos;spinalcord;immunohistochemistry;in
situhybridization
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