MEN1基因在鼠胚胎早期发育中的作用机制及其对SOX4基因调控
的研究
姓名：朱雅欣申请学位级别：硕士专业：内科学（内分泌与代谢病）
指导教师：李果20090501
上海交通大学医学院2006级硕士学位论文
Men1基因在鼠胚胎早期发育中的作用机制及其对
Sox4基因表达调控的研究
中文摘要
研究目的和背景：Men1基因是多发性内分泌腺瘤1型（MEN1）的致病基因，其在多种胚胎组织和成人组织中表达。人类Men1基因定位于11q13,编码一个含610个氨基酸残基的蛋白，Menin。多发性内分泌腺瘤病1型(MEN1)是一种常染色体显性疾病，以家族性的甲状旁腺瘤、胰岛瘤和垂体前叶肿瘤为特征。而在胚胎发育中Men1基因纯合突变的小鼠也会引起多种器官缺陷，包括神经系统，心脏，肝脏，颅，脑等，并导致胚胎死亡。所以其在胚胎发育中起重要的作用。但其分子机制目前仍不甚清楚。
胚胎干细胞（ESCs）是高度未分化的具有多能性的细胞，在悬浮培养时能自动相互聚集成一细胞团，这一细胞团称为胚胎体（EBs）。悬浮培养3-8天，胚胎体（EBs）形成包含有内胚层、中胚层和外胚层的结构，形态上与6天到8天的卵囊期(egg-cylinder stage)的胚胎相似。培养8-10天时胚胎体（EBs）形成一个大的囊状结构，类似早期胚胎种植到子宫内壁后的内脏卵黄囊(visceral yolk sac)结构。也就是说，以胚胎体（EBs）方式在体外模拟体内的早期胚胎发育，能够用来研究胚胎早期发育的机制。
在前期的芯片研究中,我们发现Sox4基因在野生型（Men1+/+）ES细胞及Men1基因敲除(Men1-/-)的ES细胞所形成的EB中存在表达差异。Sox4(Sry/hydroxymethylglutaryl box transcription factor 4)基因是
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Sox4(Sry/hydroxymethylglutaryl box transcription factor 4)基因是一个癌基因，而且在早期胚胎发育过程也发挥重要作用，其基因敲除后的表型与Men1基因敲除所引起的发育异常有部分的相同。故我们推测Sox4基因是受Menin调控的基因之一。我们想通过报告基因的方法进一步明确Men1基因对Sox4基因的调控作用，为进一步的研究打下基础。
材料与方法：1)以野生型(Men1+/+)和Men1基因敲除(Men1-/-)的ES细胞为研究对象，观察这两种细胞在体外分化时所形成的胚胎体（EBs）的数目，形状，大小等形态学上的不同。并提取两种细胞所形成的胚胎体（EBs）的RNA，采用Affymatrix基因表达谱芯片，分析野生型EB和Men1-/-的EB的基因表达差异并用实时定量PCR技术对基因芯片结果进行验证。
2)构建包含小鼠Sox4基因启动子的报告基因载体，利用荧光素酶报告基因系统分析Menin对Sox4基因启动子活性的影响；同时利用实时定量PCR技术检测Sox4基因在Men1-/-的小鼠胚胎成纤维(Mef)细胞和野生型小鼠胚胎成纤维(Mef)细胞中的表达差异。
结果：1)观察两种ES细胞所形成的悬浮培养的EB共10天，两者在数目、大小上无明显差别。MEN1-/-ES细胞形成的EB中间深色区域出现缺失和偏向的数量较正常ES细胞明显增多。
而基因芯片结果发现多个与不同器官发育相关的基因表达变化，如骨发育：Postn，Runx2，Msx2；肝脏发育：Kdr；造血系统：Hox9，Kitl；胰腺
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发育：Sox4，Foxa1，Btc，Igf2，Nfatc1等。
2)Sox4基因启动子活性在Men1-/-的Mef细胞中明显高于在野生型的Mef细胞中的活性，而在Men1-/-的Mef中转入Men1基因后，Sox4基因启动子活性降低。同时Sox4基因在Men1-/-Mef细胞的mRNA的表达是在野生型Mef细胞中的2.5倍。
结论 1）骨发育：Postn，Runx2，Msx2；肝脏发育：Kdr；造血系统：Hox9，Kitl；胰腺发育：Sox4，Foxa1，Btc，Igf2，Nfatc1等。以上基因可能是Menin作用的靶基因，Menin通过调控它们的表达而参与胚胎早期发育。
2）Menin对Sox4基因的表达有调控作用，其可抑制Sox4基因的表达。
【关键词】Men1基因；胚胎发育；基因芯片；Sox4基因；表达调控
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ROLE OF MEN1 GENE IN MICE EARLY EMBRYONIC
DEVELOPMENT AND IN REGULATION OF
SOX4 GENE EXPRESSION
ABSTRACT
Background and Object:The Men1 gene has been identified as the gene responsible for MEN1, a hereditary syndrome transmitted with an autosomal dominant trait. The disease is characterized by a predisposition to multiple endocrine tumors in the parathyroid, endocrine pancreas, and anterior pituitary. Men1 gene, located on chromosome 11q13, encodes a 610-aminoacid protein, termed Menin. Homozygous Men1 mutant embryos die with defects of multiple organs, including the neural tube, heart, liver, cranial, and facial development. So Men1 gene plays a critical role in the development of embryonic multiple organs.However, its molecular mechanism is still unclear.
Embryonic stem cells (ESCs) are undifferentiated with a high degree of pluripotent cells in suspension culture can automatically each time a cell mass accumulation, the cell clusters known as embryoid bodies (EBs). From 3 to 8 days of suspension culture the cells form complex embryoid bodies with endoderm, mesoderm and ectoderm. Many are morphologically similar to embryos of the 6 to 8 day egg-cylinder stage. From 8 to 10 days of culture about half of the embryoid bodies expand into large cystic structures containing
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embryos of the 6 to 8 day egg-cylinder stage. From 8 to 10 days of culture about half of the embryoid bodies expand into large cystic structures containing alphafoetoprotein and transferrin, thus being analagous to the visceral yolk sac of the postimplantation embryo. That is to say ,embryoid bodies (EBs) in vitro can imtate the early embryonic development in vivo . This can be used to study the mechanism of early development of embryos.
In our prophase studies, Sox4 gene was finded that expressed differently in the Men1-/- EBs compared with the wild-type EBs.
Sox4(Sry/hydroxymethylglutaryl box transcription factor 4)gene is an caner gene, and plays a critical role in mice early embryonic development. And Sox4 gene mutant phenotypes have partial similar embryonic development defects compared with men1 gene mutant phenotypes. So we presume sox4 gene is one of the genes which are regulating expression by men1 gene. We want to identify the underlying mechanisms of the interplay between men1 gene and sox4 gene ,using dual-luciferase reporter gene assay system. These may play a foundation role for further studies.
Materials and methods: 1)To study the morphological differences including number ,morphology,size of EB which are formed by wild-type and Men1-/-ES cells. Total RNA was isolated from both wild-type and Men1-/-ES cells. Affymatrix array of mice genome chip was applied to compare the gene expression profiles between wild-type and Men1-/-ES cells. Bioinformatics methods like pathway mining was employed to analysis the gene chip results, which would be further confirmed by Sybgreen real-time RT PCR.
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2)Reporter gene vectors with Sox4 promoter were constructed,and the influence of menin on Sox4 gene promoter activity was analyzed by dual-luciferase reporter gene assay system.Real-time PCR was employed to detect the expression of Sox4 gene in Men1-/- mice Mef cells and wild-type mice Mef cells.
Results: 1) Morphological analysis showed that EBs formed by the Men1-/- ES cells were much similar in size to those formed by wild-type ES cells during the 8 days of suspension culture. But we found that the deep colour area in the normal EBs was at the center of EBs, whereas the deep colour area in the MEN1 -/- EBs was deflected or deficient. Furthermore, the number of EBs derived from Men1 -/- ES cells was also similiar to that of wild-type ES cells.
We characterized in detail gene expression profile of these Men1-/- EBs by microarray techniques and identified a series of putative menin targeted genes, including genes involved in development of bone(e.g., Postn, Runx2, and Msx2), liver (e.g., KDR), blood (e.g., Hox9 and Kitl), and pancreatic islet (e.g., Sox4, Foxa1, Btc, Igf2, and Nfatc1).
2) The sox4 gene promoter activity of men1-/- mef cell is more higher than that of men1+/+ mef cell.when men1 gene was transfected to men1-/- mef cell, the expression of sox4 gene was descreased.
Conclusion: 1) We identified a series of putative Menin targeted genes, including genes involved in development of bone(e.g., Postn, Runx2, and Msx2), liver (e.g., KDR), blood (e.g., Hox9 and Kitl), and pancreatic islet (e.g., Sox4,
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Foxa1, Btc, Igf2, and Nfatc1). Menin may regulate expression of these genes for role in mice early embryonic development.
3) Menin has a role of expression regulation to sox4 gene,and the expression of menin can inhibit the expression of sox4 gene .And the expression level of sox4 gene in men1-/- mef cell was 2.5 times of that in men1+/+ mef cell.
KEY WORDS: Men1 gene; embryonic development; Microarray; Sox4 gene; Expression regulation;
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英文缩写
缩 略 词 表
英文全称
bone morphogenetic protein 2
Cyclin G2
dulbecoo’s modified Eagle’s dedium
days post coitum Embryod body Embryonic stem cells Formely hepatic nuclear fctor
homeobox gene a9 insulin-like growth factor 2 kit ligand (previously named scf) kinase insert domain protein receptor
l-glutamine leukemia inhibitory factor loss of heterozygosity Multiple endocrine neoplasia type 1
Mouse embryonic fibroblast
中文名称 骨形态发生蛋白２ 细胞周期蛋白G2 达尔伯克氏改良伊格尔式培
养基
性交后，房事后...天
胚胎体 胚胎干细胞 以前的肝细胞核因子 A组同源盒基因9 胰岛素样生长因子2
干细胞因子
血管内皮细胞生长因子受体
谷氨酰氨 白血病抑制因子 杂合缺失 多发性内分泌肿瘤1型
小鼠胚胎成纤维细胞
BMP-2 CCNG2 DMEM D.P.C EB ESCS FOXA1 HOXA9 IGF2 KITL KDR L-GLU LIF LOH MEN1 MEF
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MSX2 MMC NFATC1 PBS PCR RT-PCR RUNX2 SOX4 SRY WNT5A PMSF PPAR RIPA RTK SDS
homeobox,msh-like2
Mitomycin C
Nuclear Factor of Activated T cells cytoplasmic,calcineurin-dependent 1
Phosphate-buffered saline polymerase chain reaction reverse-transcriptase-polymerase chain
reaction
runt related transcription factor 2 Sry/hydroxymethylglutaryl box
transcription factor 4 sex-determining region on the y
chromosome
WINGLESS-related MMTV integration
site 5A
phenylmethylsulfonyl fluoride Peroxisome proliferator activated
receptor
Radio immunoprecipitation assay lysis
buffer
Receptor tyrosine kinase sodium dodecyl sulfate
同源激素类2 丝裂霉素C 活化T细胞核因子C1
磷酸盐缓冲液 聚合酶链式反应 反转录聚合酶链反应 小牛相关转录因子2 Y染色体上的性别决定区盒
转录因子4
Y染色体上的性别决定区 无翼相关小鼠乳房肿瘤病毒
整合位点5A型 苯甲基磺酰氟 氧化物酶体增殖体激活受体
RIPA裂解液 受体酪氨酸激酶 十二烷基硫酸钠
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TNF Β-ME
Tumor necrosis factor alpha beta mercaptoethanol
肿瘤坏死因子 β-巯基乙醇
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上海交通大学 学位论文原创性声明
本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。
学位论文作者签名：
日期： 年 月 日
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本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。
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不保密□。
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学位论文作者签名： 指导教师签名：
日期： 年 月 日 日期： 年 月 日
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第一部分 Men1基因在早期胚胎发育中的作用机制
引言
多发性内分泌肿瘤1型（MEN1）是一种常染色体显性疾病，以家族性的甲状旁腺瘤、胰岛瘤和垂体前叶肿瘤为特征。同时一些MEN1病人也可出现肾上腺皮质肿瘤，类癌瘤，脂肪瘤和嗜铬细胞瘤。人类Men1基因定位于11q13，基因大小超过9kb,包含10个外显子。其中外显子2－9及外显子10的5’端480个碱基为编码区，编码一个含610个氨基酸残基的蛋白质：Menin。肿瘤杂合性缺失（LOH）研究表明Men1基因可能是一种肿瘤抑制基因。Men1基因在许多胚胎组织和成人组织中表达。在小鼠中，Men1基因早在受精后的第7天广泛转录，而在妊娠后期，表达更多见于特定组织如：脑，胸腺和肝脏。Phillippe等发现人类中MEN1基因在20周的胚胎组织中有8个组织中可以检测出，包括大脑皮质，肾上腺皮质，心脏，肾脏，垂体，睾丸，胸腺和甲状腺。在大脑皮质中表达最为丰富。
Philippe等构建了一个Men1基因敲除的小鼠模型，发现Men1基因纯合子突变型的胚胎在胚胎期第11.5天至第13.5天间死亡，存在包括神经管不闭合，露脑，心脏萎缩，肝脏发育迟缓等多器官缺陷。但是纯合突变或杂合突变型小鼠的胚胎干细胞(ES)增殖能力与野生型小鼠的ES无明显差异，只是纯合突变型比野生型的ES提早2--3代进入衰退期，提示Menin对细胞增殖和生存是非必需的，但对细胞分化和开始衰老是必需的。
胚胎干细胞是从早期囊胚的内细胞团中分离而来的，在体外滋养层细胞的支持或加入白血病抑制因子(LIF)的情况下，能够维持其不分化状态，保持其自我更新能力。ES细胞在悬浮培养时能自动相互聚集成一细胞团，这一细胞团称为胚胎体(EBs)。悬浮培养3-8天，EB形成包含有内胚层、中胚层和外胚层的结构，形态上与6到8天的卵囊期(egg-cylinder stage)的胚胎相似:培养8-10天时EB形成一个大的囊状结构，类似早期胚胎种植到子宫内壁后的内脏卵黄囊(visceral yolk sac)结构。也
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就是说，以胚胎体方式(EB方式)来诱导ES细胞，其分化过程类似体内胚胎发育过程。为此，我们对正常ES细胞及MEN1-/-的ES细胞悬浮培养形成EB，以观察MEN1基因对胚胎发育的影响。
表达谱基因芯片可以同时检测数万个基因的表达情况，在本研究应用的芯片，拥有5万多个基因探针组，每个探针组又有包括16～20对的核苷酸探针。因此，一次芯片实验，可以获得的信息量是非常巨大的。
作为基因组学研究的一个重要工具，基因芯片十分有利于大通量的基因表达谱的差异比较。我们希望通过这项技术，结合系统生物学的理念，筛选出Men1基因对胚胎发育相关基因的影响。
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材料与方法
一、 材料
1． 实验样本
（1） 细胞和动物
1)正常胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells)men1+/+及men1-/-细胞株：法国里昂CNRS UMR5641实验室张昌贤教授提供
2)孕12.5-14.5天昆明小白鼠：由上海斯莱克实验动物有限公司提供
（2） 主要试剂主要仪器
1倒置显微镜 (Leica DMIL,Leica Micro systems,Germany) 2垂直流超净工作台 (Holten Sterile,U.S.A) 3离心机 (国产)
4 5810R冷冻离心机 （德国eppendorf公司） 5 5415R低温超速离心机 （德国eppendorf公司） 6 恒温四槽水浴箱1070 (德国GFL公司)
7 药品冷藏箱 （ROWSEN BYY-200,中科生命科技股份有限公司） 8 BL3100 电子天平 （Sartorius） 9 BS110S 电子天平 （Sartorius）
TM
10 iCycier PCR扩增仪 （BIO-RAD）
11 EPS-300 稳压稳流电泳仪 （Tanon） 12 GelDoc2000凝胶成像系统 （BIO-RAD） 13 Cyberscan2500 pH计 （EUTECH） 14 4℃/-20℃电冰箱 （Haier 电器） 15 ABI®PRISM 7300荧光PCR仪(ABI Biosystem)
2.主要试剂
1)胚胎干细胞培养试剂
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KNOCKOUT DMEM(GIBCO) 谷氨酰胺(GIBCO) 非必需氨基酸(GIBCO)
胚胎干细胞特供胎牛血清(GIBCO)
β一巯基乙醇(beta mercaptoethanol, β-ME) (SIGMA)
白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF)( Chemicon) 胰酶0.25%Trypsin+0.02%EDTA (GIBCO) 1×PBS (GIBCO)
青霉素（penicillin，100×，终浓度：100U/ml，
链霉素（streptomycin sulfate，100×，终浓度：100µg/ml） 2)饲养层细胞培养试剂 高糖DMEM(GIBCO) 胎牛血清(GIBCO)
青霉素（penicillin，100×，终浓度：100U/ml，
链霉素（streptomycin sulfate，100×，终浓度：100µg/ml） 3)总RNA提取试剂盒：购自Qiagen公司。 4)RT试剂盒：购自Invitrogen公司。
5)实时定量PCR SYBR Premin Ex Taq试剂盒：购自Takara公司。 6)PCR引物：由上海生工生物工程公司合成。 7)PCR试剂
8)Hot star Taq DNA Polymerase(德国Qiagen公司) 9)DNA分子Marker:DL2000(Takara)
10)10×TBE; Tris 107.8克+硼酸55克+EDTA.Na2 8.2克，加双蒸水至1000毫升，混匀溶解。
11)实时定量PCR试剂 a) SYBR Green I(Takara) b) Ex Taq HS(Takara)
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c) dNTP Mixture(Takara) d) ROX Reference dye(Takara) 12) 其它试剂 丝裂霉素－C(SIGMA)
1×PBS溶液：NaCl 8.0g+KCl 0.2g+KH2PO4H2O 1.56g+Na2HPO4 2.58g,加去离子水至950ml,调pH值至7.2，定容至1000ml。分装，高压灭菌。4℃保存备用。 0.1%明胶溶液：明胶0.5g(SIGMA)+去离子水500ml，高压灭菌。4℃保存备用。
3.培液成分
1)MEF培养基:DMEM(葡萄糖4500mg/L) +10%胎牛血清+l00U/ml青霉素+1OOUg/ml链霉素
2) mESCs培养基:KNOCKOUT DMEM(葡萄糖4500mg/L)+15%胚胎干细胞特供胎牛血清+O.1mM 2-巯基乙醇+106IU/L LIF+0.1mM非必需氨基酸+2mM L-谷氨酰胺+100U/ml青霉素+100ug/ml链霉素
3) EB悬浮培养基：KNOCKOUT DMEM(葡萄糖4500mg/L)+15%胚胎干细胞特供胎牛血清+O.1mM 2-巯基乙醇+0.1mM非必需氨基酸+2mM L-谷氨酰胺+100U/ml青霉素+100ug/ml链霉素
4) 细胞消化液：0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA 4.耗材
一次性培养皿、低黏附培养板、一次性离心管、Eppendof管为Corning公司产品。 一次性过滤器为Sartorius产品。
5.分析软件 Curve expert 1.3
ABI Prism 7300 SDS Software
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二：方法：
1. 小鼠胚胎干细胞(mESCs)的培养
1) 小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast, mEF)的制备
取怀孕12.5-14.5d母鼠，断颈处死后，无菌条件下取出胚胎，PBS洗涤三次，除去胚胎的头部和内脏，将剩余组织剪成糊状碎块，0.25% 胰蛋白酶/0.02%EDTA 37℃消化15分钟，加入等体积的含有血清的培养基终止消化，37℃下水浴10分钟，取上层细胞悬液1000rpm/min离心5min，弃上清，加入mEF培养基，使细胞重新悬浮。将细胞以3x105/ml的密度接种在细胞培养皿中，37℃, 5%CO2、饱和湿度条件下培养。每2d换液，每3-4d按1:3的比例传代一次。采用2-3代的细胞作为饲养层细胞，实验前用丝裂霉素-C 10ug/ml处理2.5hr，使其失去增殖能力。用PBS洗涤去除残存的丝裂霉素-C，加入mEF培养基待用。 2) mESCs培养
mESCs接种到新鲜的滋养层细胞上,使用含LIF的mESCs培养基，在37℃ 5%CO2、饱和湿度培养箱内培养。每天换液，2-3d以1:3一1:6比例传代。传代时用PBS洗涤一次，加入0.25%胰蛋白酶/0.02 %EDTA消化，在倒置显微镜下观察，见细胞与细胞之间分开即加入含有血清的培养液终止消化，1200rpm/min离心7min，弃上清，制成单细胞悬液重新接种培养。
2. 胚胎体的形成
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将增殖的ES细胞用0.25%tryptin+0.02%EDTA消化为单层细胞，按2.5×10的
密度接种于低黏附性的六孔板中。用不含LIF的培养液培养10天，以形成胚胎体。每天在倒置显微镜下观察EB并拍照，每天收集每孔中近一半的EB。
3.总RNA提取和鉴定：(总RNA从野生型和MEN1-/-的EB中分别提取)
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3.总RNA提取和鉴定：(总RNA从野生型和MEN1-/-的EB中分别提取)
1）培养板中每孔细胞加入350μlRA1和3.5μl2-巯基乙醇，吹打收集入1.5ml离心管，漩涡混匀。
2）取NucleoSpin Filter Unit 1支放入收集管，加入上液混匀后11000g离心1min，
转移上清至新的1.5ml离心管中。 3）加入350μl70℅乙醇，并上下颠倒5次混匀
4） 取NucleoSpin RNAⅡ吸附柱放在2ml离心管中，上液颠倒混匀3次后加入，11000g
离心30s。
5）将柱子移入新的离心管，加入350μlMDB，11000g离心1min。
6）取10μlrDNase 加入90μl反应缓冲液，混匀。取95μl直接加入柱子，室温放置
15min。
7）柱子中加入200μLRA2,11000g离心30s，弃滤出液，柱子放回原收集管。 8）加入250μLRA3，11000g离心2min，弃滤液，放入新的1.5ml离心管中。 9）加入20μlRNase-Free水11000g离心1min。
10）取2μl样本RNA加DEPC水98μl，以纯DEPC水为校正，进行RNA浓度的测定。 11）另取2μlRNA 进行1％琼脂糖凝胶电泳，观察RNA样本的纯度及完整性。
4. mRNA的DNase Ⅰ酶处理及逆转录反应 步骤如下：
1) 在 RNase-free的PCR管中建立酶消化反应体系：
RNA in water 10×Reaction Buffer
DNase I，Amp Grade （1U/µl） DEPC-treated water to a final volume of
2) 室温下孵育15min。
3) 加1µl 的25mM EDTA Solution终止反应。 4) 65℃孵育10min。
1µg 1µl 1µl 10µl
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5) 将消化后的RNA直接进行RT-PCR。 6) 在微量离心管中依次加入：
Oligo（dT）20（50µM） Step 1、3 mix 10 mM dNTP mix final volume
7) 65℃加热5min，冰上速冷至少1min。
8) 短暂离心使管壁上的液体沉入管底。依次加入：
5×First-strand Buffer 0.1M DTT
RNaseOUTTM （40units/µl）（optional） SuperScriptTM ⅢRT（200 units/µl）
9) 50℃孵育45 min。
10)70℃加热15min终止反应。所得逆转录产物迅速冰浴冷却后于-20℃保存待测。 5.PCR：
1)用PCR方法检测发育标志基因的表达。阳性对照为GAPDH。从PRIMER3软件上设计跨内含子的引物。各引物的序列如下:
表1:发育标志基因引物序列图
扩增片段（bp）
退火温度 （℃） 60 58
4µl 1µl 1µl 1µl 1µl 11µl 1µl 13µl
目的基因 方向 序 列
Otc-3
F 5´- CAATGCCGTGAAGTTGGAGA-3´ 192
R 5´- CAGATGGTGGTCTGGCTGAA -3´ 196 R 5´- TGCCAGCACCAGGAACAAG-3´ F
5´- CCCGAGACCCAGTTCATAGC -3´
Brachyury Fgf-5
198 F 5´- TGTACTGCAGAGTGGGCATC3´ 11
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Nodal
F 5´-CCTCCGCATCCTTCTTCTTC-3´ R 5´-CGCCCATACCAGATCCTCTT-3´ 262
58 56 55 60 55 58 55
GATA-4 Flk-1 Nkx-2.5 EKLF Msx3 GAPDH
F 5´- AAACGGAAGCCCAAGAACCT -3´ 253
R 5´- GAGCAGACAGCACTGGATGG -3´ 211 R 5´- TCCCTGCCTACCTCACCTGT -3´ F R
5´- CAAGTGCTCTCCTGCTTTCC -3´ 5´- GTGGACGTGAGCTTCAGCA -3´
300
F 5´- CCATCCCACTGTCTGTCTGG -3´ F 5´-TAAGAGGCAGGCGGCACATA-3´ 207
R 5´-CCACAGCAGAAGGGACGATG-3´ F 5´-ACACAGAGCACGGACCACTC-3´ 292
R 5´-CGCTCCGCAATGGATAAGTA-3´ F 5´-AACGACCCCTTCATTGAC-3´ R 5´-TCCACGACATACTCAGCAC-3´ 193
2在200ul eppendorf管中建立10ul反应体系：
10×PCR缓冲液 1ul 2.5mM dNTP mix 0.8ul 上游引物 0.16ul 下游引物 0.16ul cDNA 1ul Hot star Taq DNA 聚合酶 0.08ul 双蒸水 6.8ul
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用加样枪轻轻吹打混匀后短暂离心。 3)PCR反应条件：
1)95°C 1 min
2)55°C-60°C 1 min， 3)72°C 1 min ， 4) 30-35 CYCLES 5)72°C 10 min
4)1.2%琼脂糖电泳(电压为100V)，40分钟后紫外光透射下观察结果。 5)将电泳结果于凝胶成像系统拍照。
6)以上实验重复三次。发现结果具有可重复性。
6.基因芯片
按照 RNaesy Micro kit (Qiagen, Germany)方法来抽提Men1+/+和Men1-/-的胚胎体的总RNA。根据Affymetrix microchip array protocol (Affymetrix, Santa Clara, CA)方法，利用微点阵技术来观察Men1+/+和Men1-/-的拟胚体的基因的表达差异情况。使用包含45，000个探针位点的Mouse430_2.0微点阵，来分析超过39，000个转录物和变异型 。微点阵结果使用的Affymetrix电脑软件Microarray Suite 5.0 。 数据分析使用GeneSpring 6.2 (SiliconGenetics, Redwood City, CA) 软件。
7.实时定量PCR 1)加样体系：
SYBR Premin Ex Taq(2×) 15ul 上游引物（10uM） 0.6ul
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下游引物（10uM） 0.6ul ROX Reference Dye(50×) 0.6ul DNA模板 4.0ul 灭菌蒸馏水 9.2ul 总共 30ul
取专用于实时定量PCR的96孔板（AXYGEN®），以MEN1+/+及MEN1-/-ES细胞形
成EB的cDNA为模板，每孔加入DNA模板4ul(浓度10ng/ul),相邻的上下两排所加样本一样，按上述体系加样。 2)PCR反应程序
3)结果分析
A. 荧光本底信号：设定为前10个循环的荧光值
B. 域值：设定为第3-10个循环的荧光信号的标准差的10倍
C. Ct值：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数，实时测定每
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个孔的荧光数值
D.以GAPDH为管家基因，校正每个样品的 Ct
表2 实时定量PCR引物的序列和长度
目的基因 Wnt5a Inhba Smad3
方向
序 列
扩增片段（bp） 157 221 293
F AGGAGTTCGTGGACGCTAGA R GAGCCAGACACTCCATGACA F GGAGAACGGGTATGTGGAGA R TGGTCCTGGTTCTGTTAGCC F CTGGGCCTACTGTCCAATGT R CGCGTCAGCTGGTAGACAG´ F CTCTCCTCTCCTGCCTCTTG R GGCAGTTTCAGCTCCTCATC F CCGTTTTCCCACTCATCTCT R AGATCTGTACCGCAGGCACT F CCACGCTTGACACTCACACT R GTTCCAGCGTCTGGTGTTTT F CTCTGGCCTTCCTCTCTCAGTAA R TAGGTAAAGGTGGCTGGGTAGTG F TTCGAGACCGTGTATGAACTCAC R GGTCAGAACCTTATCCAGCCACT Sox4 217
Bmp2 Hoxa9 Runx2 Smad1 Btc Tgfb2
146 228 149 159
F AGATGGGAACACAACCAGAACAC 237
R AACAGGTCCACTCGCTCACAC F CCCAAAGGGTACAATGCTAACTTC 162
R GAGAATGGTCAGTGGTTCCAGAT F AAGCCCGTGTTGGCGTAG 256
Foxa1
R CAGGGTTGGATGGTTGTGTC
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Smcl12 Ccng2
F GCTCTGTGCTGGGATGAGAA R TTGAGTCGTGTATTGGTTCCTTG F
TCTCCAAAGCAAGACCATCTG
R AGCAGCGAGGCGAAGAATAC F AAGCCCGTGTTGGCGTAG R CAGGGTTGGATGGTTGTGTC F CCAGATGCCCAGCAAGTTC R CGAGGAGCAGGACGAGAATC F AACGACCCCTTCATTGAC R TCCACGACATACTCAGCAC´ 152 189
Igf2 194
Cdkn1c 290
Gapdh
193
注：上行序列为上游引物，下行序列为下游引物，由5ˊ到3ˊ方向排列，以GAPDH为内参。
8．统计学方法
使用SAS6.12软件包对实验结果进行统计学处理。使用配对t检验，P<0.05表明有统计学意义。统计值显示为ⅹ±s。
三、结 果
1．ES细胞的培养和EB的形成
1)用小鼠胚胎成纤维细胞为饲养层细胞的小鼠ES细胞在含LIF的培养液中呈集落、贴壁生长，集落边缘清晰，结构致密，细胞之间的界限不明显(见图1)。 消化后的单个细胞体积小，为圆形或椭圆形，胞浆少，核大。
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图1 在含有LIF的培液中生长于MEF上的小鼠ES细胞(100×) Fig 1 murin ES cells grown on MEF in the presence of LIF(100×)
2)胚胎干细胞在没有LIF的条件下，在低黏附细胞培养板中培养，细胞会悬浮生长，可以形成大小不同的简单球状胚胎体(EB)。(见图2)
图2 悬浮培养中的胚胎体(100×) Fig 2: EBs in suspension (100×)
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2、正常ES细胞与MEN1-/-细胞形成EB形态比较
两种ES细胞形成的EB在形态和数量方面每天无明显差异，MEN1-/-ES细胞形成的EB中间深色区域出现缺失和偏向的数量较正常ES细胞明显增多。这个区域通常认为同红细胞的形成相关，其缺失说明可能存在血液系统发育的缺陷。（见图3）
图3 正常ES细胞与MEN1-/-ES细胞形成EB形态比较
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3、EB发育阶段的鉴定
有研究认为体外分化8天所形成的EB对应的体内胚胎发育的早期器官形成期8.dpc以后。我们利用了一些胚胎发育中不同阶段的标志基因，在第八天的EB中进行了验证。这些基因及其在胚胎发育过程中出现的时间如下：Otc-3 :胚胎外胚层； 0.5-8.5d.p.c 。Fgf5: 胚胎外胚层和胚胎末梢5.25-7.5 d.p.c 。GATA-4 :原始内胚层，内脏，顶骨内胚层；内胚层的衍生物(心内膜，肠，生殖腺)；5.0 d.p.c ――成熟。Nodal: 胚胎外胚层, 原始内胚层，原始前线；6.25-7.5 d.p.c 。Brachyury :中胚层和脊索；6.5-8.5 d.p.c 。Flk-1 :导管；7.0 d.p.c ――成熟。Nkx-2.5 ：心源性中胚层；7.5 d.p.c――成熟。EKLF：血细胞卵黄囊和肝始基；7.5 d.p.c――成熟。Msx3：神经管；8.5 d.p.c—成熟。
抽提悬浮培养第8天EB的RNA进行RT-PCR发应，我们发现这些基因都有表达，(见图4)说明第8天的EB和胚胎发育的早期器官形成期（8.5dpc）大体一致
图4 MEN1+/+和MEN1-/-的ES细胞悬浮八天所形成的EB中胚胎发育相关基因的表达情况。包括otc-3,brachyury,Fgf5,nodal,GATA-4,flk-1,Nkx-2.5,EKLF,Msx3。
Fig. 4. Developmental marker genes expression pattern in EBs formed by the Men1-/- ES cells (MEN-/-) and wild-type ES cells (MEN+/+) at day 8of suspension culture. flk-1, Nkx-2.5, EKLF, Msx3,oct-3, Brachyury, Fgf-5, nodal, and GATA-4 were all detected.
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4．基因芯片结果分析
1)利用芯片技术我们共检测了39,000个基因及转录本在两种EB中的表达差异。从散点图上可以看到两个芯片基因的结果都位于对角线附近，没有系统偏差。而且大部分基因表达基本无差异。我们以变化2倍为标准选取差异基因，结果发现与野生型相比，Men1-/-的EB有517个转录本表达下降，其中已知基因377个。70个转录本表达升高，其中已知基因41个。(见图5)
图5：芯片的各杂交位点二维分布图(Scatter graph)。图上的每个点代表每个基因的平均表达值，以log2为刻度。 横轴代表基因在Men-/- EBs中的表达水平，纵轴代表这个相同基因在野生型EBs的表达水平。在这两种EBs中有相同表达水平的基因出现在第一条对角线(Y=X);在两组中有差异表达的基因分别出现在这条对角线的上面或下面。差异越大，点就越远离Y=X这条线。这两条平行的红线标志着两倍差异的界限。
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Fig.5:Two-dimensional scatter-plot of the microarray results. Each dot represents average expression values for the same gene from Men-/- EBs(horizontal axis) and control (wild type, WT) EBs(vertical axis) on a log2 scale. Genes with similar expression levels appear along the first diagonal (the line y=x); genes with expression levels that are different in the two groups appear above and below this line, respectively; the larger the difference, the farther away the point will be from the y = x line. The two parallel red lines mark the limits for two-fold differences.
对这些差异基因进行功能分类，可以看到这些基因的分子功能有：催化活动，信号传导活动，转录调节活动和运载体活动等等。结果显示在(表6)中。
表6对差异基因进行分子功能分类，在基因转录物和MEN1-/-的EB中的表达变化 TABLE 6 Molecular function categories according to the gene ontology among the
gene transcripts with altered expression in the Men1-/- EBs
在以前的研究中发现与Menin相互作用的基因中，我们发现Smad3(下调2倍),Smad1(下调2.6倍),Runx2(下调2.63倍)。而JunD,Pem,Nm23,NF-Kb,RPA2保持不变，Men1-/-的EB和野生型EB相比。
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据报道，某些HOX基因家族成员，包括HOXA9,HOXA7,HOXA10和HOXC6,HOXC8,受Menin调控，通过Menin和MLL1/2蛋白复合物相互作用来实现。我们的芯片结果显示，HOXA9在MEN1-/-的EB中表达下调。HOXA10在两种EB中保持不变。而HOXA7, HOXC6,HOXC8无论在野生型EB中，还是在MEN1-/-的EB中都没有表达。
此外，许多涉及骨，血液，肝脏，胰岛，神经系统，和四肢发育的因子，例如，Postn,Msx2,Runx2,KDR,Kitl,Sox4,Foxa2,Btc,Igf2,Nfatc1,Wnt5a,Wisp1,Nrp1等；和涉及细胞循环控制的因子包括ccng2,cdkn1c；在MEN1-/-的EB中是下调的。(见表7)
表7 在MEN1-/-的EB中部分表达下调的基因
TABLE 7 Partial results of genes which were down-regulated in Men1-/- EBs
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5．实时定量PCR结果分析
为了检测芯片分析的结果，我们抽取部分基因进行实时定量PCR验证，发现实时定量PCR的结果与芯片结果具有较好的相关性。我们的结果证实在十五个基因中有十四个基因的实时定量PCR结果和芯片结果一致。(见表8)尽管有些基因的实时定量结果与芯片结果相比较，其变化的具体倍数并不完全一致。但是，其变化的方向是完全一致的。
表8 实时定量PCR结果和芯片结果相比较
TABLE 8 Comparison of the qPCR results with the microarray results
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讨 论
多发性内分泌肿瘤1型（MEN1）是一种常染色体显性疾病，以家族性的甲状旁腺、胰岛和垂体前叶肿瘤为特征[1]。同时一些MEN1病人也可出现肾上腺皮质肿瘤，类癌瘤，脂肪瘤和嗜铬细胞瘤。人类Men1基因基因定位于11q13，基因大小超过9kb,包含10个外显子[2]。其中外显子2－9及外显子10的5’端480个碱基为编码区，编码一个含610个氨基酸残基的蛋白质：Menin。
肿瘤杂合性缺失（LOH）研究表明Men1基因可能是一种肿瘤抑制基因。Menin主要分布在细胞核中[3]，在细胞质中和端粒附近也有分布。蛋白质序列分析未发现与Menin同源的蛋白序列，其序列从果蝇到人类高度保守，提示它可能有一种基本的生物学作用。
Men1基因克隆得益于Knudson的“两次打击”(two hits)学说，即生殖细胞水平的Men1杂合突变为第一次打击，在体细胞(肿瘤细胞)水平，常常发生某段染色体的缺失，为第2次打击。
Men1基因在许多胚胎和成人组织中表达。在小鼠中，Men1基因早在受精后的第7天广泛转录，而在妊娠后期，表达更多见于特定组织如：脑，胸腺和肝脏。Phillippe等发现人类中Men1基因在20周的胚胎组织中有8个组织中可以检测出，包括大脑皮质，肾上腺皮质，心脏，肾脏，垂体，睾丸，胸腺和甲状腺。在大脑皮质中表达最为丰富[4]。这些表明，Men1基因在胚胎早期发育中起了一个关键作用。
Philippe等[4]构建了一个Men1基因敲除的小鼠模型，发现Men1基因纯合子突变型的胚胎在胚胎期第11.5天至第13.5天间死亡，存在包括神经管不闭合，露脑，心脏萎缩，肝脏发育迟缓等多器官缺陷。这提示Men1基因在胚胎早期发育起重要作用，但其机制并不清楚。纯合突变或杂合突变型小鼠的胚胎干细胞(ES)增殖能力与野生型小鼠的ES无明显差异，只是纯合突变型比野生型的ES提早2--3代进入衰退期，提示menin对细胞增殖和生存是非必需的，但对细胞分化和开始衰老是必需的[4]。
目前研究发现与menin相互作用的因子有：JunD[5]，Smad3[6]）,nm23[7]）,同源异型
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盒包含蛋白（Pem）[8]和NF-KB家族成员P50，P52，P65等[21]。Menin 抑制生长的作用可能通过其与转录因子的相互作用所介导。酵母双杂交试验提示menin与JunD连接，而JunD参与形成转录因子激活蛋白(AP)-1。在体外试验中，Menin可抑制JunD介导的转录活性。JunD有两种表达异构体，但只有全长型的JunD能够与Menin结合，并被Menin抑制[9]。
另一方面，TGF-β细胞间信号转导子Smad3能够与Menin相互作用，Kaji等[6]发现通过在特定的转录调节部位抑制Smad3与DNA的结合，反义Menin抑制TGF-β介导的转录活性。
Pem是一种胎盘和胚胎表达基因编码的同源盒包含蛋白，Lemmens [8]等证实Menin能够与Pem直接相互作用,两者均主要位于细胞核中，原位杂交试验显示两者在小鼠胚胎和成熟组织中具有相似的表达模式。Yaguchi等[10]发现当存在nm23时，menin有效地将GTP水解为GDP；而当只存在nm23或Menin时，未发现明显的GTP酶活性。同时发现menin中含有与已知的GTP酶或GTP结合蛋白相似的氨基酸序列，能与GTP或GDP特异性地结合。这结果提示，Menin是一种由nm23激发的不典型的GTP水解酶。
此外近来研究表明与Menin相互作用的蛋白还有：胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein)、波形纤维蛋白(Vimentin) , P53。menin与中间丝蛋白三型的胶质纤维酸性蛋白（GFAP)和vimentin结合。共聚焦显微镜发现内源性的menin与二者结合位于神经胶质瘤细胞。发现可能在细胞周期的S期和G2早期中间丝蛋白网络与menin相互作用，并作为Menin的细胞质分离网络[11]。而对这些已知的作用因子在基因水平敲除[12,13,14]不能产生Menin敲除后小鼠的表型，这提示这些作用因子在胚胎发育阶段可能与Menin的功能无关。
胚胎干细胞（Embryonic stem cells,ESCs）是高度未分化的具有多能性的细胞。它是受精卵分裂发育到囊胚时，分离其中的内细胞团(Inner Cell Mass)细胞培养而建立的。ESCs具有以下的重要特征:1)在饲养层细胞和/或含有白血病抑制因子（LIF）的ESCs培养液中，ESCs能在体外无限的增殖，并维持未分化状态。2)具有全能性，可以自我更新并具有分化为体内几乎所有组织的能力。在体外，ESCs可自发分化为含有内胚层、中胚层、外胚层来源的多种组织和细胞的拟胚体。3)具有形成种系嵌
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合体动物的能力，是联系细胞和个体之间的桥梁。4)具有正常的二倍体核型。5)易于进行基因改造。
ES细胞在悬浮培养时能自动相互聚集成一细胞团，这一细胞团称为胚胎体(EBs)。悬浮培养3-8天，EB形成包含有内胚层、中胚层和外胚层的结构，形态上与6天到8天的卵囊期(egg-cylinder stage)的胚胎相似:培养8--10天时EB形成一个大的囊状结构，类似早期胚胎种植到子宫内壁后的内脏卵黄囊(visceral yolk sac)结构
[15]
。也就是说，以胚胎体方式(EB方式)来诱导ES细胞，其分化过程类似体内胚胎发
育过程。为此，我们对正常ES细胞及Men1-/-的ES细胞悬浮培养形成EB，以观察Men1基因对胚胎发育及胰岛ß细胞发育的影响。
作为基因组学研究的一个重要工具，基因芯片十分有利于大通量的基因表达谱的差异比较。我们希望通过这项技术，结合系统生物学的理念，筛选出Men1基因作用的靶基因，进一步证实它在胚胎早期发育中的作用。在对芯片信息进行标准化和总体分析之后，下一步的工作就是对芯片的信息作更深入的分析。目前最常用的方法就是通路分析(Pathway Analysis)。
我们通过表达谱基因芯片发现，menin对以下基因有调控作用。骨发育：Postn，Runx2，Msx2；肝脏发育：KDR；造血系统：Hox9，Kitl；胰腺发育：Sox4，Foxa1，Btc，Igf2，Nfatc1等。这些基因可能是Menin的靶基因，Menin通过调控它们的表达而参与胚胎早期发育。 Menin与骨发育：
Crabtree等[16]研究表明，Men1基因纯合子突变型的胚胎存在颅面部骨的发育缺陷。既然颅骨是由膜内骨化作用形成的，这些发现提示Men1基因在多潜能间充质干细胞分化为成骨细胞系和成骨细胞的分化中起重要作用[16]。而我们的芯片分析显示，Men1基因纯合突变的EB中，成骨细胞分化相关基因的表达要明显低于野生型EB。这些基因包括，Runx2，Postn,Msx2。Men1基因的灭活，抑制了多潜能间充质细胞分化为成骨细胞系[16]。SOWA等[17]证实，Menin对于多潜能间充质细胞分化为成骨细胞系是必要的。其实现是通过Menin与BMP-2（bone morphogenetic protein 2）信号分子Smad1/5和成骨细胞转录调节因子Runx2的相互作用。Runx2是BMP-2信号
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通路的一个关键靶点。现在已经发现[18]，在ST2细胞中，Menin表达减少可以对抗BMP-2诱导的Runx2 mRNA表达。总之，数据显示Menin的灭活特异的抑制多潜间充质细胞分化为成骨细胞系。Menin似乎是一个对成骨细胞定型的重要因子，并且抑制成骨细胞分型后更长期的分化[16]。Junko naito等[19]发现，Menin抑制成骨细胞分化定型后的成熟，其部分作用是通过AP-1激活剂转录因子JunD的分化作用。此外，在另一个表达下调的基因，Msx2，与脊椎动物颅面部发育相关。在Msx2纯合突变的小鼠中，已经发现存在颅骨骨化作用的缺陷和颅盖孔的持续不闭合[20]。这个表型和Men1-/-的小鼠的表型是相似的。这些数据表明Men1基因在胚胎早期发育的骨形成的分化的某些方面起重要作用。在其他的研究中也报道过，Men1基因对成骨细胞的早期分化起重要作用。同时也有研究显示，Men1基因对膜内的骨化作用是至关重要的[18]。
Menin与肝脏发育：
在Men1-/-的小鼠的肝脏发育中，尽管Men1-/-的小鼠胚胎显示了一个明显正常的肝脏结构。但是，病理研究表明其肝脏的上皮结构异常苍白，其造血小室结构也异常，表现为细胞间的接触变得松散，核的浓集的松散等[21]。但导致这个缺陷的分子机制却不甚清楚。而通过我们的芯片分析得到的表达下调的基因，KDR,可能是Men1基因作用的靶基因。KDR，是VEGF受体，在内皮细胞的增殖核分化中起一个关键作用。这一点可能为以上的原因提供了一个线索。据报道，在KDR突变的胚胎中，肝脏虽然会发育，但是缺乏内皮细胞。KDR纯合突变的胚胎在受精后8.5~9.5这个表型和Men1-/-天死于胎内，作为造血细胞和内皮细胞早期发育缺陷的结果[22,23]。的小鼠模型的缺陷相类似。当然，KDR和Menin之间的内在关系的机制还有待进一步证明。
Menin与造血系统发育：
我们的芯片分析结果也显示，野生型EB和Men1-/-的EB在涉及血液系统发育的相关基因存在表达差异。Hoxa9基因,对骨髓和淋巴发育是必要的[24]，在Men1-/-的EB中表达下调（和野生型相比）。研究显示[25]，Menin和混合淋巴细胞性淋巴瘤(MLL)癌蛋白联合共同促进Hoxa9基因的表达。在我们的结果中，MLL在Men1-/-
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的EB中没有任何改变。因此，只是Menin的灭活导致了Hoxa9基因表达的减少。这个结果和Yokoyama’s的研究是一致的。我们同时发现了Kitl,一个造血生长因子，在Men1-/-的EB中表达下调（和野生型相比）。Kitl涉及到红细胞的分化[26]Bertolino等发现，Men1-/-的ES细胞在血红蛋白病中是缺乏的。这在我们的研究中也能够发现。我们认为，Kitl的表达下调可能是其分子机制。 Menin与胰腺发育：
在MEN1综合征中，内分泌肿瘤是最多见的。大约30~50%的病人出现胰腺内分泌肿瘤的症状[27]。胰岛损害是多发性肿瘤出现的特征，包括β细胞的去分化和血管的形成。以上显示，Men1基因和胰岛瘤的发生是相关的。一般来说，发育和分化的异常会导致肿瘤的形成。因而，Men1基因很可能在胰岛的分化和发育中起一个重要作用。在张昌贤的研究中[28]发现，在第一个发育过渡期，Menin涉及早期胰腺内分泌细胞的生存；在胰腺发育阶段，Menin的缺失导致内分泌细胞发育的缺陷，胰腺结构的改变，和表达神经原3细胞数目的减少。又有研究发现在敲除了men1基因的小鼠在胎内死亡前还存在胰岛内分泌细胞α，β细胞的发育异常，说明menin也参与胰岛的发育[28]。其在胰腺内分泌细胞的的发育中起一个必不可少的作用。而在我们的研究中，我们也发现了一些基因(包括Sox4[29],Foxa1,Btc,Igf2,and Nfatc1[30])在Men1-/-的EB中表达是下调的。
BTC是近年来逐渐受到关注的一个胰岛再生相关因子。1993年首先由 Shing从小鼠胰腺β细胞瘤细胞中克隆成功。成熟 BTC为糖基化蛋白,由 80个氨基酸组成 ,主要与表皮 EGF受体家族 erbB-1、erbB-4各自的同二聚体结合发挥作用。继 1996年 ,Mashima和Watada分别将 BTC作用于 AR42J和αTC1. 6细胞 ,诱导其向β细胞方向分化表达胰岛素之后, BTC促胰岛 /胰腺再生的作用得到进一步的证实。综合现有资料 , BTC可能通过以下途径实现上述作用: ①刺激胰腺导管细胞的增殖[31]。② 促进导管来源的 PDX- 1+细胞增殖的同时促进其向β细胞方向分化 ,形成胰岛样细胞簇 ( islet2 like cell cluster, ICC) [32]。③刺激胰岛内的“前体细胞” 的增殖和
～
分化[33]。新近 ,虽然对 BTC促胰岛再生的机制有了更深入研究[3436],但仍不明确 ,
若能阐明这一因子在胰腺 /胰岛发育中的地位 ,以及在糖尿病发生中所起的作用 ,对
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揭示糖尿病的病因无疑将会提供重要线索。
Foxa1(formerly hepatic nuclear factor 3alpha)，即肝细胞核因子。属于foxa基因家族。Foxa家族在胰腺的发育和稳定中起到了一个基本的作用[37]，并且参与内胚层衍生的器官的分化和血糖内环境稳态的调整[38]。我们证明缺乏HNF-3α表达的小鼠发展了一种复杂的代谢综合征。其特征为新生儿永久性低血糖，内分泌机能不全，胰腺的α和β细胞机能障碍。我们已经从实验中了解到foxa1对于氧化磷酸化的有效耦联是必须的，主要通过限制UCP2基因的表达，其在血糖稳定的调节和胰岛的功能中起了一个关键的作用。HNF-3α对于α细胞功能的维持是必须的。在人类，没有见到关于HNF-3α基因突变的描述。尽管如此，HNF-3α小鼠和一些病人的报告有显著类似的基因型。这些病人都有持续的低血糖症和胰高血糖素缺乏。HNF-3α应该被考虑为人类先天性的胰高血糖素缺乏综合征的一个候补基因。
胰岛素样生长因子(insulin2like growth factors , IGFs) 是在细胞增殖(proliferation) 、分化(differentiation) 、程序性细胞死亡(apoptosis) 和转化(transformation) 中具有重要作用的因子。IGFs 包括IGF1 和IGF2 ,两个单链多态分子在氨基酸组成上具有62 %同源性,与胰岛素原(proinsulin) 具有50 %同源性。人和哺乳动物IGF2 分子质量为715KDa ,含有67 个氨基酸。由于在胎儿组织中IGF2 mRNA 水平高于成年动物相同组织中,因此被认为在胎儿生长发育调控中具有重要作用,这已被转基因鼠实验所证实。IGF2减少新生婴儿的胰岛细胞凋亡和体内胰岛细胞坏死和凋亡。IGF2促进胰岛细胞存活，这使我们允许使用一个更小数目的胰岛来移植。胰岛素和IGF在胰腺的β细胞功能和外周新陈代谢中扮演一个重叠的和补偿的作用[39]。
Nfatc1基因，即Nuclear Factor of Activated T cells cytoplasmic,calcineurin-dependent 1，是活化T细胞核因子蛋白家族成员。近期，Heit 等发现钙调神经磷酸酶（Calcineurin，CaN）/NFAT信号通路参与调节胰腺β细胞生长发育及分泌活动,而编码钙调神经磷酸酶调节亚基的Cnb1基因起到了重要的作用
[30，40，41，42]
。研究显示，
活化的CaN对于β细胞中胰岛素的转录是必须的，而其调节作用是通过其下游的NFAT
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系列蛋白来实现的。NFAT与大鼠胰岛素基因启动子上的NFAT结合元件结合，来调节胰岛素基因的转录[43]。
2+
钙调神经磷酸酶（Calcineurin，CaN）是一种依赖于Ca/钙调素（Calmodulin，
CaM）的Ser/Thr磷蛋白磷酸酶，又名磷蛋白磷酸酶-2B（PP-2B），作为一种重要的信号分子，参与机体许多生物进程如生长、分化、死亡及适应性反应等的调节。CaN的一部分作用是通过脱磷酸化激活活化T细胞核因子( Nuclear Factor of Activated T cells,NFAT )来实现的。Calcineurin /NFAT信号通路在免疫系统、呼吸系统、血管系统的生长发育和机能调节及记忆学习等过程中都具有重要的意义[44-47]，
Sox4基因，即Sry/hydroxymethylglutaryl box (Sox)。Sox4基因是以SRY基因为基本成员的一类新的控制发育的基因家族，在个体发育过程中对性别分化及组织器官形成起重要作用。主要特征为具有一个保守基序HMG-box，可与DNA序列特异结合，是一类重要的转录调控因子。Sox4在胰腺中广泛表达，最初表达范围很宽，最后只限制在成熟的胰岛细胞[29]。在Sox4基因纯合突变纯合突变的小鼠中，发现有正常的胰芽形成和内分泌细胞的分化，这种发育状况持续到胚胎期12.5天。在此之后，Sox4基因纯合突变的小鼠的胰腺移出物的体外培养不能形成正常的胰岛[29]。在移植物中我们发现显著减少的内分泌细胞分散出现。说明sox4基因对于胰岛素的发育是必需的。Sox4可以分为，sox4a和sox4b。研究表明，sox4b是一个早期的和暂时的胰腺上皮组织的标记物，并且它涉及到α细胞的分化
[29]
。
在这些基因中，我们认为Sox4基因可能会对分子机制的解释提供一个额外的线索。在Sox4基因敲除的动物中发现，胰岛素分泌细胞的数目明显减少。MEN1综合征可伴有胰岛素瘤，Phillippee等[26]通过条件性基因敲除技术，在小鼠胰岛β细胞中特异性地敲除Men1基因，结果小鼠在第2个月出现胰岛增大，增大程度随着小鼠的月龄增大而加重。与此相一致的是，组织化学检查表明是胰岛增生，在第4个月胰岛增大表现更为明显。第6个月41.5％的小鼠出现胰岛素瘤，第10个月达到100％。而且大部分胰岛出现增生或发育不良，增生或发育不良的一部分胰岛组织中胰岛素免疫活性降低，提示Men1基因灭活后，胰岛素瘤发展过程中胰岛β细胞出现去分化作用，即特殊细胞形态的消失。此外，100%的MEN1综合征的病人发现有小的，无功能的胰腺内
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分泌肿瘤的病理改变。所有这些证据显示,Men1基因可能通过胰岛分化相关基因(例如，Sox4基因)的下调来起作用。但是这个结论还需进一步研究证实。
体外形成的EB已有研究证明可以较好的模拟早期胚胎发育的情况。所以我们用ES细胞体外形成的EB作为研究对象，研究MEN1基因在胚胎发育中的作用是一种有效的方法。我们在本次实验中发现两种细胞所形成的EB在数量和大小方面没有明显差别，提示MEN1对EB的生长没有明显影响，在芯片中也未发现生长因子的明显变化。另外MEN1-/-的小鼠会发生胎内死亡，同时伴有骨骼，肝脏，造血系统，神经系统等的异常。在我们的芯片中也观察到在MEN1-/-的EB中这些器官发育相关的基因表达改变，这两个结果相一致。但是MEN1基因是否直接通过这些基因影响早期胚胎发育及其具体作用机制还需我们的进一步研究。
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第二部分 Menin对sox4基因表达调控的初步研究
引 言
Men1基因是多发性内分泌肿瘤1型（MEN1）的致病基因，其在许多胚胎和成人组织中表达，编码蛋白menin。在成人中men1基因的异常会引起主要表现为家族性的甲状旁腺、胰岛和垂体前叶肿瘤等内分泌系统的肿瘤，从而认为其是一个抑癌基因。同时研究发现Men1基因纯合子突变型的胚胎在胚胎期第11.5天至第13.5天间死亡，存在包括神经管不闭合，露脑，心脏萎缩，肝脏发育迟缓等多器官缺陷。所以其在胚胎发育中也起着重要的作用。对于其作用机制的研究虽然有了一定的进展，但是仍然不是十分清楚。
我们在前期的实验中通过表达谱芯片找到了一些可能受menin调控的基因，Sox4基因就是其中一个。Sox4基因是Sox家族的一个基因，Sox家族是一类控制发育的基因家族，在个体发育过程中对性别分化及组织器官形成起重要作用，主要特征为具有一个保守基序HMG-box，可与DNA序列特异结合，是一类重要的转录调控因子。Sox4基因被认为是一个癌基因，发现在很多器官的肿瘤组织中表达明显升高,而抑制其表达则可导致细胞凋亡。而且最近研究发现其在早期胚胎发育过程也发挥重要作用，其基因敲除后的表型与Men1基因敲除所引起的发育异常有部分的相同。故我们推测Sox4基因是否是受Menin调控的基因之一呢？
所以我们通过构建一个含Sox4基因启动子的报告基因载体转染细胞的方法，来进一步明确Men1基因对Sox4的调控作用，为进一步的研究打下基础。
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材料与方法
一、材料
1、实验用细胞株及质粒
1) Men1基因敲除的小鼠胚胎成纤维细胞（Men1-/-Mef细胞）和野生型Mef细胞（Men1+/+Mef细胞）均由法国张昌贤教授惠赠。
2) PGL3－Basic.质粒为本实验室所有。Men1基因的真核表达质粒Pci-men1和Pci-antismen1（反装men1基因的cDNA，作为对照）由张昌贤教授惠赠。.
2.主要试剂和耗材 1)细胞培养用试剂 DMEM培养液（Gibco）. 丙酮酸盐（Gibco） β-巯基乙醇（Sigma） 胎牛血清白蛋白（Gibco）. 二甲亚砜(DMSO) (Sigma) 0.05%TRYPSIN+EDTA(GIBCO) 1×PBS (GIBCO) 2）RNA抽提试剂
TRIzol（GIBCO/BRL），三氯甲烷，无水乙醇，异丙醇，DEPC水 NucleoSpin RNAⅡ（MN） 3）荧光实时定量PCR试剂
SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems） 4）逆转录试剂
oligo(T)20 Primer（Invitrogen）
SuperScriptTMReverse Transcriptase（Invitrogen）
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dNTP Mixture（Sigma） 5) 亚克隆试剂 Taq酶（Takara），
限制性内切酶MLU1,XHO1(NEB)。 T4DNA连接酶（promega）, JM109细菌（博大泰克）， DH5α细菌（TIANGEN）,
PCR产物胶回收试剂盒(Qiagen), 质粒小规模抽提试剂盒（博大泰克）, 质粒中规模抽提试剂盒（QIAGEN）,
lambda λDNA/EcoRⅠ+HindⅢMarker,3（MBI）, IPTG,X-GAL(Takara)， 6)转染试剂：
脂质体lipofectamine2000(Invitrogen)， Opti-MEMⅠMedium(Invitrogen)， 双荧光素报告系统试剂盒（Promega） 7)RNA逆转录酶（Invitrogen）. 8)蛋白质免疫印记试剂：
聚丙烯酰胶浓缩液（29：1） Pierce公司 X光胶片 丽春红染色液
美国Kodak公司 碧云天生物试剂公司
Tween-20 Sigma公司 硝酸纤维素膜 Millipore公司 蛋白质分子量标准（Marker） 蛋白质预染Marker
天根生化公司 天根生化公司
Menin一抗(兔抗) Cell Signaling公司 含辣根过氧化物酶的二抗 Dako公司
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十二烷基硫酸钠(SDS),过硫酸铵(APS),四甲基二乙胺(TEMED),Tris.HCl,glycine,二硫苏糖醇(DTT)，溴酚兰，甘油,Tris.base 上海生工生物试剂公司分装
3、主要仪器设备
水浴箱 (Shel lab 1255-2E ) 倒置显微镜（Olympus）
荧光显微镜、体视显微镜（Leica） CO2孵箱 （Hera cell）
超净工作台 （苏州振华净化设备厂 YJ-1450 DT） 微量移液器（Gilson公司）
ABI®PRISM 7000荧光PCR仪(ABI Biosystem)
iCycierTMPCR扩增仪 (BIO-RAD) 5415 R低温超速离心机（Eppendorf） 5818 R低温离心机（Eppendorf） BL3100 电子天平（Sartorius）
GelDoc2000凝胶紫外成像分析系统（BIO-RAD） Cyberscan2500 PH计（EUTECH）
BioPhotometer 分光光度仪 （Eppendorf） EPS-300 稳压稳流电泳仪（Tanon®） 4℃/-20℃电冰箱（Haier 电器） 680型酶标仪(美国Bio-Rad公司)
蛋白质电泳和转移系统 (美国Bio-Rad公司)
GS-710扫描成像系统及灰度分析软件（QuantityOne-4.5） (美国Bio-Rad公司) 3310 pH计 Jenway，英国
聚丙烯酰胺凝胶电泳仪 Bio-Rad ，美国 蛋白质电湿转膜仪 Bio-Rad，美国 蛋白质加热变性仪Thermomixer Eppendorf，德国
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电泳槽 Fisher scientific，美国 全光谱酶标仪 Biotek，美国 5415R低温高速离心机 Eppendorf，德国 HB-1000杂交炉 UVP，美国 微波炉 LG，韩国 STS-2摇床 二、方法
(一)质粒的构建和鉴定:
1、PCR产物的合成
1)用小鼠的DNA 作为模板, PCR 扩增sox4基因启动子区域2 kb 的片段， 2)上游引物：ATACACGCGTGGCTGTGATGGGTAGCAAAT (下划线处为MluI酶切位点和保护碱基),
下游引物：ACGTCTCGAGGAAACAGCGTGCAAGAACTG (下划线处为XhoⅠ酶切位点和保护碱基)., 3)PCR扩增体系和程序为：
基因组DNA（100ng/µl） 1.0 µl 上游引物(10µM) 0.8µl 下游引物(10µM) 0.8µl 2.5mM dNTP 4.0µl 10×PCR buffer 5.0 µl HotStar DNA polymerase 0.5 µl 去离子水加至总体积 50.0 µl 4)反应条件：
LID=102°C
上海斯特分析仪器公司
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1)94°C 4 min
2)94°C 45sec， 3)62°C 45 sec， -0.5°C /循环
4)72°C 2 min 30 sec， 5) GO TO 2) REP 9 6)94°C 45sec， 7)57°C 45sec
8)72°C 2 min 30 sec， 9) GO TO 6) REP 29 10)72°C 10
2. PGL3-sox4重组质粒的构建及鉴定方法
1）PCR产物的亚克隆：
将sox4的PCR扩增产物割胶纯化，连接T载。
[1]PCR产物的割胶纯化：
（1） 在长波紫外灯下，用无菌手术刀片割下目的DNA条带，置1.5 ml的Eppendorf
管中。
（2） 加入QG溶液（每100 mg琼脂糖加入300 µl），50°C水浴10 min，每2 min
颠倒混匀一次。
（3） 将液体转入纯化柱，13,000 rpm室温离心1 min。弃去液体，将纯化柱放入
同一收集管中。
（4） 向纯化柱中加入750µl PE缓冲液，静置2 min，13,000 rpm室温离心1 min。
弃去液体，重复本步骤一次。
（5） 将纯化柱放入一洁净的1.5 ml的Eppendorf管中，向柱中央加入30µl 灭菌
去离子水，静置2 min，13,000 rpm室温离心1 min。将回收的DNA测浓度，
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贮存于-20°C备用。
[2]目的片段与载体的连接：
目的片段与载体的摩尔比为3-8:1，计算所需目的片段的量。 按下列体系进行连接反应： 载体pGEM-T easy 0.5µl 2×buffer 5.0 µl 纯化的PCR产物 x µl T4 DNA连接酶（3u/ul） 1.0µl 加水至总体积 10.0 µl 混匀放置4°C冰箱过夜
[3]质粒的转化 JM109细菌（博大泰克）
A. 取连接产物5 µl，试剂A20 µl,无菌水稀释至1OO µl,冰上备用。 B. 将以上混合液加入到一管感受态细菌（约80 µl-100 µl）中去混匀，冰浴20分钟。随后，室温放置10分钟。
C. 加入400µl不含氨苄青霉素的LB培养基，混匀。 D. 37°C温和振摇10-40 min，振速200rpm。
E. 将菌液取100-500 µl接种于含氨苄青霉素和IPTG/X-Gal的选择性LB培养皿中。
F. 培养皿于37°C温箱倒置培养12-16小时。 [4]摇菌：
挑取单个白色菌落，接种于5 ml含有氨苄青霉素（100 µg/ml）的LB培养基中。37°C振摇过夜，振速为250 rpm。
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[5]菌株的保存：
将经过测序证实的含重组质粒的大肠杆菌菌株扩大培养至对数生长中期（A600为0.4～0.5），加入终浓度为50%体积的灭菌甘油(甘油和菌液的体积比为1:2)，混匀后分装入1.5ml离心管，于－70°C保存。
[6]质粒的小规模抽提（博大泰克）
A. 收集1.5-3ml菌液的沉淀于1.5mlEppendorf管中，加入100µl溶液1（细菌悬浮液）,震荡至彻底悬浮。
B. 加入150 µl 溶液2（细菌裂解液），立即轻柔颠倒离心管数次，使菌体充分裂解，裂解后的菌体变得清亮。随后将离心管放置于冰上1-2min(时间勿超)。 C. 加入150 µl 溶液3（中和液），立即温和颠倒离心管数次，室温放置5分钟。12,000 rpm 离心12分钟。
D. 将420 µl 结合缓冲液加入离心吸附柱中，然后将步骤3中的上清加入离心吸附柱中（尽量去除杂质），混匀，12,000 rpm 离心30 秒钟。倒掉废液收集管中的废液。
E. 加入750 µl漂洗液于离心吸附柱中，静置1分钟后，12,000 rpm 离心15 秒钟。倒掉废液收集管中的废液。
F. 小心去除离心吸附柱，将其套入一个干净的1.5mlEppendorf管中，加入适量洗脱缓冲液，常规50 µl，室温放置2-5分钟后，12,000 rpm 离心1分钟。
[7]重组质粒的酶切鉴定
将抽提的质粒用限制性内切酶酶切以鉴定是否为重组质粒。 反应体系如下：
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质粒DNA 1.0 µl 10×H buffer 1.0 µl XhoⅠ内切酶 0.5 µl
MluⅠ 内切酶 0.5 µl
加去离子水至总体积 10.0 µl
37°C酶切过夜，取10 µl酶切产物上样电泳（1.5%的琼脂糖凝胶，100V电压），电泳结束后在凝胶成像仪下拍照。
[8]阳性亚克隆送上海市英俊生物技术有限公司测序，命名为TGEM-teasy－SOX4。测序得到的DNA序列用BLAST软件与小鼠的基因序列比对。鉴定没有突变后再进行下一步实验。
2）真核表达重组质粒的构建：
按以上程序，双酶切T载上目的片段和真核表达载体PGL-3-basic，将双酶切产物进行连接反应。连接产物转化感受态细菌，抽提质粒，双酶切鉴定，最后进行重组质粒测序鉴定。构建示意图(见图A)如下：
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Sox4序列
SOX4 序列 XhoⅠ＋MluⅠ
SOX4序列
图 A重组质粒构建示意图
Fig A Construction map of expression vector
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3) PGEM-T Easy SOX4质粒和PGL3-BASIC质粒的酶切 酶切反应体系如下：
PGEM-T Easy SOX4 4ul 10× Buffer 1ul
dddH2O 3ul MluI 1 ul
Xho I 1ul 总体积 10ul
37°C 孵育1小时，酶切结束后，取1 μl电泳以鉴定是否酶切完全。
PGL3-BASIC 4ul 10× Buffer 1ul
dddH2O 4ul MluI 0.5 ul
Xho I 0.5ul 总体积 10ul
37°C 孵育过夜，使载体酶切完全。酶切结束后，取1 μl电泳以鉴定是否酶切完全。
4) 割胶纯化酶切片段(同前)
5) 目的片段与载体的连接、转化及测序 (1) 目的片段与载体的连接
目的片段与载体的最佳摩尔比值为8-10:1，此时连接效率最高。计算所需目的片段的量，按下列体系进行连接反应：
载体PGL3 2 µl
10×Buffer 1.0 µl 纯化SOX4全长 6 µl
T4 DNA连接酶（3u/µl） 1.0 µl 总体积 10.0 µl
混匀置PCR仪16°C过夜。
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(2) 感受态细菌的制备(同前)
(3) 连接产物的转化(同前，这次不需要蓝白斑筛选，白斑就是阳性克隆) (4) 质粒的小规模抽提(同前) (5) 重组质粒的酶切鉴定
将抽提的质粒用限制性内切酶酶切以鉴定是否为重组质粒。反应体系如下：
重组质粒 2.0 µl 10× buffer 1.0 µl MLU I 1.0 µl
Xho I 1.0 µl 加去离子水至总体积 10.0 µl
37°C酶切overnight，取10 µl酶切产物上样电泳（1%的琼脂糖凝胶，100V电压），电泳结束后在凝胶成像仪下拍照。 6) 重组质粒的测序分析
将重组质粒送上海市博尚生物科技有限公司进行测序。测序结束后用BLAST软件将所测序列于GeneBank中的序列进行比较，鉴定所测序列是否正确。
. 7) 重组质粒的中规模抽提
采用QIAGEN质粒中量抽提试剂盒抽提质粒，具体步骤简述如下： 将过夜培养的100 ml含重组质粒的菌液分装于2个50 ml的离心管中，
4°C，4000rpm离心15分钟，彻底弃上清
↓
加4ml Buffer P1使沉淀重悬
↓
加4ml Buffer P2，温和颠倒混匀4～6次，室温孵育5分钟
↓
加4ml预冷的Buffer P3，立即温和颠倒混匀4～6次
↓
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将菌液移入末端封闭的QIAfilter Cartridge中，室温放置10min
↓
用4ml Buffer QBT平衡QIAGEN-tip柱子，使Buffer自然流下
↓
将QIAfilter Cartridge中的液体注入QIAGEN-tip中，并任其自然流下
↓
用10ml Buffer QC洗涤柱子2次
↓
用5ml Buffer QF洗脱质粒DNA
↓
用3.5ml异丙醇沉淀DNA，4°C，13000rpm离心30分钟，小心弃上清
↓
用2ml 70％乙醇洗涤DNA，4°C，13000rpm离心10分钟，小心弃上清
↓
空气干燥DNA5～10分钟，用100µl TE溶解DNA，定量后-20°C保存备用。
(二)、重组质粒的真核转染
⑴在37度、5％CO2条件下，Men1-/- 和 men1+/+ MEF细胞培养于含10％胎牛血清的高糖DMEM中。
⑵ Lipofectamine2000转染步骤
a．转染前24小时以0.5-2×105cells/孔（以24孔板为例）将细胞传代至24孔板中，要求转染前细胞达到90％－95％的融合，并用无抗生素的培养液培养。
b、 计算质粒及Lipofectamine2000每孔用量：转染时质粒用量为0.8ug/孔，两个质粒共转染时每种质粒分别为0.4ug/孔。pRL-SV40 质粒(Promega)携带海肾荧光素酶(renilla luciferase)报告基因, 作为实验载体的内对照，每孔加入0.008ug。用所转质粒与50µl Opti-MEM混合，将LipofectAMINE 2000 试剂轻柔摇匀，取3µl与50µl Opti-MEM混合,在室温下温育5分钟。
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c． 稀释后的质粒与稀释后的Lipofectamine 2000进行混合，轻轻地颠倒混匀，不要振荡。室温下温育20分钟，形成转染复合物。
d． 将以上混合液加入培养细胞，轻柔前后推摇培养板以混匀液体，将培养板放入细胞培养箱。
e． 4小时后将转染培养液换成普通含10%新生牛血清的培养液。 f． 48小时后收集细胞用于萤光素酶活性检测。 g. 每种载体转染细胞至少有3 个平行样, 重复实验。 (3) 双萤光素酶活性检测： 准备工作：
a. 溶解 Luciferase Assay Substrate 于 10ml of Luciferase Assay Buffer II.
管上写上LAR2。分装成10管冻于－70度。
b. Passive Lysis Buffer 的准备：用去离子水稀释成1乘。随用随稀释。5乘PLB存
于－20度。
c. 50X Stop & Glo® Substrate 溶于 50 volumes of Stop & Glo® Buffer，存于－20度。 20ul 50X Stop & Glo® Substrate加入1ml Stop & Glo® Buffer，使用前混匀。
d. 所有试剂使用前室温平衡。
操作步骤：(按Promega公司的双荧光素酶检测方法进行。) a. 用PBS洗细胞3次
b. 24孔板细胞每孔加入100微升PLB c. 放于室温摇床上轻摇15分钟
d. 将细胞裂解液转移到 E P管，取 20ul 细胞裂解液 ， 加 100u l 的 L A RⅡ试剂 ， 混匀后测 10S 的荧光计数，该计数反映萤火虫荧光素酶的活性水平。 e. 随后加入 100u l淬灭萤火虫荧光 S t o p& G l o试剂同时激发海肾荧光， 混匀后测 1 0s 的荧光计数， 该计数反映海肾荧光素酶的活性水平。
f. 萤火虫荧光素酶的活性和海肾荧光素酶的活性之比作为荧光素酶的相对活性RLA（relative luciferase activity），每一标本均做三个复孔，取三孔的平均值
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作为最终结果。此测定在syneryII多功能酶标仪（bio-tek）上进行。 (三)、统计分析：
重组萤光素酶报告基因表达（活性）的组间差异比较采用配对T检验。 (四)、RNA抽提
1.用TRIZOL法抽提Men1-/- 和 men1+/+ MEF细胞RNA。
1) 培养板中每孔加Trizol 1ml水平放置片刻,吹打使细胞脱落，镜下观察无完整细胞，移入1.5ml离心管中，室温放置15分钟。
2）加入氯仿0.2ml，盖紧离心管，用手剧烈震荡离心管15s，室温下静置10min。 3）4℃，12000g，离心15min，取上层无色水相，移入一新的1.5ml离心管。 4）加异丙醇0.5ml，用手颠倒摇匀，室温下静置10 min。 5）4℃，12000g，离心15min，弃上清。
6）沿管壁小心加入75%乙醇1ml，漩涡混匀，4℃，7500g，离心5min 。 7）小心弃去上清液，开盖，将离心管放在实验台上，室温干燥3-5min。 8）加入DEPC处理水20μl溶解RNA。
9）取2μl样本RNA加DEPC水98μl，以纯DEPC水为校正，进行RNA浓度的测定。 10）另取2μlRNA 进行1％琼脂糖凝胶电泳，观察RNA样本的纯度及完整性 11）剩余样本立刻进行逆转录，或存于-70℃冰箱。
2、逆转录（Superscript III逆转录酶试剂盒）
1) 获得的RNA经电泳鉴定，质量合格。取200ulRNA-FREE离心管若干，每管加入oligo(T)20(浓度为50μM)1μL；NA标本1μg；NTP Mix（浓度为10mM）1μl；最后加DEPC水至13μl。
2）加热混合液至65℃，持续5min。然后冰上孵育至少1min。
3）短暂离心以收集标本，各管依次加入5×First-Strand Buffer 4μl；0.1MDTT 1μl；
TMTM
NaseOUTRecombinant Rnase Inhibitor 1μl；SuperScriptⅢRT(浓度为
200units/μl)。
4）用移液器轻柔上下吹打混匀反应液，50℃孵育30-60min，70℃孵育15min。
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5）最后得到20μlcDNA标本，加三蒸水80μl将标本稀释5倍，存于冰箱备用。 3、 引物设计及合成
1）采用Primer 3在线设计引物，扩增片段要求满足：
B. 长度 80-150 个碱基 C. Tm 值：58-60℃ D. GC比例：40-60％
E. 引物二聚体连续配对不超过3个 F. 包含至少一个内含子 具体如下：
表6 各位点所用引物序列
SOX4引物为：GGCAGTTTCAGCTCCTCATC(上游引物)，
CTCTCCTCTCCTGCCTCTTG(下游引物)。
GAPDH引物为：AACGACCCCTTCATTGAC(上游引物)
TCCACGACATACTCAGGGACAACA(下游引物)。
2）合成: 所有的引物均由上海赛百盛基因技术有限公司合成，引物采用PAGE胶纯化。使用时稀释到1μM使用。 4、 荧光实时定量PCR
得到的cDNA10倍稀释后用于实时定量PCR反应，检测Sox4基因在两种细胞中的表达情况。使用SYBR@premix Ex Taq试剂盒（Takara）在ABI7300实时定量PCR仪上进行检测。试验中以GAPDH为内参。 1)反应体系
cDNA 4µl
Primer1（10Pm） 0.6µl Primer2（10Pm） 0.6µl ROX 0.6µl PCR Master Mix 15µl
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去离子水加至总体积 30µl
2)反应条件
3) 结果分析
A. 荧光本底信号：设定为前10个循环的荧光值
B. 域值：设定为第3-10个循环的荧光信号的标准差的10倍
C. Ct值：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数，实时测定每个孔的荧光数值
D.以GAPDH为管家基因，校正每个样品的 Ct 5．蛋白免疫印迹分析
在37度、5％CO2条件下，Men1-/- 和 men1+/+ MEF细胞培养于含10％胎牛血清的高糖DMEM中.。抽取蛋白做蛋白免疫印迹分析，具体步骤如下： 〔1〕细胞蛋白抽提
a) 将培养皿冰上放置。用冰冷的PBS漂洗细胞3次，吸尽PBS。
b) 加入一定量预冷的裂解液(RIPA，50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA ,
1% Triton x-100, 1% sodium deoxycholate , 0.1% SDS, 1 mM PMSF, 5 µg/ml Aprotinin, 5 µg/ml Leupeptin, pH 7.4 )，将培养皿于冰上静置孵育30min。
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c) 用细胞刮勺将细胞集中于培养皿的一侧，移入预冷的eppendorf管中。 d) 4℃，14,000 rpm (16,000 g)离心30min，将上清液转移至新的离心管中。 〔2〕蛋白定量
e) 将2mg/mL的BSA蛋白标准品倍比稀释成8管。 f) 取待测浓度的蛋白样品，5倍稀释。 g) 配制BCA工作液（A液:B液＝50:1）。
h) 在96孔酶标板中依次加入蛋白标准品以及稀释后的待测样品，25μl/孔。 i) 每孔加入200μl的BCA工作液。 j) 微振荡仪上振荡15s。 k) 37℃孵育30min。
l) 570nm处读取各样本的吸光度。 m) 绘制标准曲线，算出蛋白样品的浓度。 〔3〕聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）的配制
表1凝胶配方表
8%分离胶 4%积层胶 蒸馏水（ddH2O） 4.6ml 3.1ml 分离胶缓冲液（PH8.8） 2.5ml 积层胶缓冲液（PH6.8） 1.3ml 10%十二烷基璜酸钠（SDS） 0.1ml 0.05ml 30%丙烯酰胺单体储存液 2.7ml 0.7ml TEMED 6μl 5μl 10%过硫酸铵 100μl 25μl 总量 10ml 5ml
① 清洗玻璃板，用无水酒精擦净，通风橱中晾干；梳子用水洗干净，临用前用无水酒精擦拭，挥发至干。
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② 安装玻璃板，标记5cm刻度线。注水检查是否有漏液。
③ 配制10％分离胶溶液，灌胶，异丙醇封顶，室温下等待分离胶聚合完成(30min)。倒出封顶液，配制4%SDS－PAGE 基层胶，灌胶，插入Teflon梳子。室温下等待聚合完成。
④ 在等待积层胶聚合的过程中（30min），准备样品。计算上样体积，保证10～30ug总蛋白/lane，且每管的蛋白量一样。样品与4×sample buffer混匀后99℃加热5min，短暂离心后即可加样。
⑤ 将凝胶固定在电泳槽中，电泳槽中加入Tris-glycine电泳缓冲液。小心拔出梳子。上槽加液量以淹没凝胶为度。
⑥ 所有上样孔均加样，没有样品，用等体积的sample buffer代替。
⑦ 接好电源，正极接下槽。100V稳压，直至溴酚兰到达凝胶底部，关闭电源。 〔4〕转膜
a. 配好转膜缓冲液，4℃预冷。冷却盒中加入水放在冰箱冷冻室，用时取出 b. 在转移盒内组装转印夹层：阴极至阳极依次放入海绵、三层滤纸、凝胶、硝酸纤
维素膜、三层滤纸、海绵。关紧Cassette，放入module。 c. 将冷冻的冷却盒放入电泳槽，加入预冷的1×转膜缓冲液。
d. 加盖，接通电源，分清正负极，100V（或0.65mA/cm2）电转移1.5h。 e. 断开电源后，取出NC膜，切去左下角，用Ponceau S（丽春红S）染色，结果可
见多条粉红色蛋白条带。TBS/T清洗至发白。 〔5〕免疫杂交及显像
a. 将膜浸在含5％脱脂奶粉的1×TBS/T封闭液中，室温轻摇2h。
b. 一抗用含5%脱脂奶粉的1×TBS/T溶液稀释，将封闭过的膜放在一抗稀释液中，
室温振荡孵育1～2h（若过夜则要求4℃）。 c. 弃一抗稀释液，用1×TBS/T洗3次，每次5min
d. 将辣根过氧化物酶连接的二抗用含5%脱脂奶粉的1×TBST溶液稀释。 e. 将膜置于二抗稀释液中，室温振荡孵育1～2h。 f. 弃二抗稀释液，用1×TBST洗3次，每次5min。
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g. 将膜置入显影液LumiGLO溶液中，室温轻摇1min。
h. 吸去液体，用食品保鲜膜覆盖，在暗室用X线片曝光。胶片显影、定影。 i. 运用灰度扫描软件对相应蛋白条带进行相对定量。
〔6〕 统计学分析
采用SPSS15.0统计软件，各组间基因表达量的比较采用独立样本t检验分析， P<0.05认为有统计学意义。
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结 果
一、
正常Mef细胞与Men1-/- Mef细胞Menin蛋白Western blot比较
正常mef细胞与Men1-/- mef细胞在相同培养基中培养，每2-3天以1:3一1:5比例传代。发现正常Mef细胞有Menin蛋白表达，Menin蛋白分子量为72KD。而Men1-/- Mef细胞无Menin蛋白表达（见图1）。以GAPDH为内参，GAPDH分子量为36KD。
MENIN72KD GAPDH 36KD -/- +/+
图1 MEF-/-和MEF+/+中MENIN蛋白WESTERN BLOT比较 FIG1 Comparation of menin inmef-/- and mef+/+ by western blot
二、Sox4基因PCR产物鉴定
小鼠Sox4基因经普通PCR反应，凝胶电泳并割胶纯化后，和MARKER DL2000共同电泳，得到一条2100bp左右条带。(见图2)
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图2 Sox4 基因PCR 产物电泳鉴定 M: Marker DL 2000 1：Sox4 基因
FIG 2 Graph of electrophoresis of Sox4 gene PCR product M: Marker DL2000 1:Sox4 gene
三、TGEM-TEASY-SOX4亚克隆鉴定
小量提取质粒TGEM-teasy-SOX4后,以Mlu I/Xho I双酶切获得两条条带。下面一条2000bp左右的为Sox4基因，上面一条3000bp左右的为TGEM-teasy。（图3）送公司测序证实所插入片段结果与小鼠Sox4基因的启动子部分完全符合。重组质粒的部分测序图谱，如图4（用Chromas软件打开）
图3 重组质粒TGEM-teasy-SOX4酶切鉴定
M：MARKER DL2000 1：上一条是T载，下一条是SOX4基因 Fig 3 Restriction enzyme digestion analysis of TGEM-teasy-SOX4 M：MARKER DL2000 1：the upper is Tgem-teasy,another is sox4 gene.
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图4 重组质粒TGEM-TEASY-SOX4的部分测序图谱
FIG4 Partial sequencing map of recombinant plasmid TGEM-TEASY-SOX4
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四、PGL3-SOX4载体鉴定
小量提取质粒pGL3-SOX4后,以Mlu I/Xho I双酶切获得2100 bp左右条带（图5），送公司测序证实所插入片段结果与小鼠Sox4基因的启动子部分完全符合。
图5 重组质粒PGL3-SOX4酶切鉴定
Fig 5 Restriction enzyme digestion analysis of PGL3-sox4
M ：λDNA/EcoRⅠ+HindⅢMarker,1： PGL3-sox4 recombinant plasmid double digestion by MLUⅠ and XHOⅠ, 2： PGL3-basic plasmid double digestion by MLUⅠand XHOⅠ
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五、荧光素酶表达测定结果
我们先将pGL3-SOX4转入men1-/- 和 men1+/+ mef细胞，同时转入内参质粒pRL-SV40，通过检测萤火虫荧光素酶活性和海肾荧光素酶活性的比值来反映启动子片段的活性，进而反映men1基因对sox4基因启动子的调控作用。转染结果表明在men1-/-的mef细胞中sox4基因启动子的活性（67.5±2.89）明显高于men1+/+的mef细胞（10.3±0.5）。这说明menin的表达可以抑制sox4基因的表达（图6）。
图6 PGL3-SOX4报告基因载体转染到men1-/-和men1+/+的MEF细胞后荧光素酶的表达差异。 FIG 6 The expression differences of PGL3-sox4 reporter gene vector was transfected in men1-/- mef cell and men1+/+ mef cell. * P<0.05 VS men1+/+ mef
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同时我们又在men1-/-的mef细胞中进行了共转染，分别转入pGL3-SOX4和pci-men1，pGL3-SOX4和pci-antismen1。结果发现转入pci-men1的后RLA（11.5±0.58）也显著低于转入pci-antismen1的RLA（32.3±1.26）。此结果进一步说明了menin抑制sox4基因启动子的活性。（图7）
图7 荧光素酶活性比较
FIG 7 Comparision of luciferase activity * P<0.05 VS PGL3-sox4+pci-antismen1
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六、实时定量PCR结果
实时定量PCR的结果显示sox4基因在men1-/- mef细胞中的表达明显高于野生型的mef细胞（P<0.05），结果见图8。此结果也可说明menin对sox4基因表达的抑制作用
Relative mRNA level32.521.510.50*mef men1-/-
mef men1+/+ 图8 MENIN 在MEN1+/+和MEN1-/-的MEF细胞里的mRNA水平 Fig8 Level of mRNA in men1+/+ and men1-/- mef cell * P<0.05 VS men1+/+ mef
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讨 论
Men1基因是多发性内分泌腺瘤病的致病基因，在人类Men1基因定位于染色体11q13[2]，基因大小超过9kb,包含10个外显子。其中外显子2－9及外显子10的5’端480个碱基为编码区，编码一个含610个氨基酸残基的肿瘤抑制蛋白：menin。迄今为止，尚未发现menin蛋白与其它蛋白有同源性，且其精确的生物学功能也还不清楚。Menin蛋白在进化过程中高度保守。Menin蛋白主要位于细胞核内，这是因为它的C端有3个核内定位信号（NLS）。其在细胞质中和端粒附近也有分布[3]。 Men1基因是一种肿瘤抑制基因，其表达的缺失可引起甲状旁腺腺瘤、胰岛细胞瘤、胃泌素瘤、肾上腺腺瘤，垂体腺瘤等内分泌系统的肿瘤及少见其它肿瘤[1]。从胚胎的早期开始，menin蛋白一直表达，不仅在内分泌组织中表达，在成人的各种组织中均可广泛表达，但以一些增生活跃的组织表达最多，如子宫内膜、消化道上皮等，提示menin蛋白的表达可能受细胞周期调控。
在小鼠中，Men1基因早在受精后第7天即广泛转录，而在妊娠后期，多表达于特定组织如脑，胸腺和肝脏。Philliphe等[4]构建了一个Men1基因敲除的小鼠模型，发现Men1基因纯合子突变型小鼠的胚胎在第11.5-13.5天间死亡，并存在包括神经管不闭合，露脑，心脏萎缩，肝脏发育迟缓等多器官缺陷，导致胚胎的胎内死亡。近来又有研究发现在敲除了men1基因的小鼠在胎内死亡前还存在胰岛内分泌细胞α，β细胞的发育异常，说明menin也参与胰岛的发育[28]。而且胰岛肿瘤也是MEN1病的常见肿瘤之一，研究发现[26]胰岛β细胞MEN1基因特异性敲除小鼠在第2月龄出现胰岛增大，增大程度随着月龄增大而加重。到第6个月龄时小鼠出现胰岛素瘤，至第10个月龄时达到100%。大部分胰岛出现增生或发育不良，胰岛β细胞出现去分化作用。这也提示menin参与胰岛的发育分化。
从上面的描述可以看出Menin作用广泛，但其作用机制的研究还不是十分清楚，menin蛋白可以直接与DNA及许多转录因子、核受体结合，共同调节下游基因的转录，维持细胞内稳态平衡。现阶段多认为menin是一个协同的转录因子，目前研究发现与
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menin相互作用的因子有：JunD[5]，Smad3[6]）,nm23[7]）,同源异型盒包含蛋白（Pem）[8]和NF-KB家族成员P50，P52，P65等[21].但是其调控的具体下游机制也并不十分清楚。现阶段研究较明确一个menin下游作用方式是通过H3K4甲基化上调细胞周期依赖激酶(CDK)抑制剂p18ink4c，p27kip1控制细胞周期[48]。而我们在以前的研究中利用men1-/- 和 men1+/+ ES细胞形成的拟胚体模拟胚胎早期发育，通过表达谱芯片的方法寻找可能受menin调控的下游基因，我们得到若干表达差异的基因，通过分析我们发现sox4基因可能是一个候选的基因。
Sox4,是Sry(sex-determining region Y)相关的同源盒基因，与Sox11和Sox12一起属于Sox的C亚群。Sox4基因是Sox家族成员，Sox家族是一类控制发育的基因家族，其主要特征为具有一个保守基序HMG-box，可与DNA序列特异结合，是一类重要的转录调控因子[49],在个体发育过程中对性别分化及组织器官形成起重要作用。Sox4基因的HMG结构域长79个氨基酸残基，可以以序列特异的方式(AACAAAG/AACAATA)与DNA的小沟结合使其产生较大的弯曲，从而调节靶基因的表达[50，51,52],所以相应的HMG盒内的突变(如错义突变)将影响其对下游调控基因的DNA序列的特异识别和结合，进而影响Sox4蛋白正常转录激活功能，导致疾病的发生。
现阶段研究表明，Sox4基因在早期胚胎发育过程参与神经系统的发育[53],近期又发现其在胰腺的发育中也有重要作用[28]。Sox4基因在胚胎发育期，在许多组织中广泛表达，包括胚胎心脏，中枢神经系统，肺，齿芽，生殖腺，中肾，胸腺，前B淋巴细胞和T细胞，并且可能在成骨细胞的分化中起重要作用[28,54,55,56]。
研究发现，Sox4基因纯合子突变的小鼠由于缺乏正常的心脏发育(心室嵴到心半月瓣膜和心室间隔出口段发育受损)导致循环衰竭而在受精后14天左右死亡，并且伴有B淋巴细胞的发育在前B淋巴细胞期停顿[54,57]。而Philippe等[4]构建了一个Men1基因敲除的小鼠模型，不仅发现Men1基因纯合子突变型的胚胎在胚胎期第11.5天至第13.5天间死亡，而且存在包括神经管不闭合，心脏萎缩等多器官缺陷。综上，我们可以发现，Menin和Sox4都涉及到神经发育和心脏发育。
Maria E Wilson等报道基因敲除Sox4的小鼠胚胎在妊娠12.5天前胰芽正常发育，内分泌细胞也可以正常分化。但在这之后无法形成正常的胰岛，而且内分泌细胞也
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显著减少[28]。而Sox4杂合子突变小鼠胚胎可以形成胰岛，但是其胰岛素耐量出现异常，胰岛素分泌也出现下降[58]。在张昌贤的研究中[28]发现，menin也参与胰岛的发育，其在胰腺内分泌细胞的的发育中起一个必不可少的作用。Menin和Sox4都对胰岛的发育都有关键的作用，所以我们想Sox4对胰岛发育的作用是否与Menin有关。
SOX4基因的高表达与多种癌症的发生有关，据报道有肝癌、乳腺癌、脑、肺、胰腺、唾液腺，和卵巢癌。[59,60]，因此，Sox4基因被认为是一种癌基因。作为癌基因Sox4在许多肿瘤组织中表达明显增多，而抑制其表达可以导致细胞凋亡[61]。但是其在肿瘤发生中所起的作用机制仍不甚清楚。有研究发现，Sox4基因是最常见的定向逆转录病毒结合位点之一。有研究认为，Sox4基因的过表达是通过小鼠中逆转录病毒位点特异的遗传突变而导致的骨髓非白血细胞性白血病和B/T细胞淋巴瘤的高发生率。但另一些研究则认为，Sox4基因是通过促进细胞凋亡而导致其在癌细胞中的有效表达。从以上sox4基因的功能上看其本身是一种癌基因可能受到men1这个抑癌基因的调控。
Boyd KE研究发现在32Dcl3细胞中sox4可以促进细胞增殖[62]。又有研究发现Sox4可以参与Wnt途径的信号传导，Sox4通过与Wnt信号通路的中心蛋白β-catenin相互作用增加β-catenin的稳定性而促进下游靶基因的转录[63,64]。而现在又发现menin也参与Wnt途径引起的调控胰岛β细胞增殖，因此我们推测sox4也可能参与menin引起的胰岛β细胞的肿瘤形成。
我们的实验证实了menin可抑制sox4基因的表达，但是二者具体的作用方式是什么，menin对sox4是直接的调控作用还是协同其它转录因子起作用，或者还要其它的中间过程，还需要我们进一步设计实验进行研究。
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第一部分
结 论
骨发育：Postn，Runx2，Msx2；肝脏发育：KDR；造血系统：Hox9，Kitl；胰腺发育：sox4，foxa1，Btc，Igf2，Nfatc1等。以上基因可能是menin的靶基因，Menin通过调控它们的表达而参与胚胎早期发育。
第二部分
Menin对sox4基因的表达有调控作用，其可抑制sox4基因的表达。
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上海交通大学医学院2006级硕士研究生学位论文
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上海交通大学医学院2006级硕士研究生学位论文
致 谢
匆匆！太匆匆！
为期三年的学习已接近尾声，值此论文付梓之际，我的心中充满了感恩。借此机会向所有关心帮助过我的老师、同学致以衷心的感谢。
首先我要感谢我的导师李果教授。感谢您给予我来这里读书的机会，感谢您在三年的学习和生活中对我的关心和帮助。您乐观豁达的人生态度，宽于待人，严于律己的处事原则；谦虚谨慎，不断学习的科研态度；朴实的生活作风；都是我终生学习的榜样。
感谢张宏利师兄、王晓师姐在课题的设计和具体实施中所给予的方向指引和热忱帮助，他们如此不厌其烦的指导和帮助，不仅使我带领我进入科研的大门，还使我明白了许多做人的道理。
感谢赵萸老师在细胞培养方面的指导和帮助。
感谢周丽斌教授，杨颖教授在我课题方面的指导和帮助。
感谢戴蒙、徐焰、伍贻新、李凤英、刘赟、李纪平、周文中、杨键、张迪、吴洪熙、郑昇、赵福妹、稽雪兰、罗雪艳、王建群等老师的热心帮助和支持，包师傅和王师傅多年来给予的关心和服务。
感谢同届陈焕珍、赵海燕、朱榕峰、张强，孙静，万方军，张贵阳，刘燕卿，马珏等同学，三年来我们一起体验失败的挫折和成功的喜悦；感谢钱镭博士、姜博仁博士、傅雪莲博士、林帆博士、汝颖博士、李文毅、徐佳、张芹、张贤玲、金华、许丽红、吴铃，张翠平，龙红梅等师兄师姐、师弟师妹的热心帮助，与你们一起学习工作的日子是我人生中最珍贵的记忆。
感谢刘瑞欣博士，姜秀丽博士，陆炎博士，在实验上对我提供的帮助。 感谢上海市内分泌研究所这个积极向上、温馨融洽的集体。
感谢和我一起生活三年的室友姜平、崔艳，李艳秀，是你们让我们的寝室充满快乐与温馨，让我们远离家乡也可以体会到家的温暖。
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上海交通大学医学院2006级硕士研究生学位论文
感谢我的家人——我的父母、弟弟、男友。没有你们，就不会有今天的我！我一直庆幸，庆幸于我可以拥有一个如此温馨的家庭，我所有的一切都可以在你们这里得到理解与支持，得到谅解和分担。今天愿你们能分享我的快乐。
最后，感谢生活赋予我这段珍贵的三年学习时光，让我懂得珍惜，懂得感恩！
朱雅欣 2009年4月于上海
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攻读学位期间发表的学术论文目录
第一作者朱雅欣，张宏利，李文毅等。Menin对sox4基因表达调控的初步研究
。上海交通大学学报，2009（4）。
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