CRISPR／Cas9基因组编辑技术及其在草类植物中的应用

１２０４　１２１　４　草　业科学　第　巷筇６　６／２（）】７　ＰＲＡＴＡＣＵＩ　ＴＵＲＡＩ　ＳＣＩＥＮＣＥ　Ｖｏ１．３４．Ｎｏ．６　ＤＯＩ：１０．¨８２９／ｊ．ｉｓｓｎ．１ＯＯ卜０６２９．２０１６　０３９６　Ｅ丹，　美亮，乍金博，孙占敏，吴燕民．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９基Ｌ大Ｊ组编辑技术及其存草类植物巾的应用．　业科学，２０１７，３４（６）：１　２０４—１　２¨・　Ｗａｎｇ　Ｄ。Ｚｈｏｕ　Ｍ　Ｉ　，Ｉ　ｉ　Ｊ　Ｂ，Ｓｕｎ　Ｚ　Ｍ，ｗｕ　Ｙ　Ｍ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９　ｓｙｓｔｅｒｎ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｐｒｏｓｐｅｃｔｉＶｅ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｇｒａｓｓ，Ｐｒａ１ａｃｕｈｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｍ’ｃ・　２（）ｌ７，３４（６）：ｌ２０４　１２ｌ４．　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９基因组编辑技术及其　在草类植物中的应用　王丹　～，周美亮ｚ，李金博。，孙占敏　，吴燕民　（１．兰州大学草地农业科技学院，什肃兰卅ｉ　７３００２０；２．中圈农业科学院生物技术研究所，－Ｉｔ；．９，１０００８　３．深圳市铁汉生态环境股份有限公司．广东深圳５１８０４０）　摘要：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统作为新一代基因组编辑技术，一经Ｉ＂－１世就受到广泛关注。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统具有对特定基因　位点进行精确修饰（包括敲除、插入、替换等）的强大功能，同时具有操作简单、效率高、适应性广等技术优势，目前已在　微生物、植物、动物以及人类基因治疗等整个生命科学领域得到应用。本文简要介绍了ＣＲＩＳＰＲ／（’ａｓ９技术的发展历　程、作用机理、技术优势、功能及应用领域，总结该技术在植物领域的基因组定向编辑中的研究进展。并提出了这项技　术在草类植物基因功能分析、基因代谢调控途径与遗传改良等方面的应用前景，为相关领域的研究工作奠定了基础　关键词：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９；基因组编辑；草类植物；定点敲除；基因功能；遗传改艮　中图分类号：￥５４０．３２；Ｑ９４３．２　文献标志码：Ａ　文章编号：１００１　０６２９（２０１７）０６—１　２Ｏ４】１　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９　ｓｙｓｔｅｍ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｇｒａｓｓ　Ｗａｎｇ　Ｄａｎｌ～，Ｚｈｏｕ　Ｍｅｉ—ｌｉａｎｇ　，Ｉ．ｉ　Ｊ　ｉｎ—ｂｏ　，Ｓｕｎ　Ｚｈａｎ　ｍｉｎ　，Ｗｕ　Ｙａｎ—ｍｉｎ　’　（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｐａｓｔｏｒａｌ　Ａｇｒｉｃｕｈｕｒｅ　Ｓｃｉｅｎｃｃ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎ。ｌｏｇｙ，Ｉ．ａｎｚｈｏｕ　ＵｎｉＶｅｒｓｉｔｙ，Ｉ．ａｎｚｈｏＬＩ　７３００２０，Ｃｔ１ｉｎａ；　２．Ｂｉ。ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｔ１　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ。ｆ　ＡｇｒｉｃｕＩｔｕｒａ１　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＣＡＡＳ），Ｂｅｉｊｉｎｇ　１０００８１，Ｃｈｉｎ　３．Ｓｈｅｎｚｈｅｎ　Ｔｅｃｈａｎｄ　１．ａｎｄｓｃａｐｅ　Ｃｏ．，Ｉ，ｔｄ．Ｓｈｅｎｚｈｅｎ　５　１８０４０，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９　ｓｙｓｔｅｍ　ｉｓ　ａ　ｎｅｗ，ｐｒｅｃｉｓｅ　ｇｅｎｏｍｅ　ｅｄｉｔｉｎｇ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｗｈｉｃｈ　ｈａｓ　ｒｅｃｅｉｖｅｄ　ｗｉｄｅ　ａｔ　ｔｅｎｔｉｏｎ　ｒｒｏｍ　ｔｈｅ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｃ　ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ　ｇｌｏｂａｌｌｙ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９　ｉｓ　ｗｉｄｅｌｙ　ｕｔｉｌｉｓｅｄ　ｆｏｒ　ｓｔｕｄｙｉｎｇ　ｇｅｎｅ　ｆｕｎｃｔ　ｉ‘）ｎｓ，　ｈｅｃａｕｓｅ　ｉｔ　ｅｎａｂｌｅｓ　Ｄｒｅｃｉｓｅ　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｇｅｎｅ　ｓｉｔｅｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ｋｎｏｃｋｏｕｔ，ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ，ａｎｄ　ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ・　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９　ｈａｓ　ｍａｎｙ　ａｄｖａｎｔａｇｅｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ，ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ，ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ，ａｎｄ　ａ　ｗｉｄｅ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌａｒｇｅ　ｓｉｔｅｓ．Ｐｒｅｓｅｎｔｌｙ，ｔｈｉｓ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｉｓ　ａｐｐｌｉｅｄ　ｉｎ　ａｌｌ　ｔｈｅ　ｆｉｅｌｄ　ｏｆ　ｌｉｆｅ　ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ｎｌｌｃｒｏｏｒｇａｎｌｓｍｓ，ｐＩａ“１　’　ａｎｉｍａｌｓ，ａｎｄ　ｈｕｍａｎ　ｇｅｎｅ　ｔｈｅｒａｐｙ．Ｔｈｅ　ｐｒｅｓｅｎｔ　ａｒｔｉｃｌｅ　ｂｒｉｅｆｌｙ　ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｓ　ｔｈｅ　ｃｏｕｒｓｅ　ｏｆ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ＣＲＩＳＩ’Ｒ／　Ｃａｓ９　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ａｃｔｉｏｎ，ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　ａｄｖａｎｔａｇｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，ａｎｄ　ｉｔｓ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ・Ｉｔ　ＳＵｎｌｇｌｌ￣ｔｒｌｚ（　ｓ　ｔｈｅ　ｐｒｏｇｒｅｓｓｅｓ　ｉｎ　ｔａｒｇｅｔｔｅｄ　ｐｌａｎｔ　ｇｅｎｏｍｅ　ｅｄｉｔｉｎｇ，ａｎｄ　ｄｉｓｃｕｓｓｅｓ　ｔｈｅ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｉｓ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｌｎ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｎ　ｇｒａｓｓ　ｓｐｅｃｉｅｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｇｅｎｏｍｉｃｓ，　ｇｅｎｅ　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ａｎｄ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ａｎｄ　ｇｅｎｅｔ　ｃ　１ｎ］　ｐｒｏｖｅｍｅｎｔ，ｗｈｉｃｈ　ｐｒｏｖｉｄｅｓ　ａ　ｕｓｅｆｕ１　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｌａｔｅｒ　ｒｅｓｅａｒｃｈｅｓ　ａｎｄ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｉｓ　ｆｉｅｌｄ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９　ｓｙｓｔｅｍ；ｇｅｎｏｍｅ　ｅｄｉｔｉｎｇ；ｇｒａｓｓ；ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓ￣ｓ；ｇｅｎｅ　ｔｕｉｎｃｔｌｏｎ　ｒｅｓｅａｒｃｎ；ｇ　ｎｅｔｉｃ　ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ　Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎ譬ａｕｔｈｏｒ：Ｗｕ　Ｙａｈ—ｒａｉｎ　Ｅ　ｍａｉｌ：ｗｕｙａｎｍｉｎ＠ｃａａｓ．ｃｎ　基金项目：霉品眢：　‘闰家内然科学基金项目（１　科　：目２０ｆ１３６　３】－　１７１　２０３１）６１　）；同家重点基础研究发展．同家重点基础研究发展“．　　”９７３　”项目（项｝＝ｊ（　２Ｏ１　４ＣＢ１　３８　１７ｏ）”’　　Ｊ尔臼自城付但　；』一东省省级科技汁：ｌｔ￣Ｊ项ｆ｜Ｉ　ｔ　２０１ｃｕ　ｘ　５Ｂ０９０９０　００８ｔｗｗｏ／、　羹通信作者　：主　？ｓ１　ｚ９　５５本溪人－￣ｇ－￣Ｋ　　罂吉　箍　吴燕民（　），男，陕　人，研究员，博士，研究方向为植物分子生物学与基　：Ｉ程。　＿　ｋＥ－ｍ　ａｉｌ　ｙ）ａ３ｎ１ｍ０＠ｌｎ　＠１Ｇ…３，ｃｏ　ｍ：　“　ｈｔｔｐ：／／ｃｙｋｘ．１ｚｕ．ｅｄｕ．ｃｍ　第６期　王丹等：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９基因组编辑技术及其在草类植物中的应用　１２０５　基因编辑（ｇｅｎｏｍｅ　ｅｄｉｔｉｎｇ）是可以对基因组进行　古细菌中，发现了结构组成与ＣＲＩＳＰＲ类似的序　列　］，２００２年这种结构正式被命名为成簇规律性间　隔短回文重复，即ＣＲＩＳＰＲ，并预测这种特殊的重复序　列发挥着至关重要的生物学功能ｌ】　。２００５年，科学家　发现一部分细菌的ＣＲＩＳＰＲ中的间隔序列与细菌病　毒基因组序列信息高度一致，并推测这一序列可能参　与了应对噬菌体入侵的免疫防御口　。２００７年，嗜热链　球菌ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统直接参与细菌对噬菌体的免　疫反应被证明ｌ＿】　。２００８年，验证ＣＲＩＳＰＲ能直接干　扰ＤＮＡ阻止外源质粒在表皮葡萄球菌的转移Ｉ］　，证　定点修饰的一种技术，是研究特定基因功能的基础。　近年来，基因组编辑技术主要有锌指核酸酶（ｚｉｎｃ　ｆｉｎ—　ｇｅｒ　ｎｕｃｌｅａｓｅ，ＺＦＮ）技术和转录激活样效应因子核酸　酶（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ—ｌｉｋｅ　ｅｆｆｅｃｔｏｒ　ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，　ＴＡＩ　ＥＮ）技术。这两种人工核酸酶的原理都是通过　ＤＮＡ结合蛋白与核酸内切酶Ｆｏｋ工切割结构域融合，　在靶位点将ＤＮＡ切断。而ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ　ｒｅｇｕｌａｒｌｙ　ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ　ｓｈｏｒｔ　ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ　ｒｅｐｅａｔｓ／　ＣＲＩＳＰＲ—ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ）系统作为新一代基因组　编辑技术，一经问世就受到人们的高度关注和极大反　响ｌ＿。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统是细菌和古细菌在长期演　化过程中形成的一种抵御病毒侵袭的免疫防御系统，　通过将人侵噬菌体和ＤＮＡ的片段整合到ＣＲＩＳＰＲ　中，并利用相应的ＣＲＩＳＰＲ　ＲＮＡｓ（ｃｒＲＮＡｓ）来指导同　源序列的降解，对抗入侵的病毒及外源ＤＮＡ＿２］，科学　家们利用ｓｇＲＮＡ识别特定序列引导Ｃａｓ９蛋白切割　原理，通过对ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统改造，对特定基因位　点进行敲除、插入和替换等精确编辑。因其操作简单、　重组效率高、靶位点选择具有广泛性、同时可针对多个　基因进行编辑、具有广泛的物种适应性及试验周期短、　成本低等优势，受到研究者的青睐ｌ３　。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９　体系可进行探究基因功能，对目标生物的基因组进行　特异性的基因编辑，应用领域十分广泛，几乎涉及到原　核生物、动植物基因编辑与人类基因治疗等整个生物　界　］。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９体系目前已在多种植物中开展　了基因组编辑相关研究，但在草业领域的研究应用尚　处于起步阶段，利用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统可有效地开　展基因功能研究，发掘优良基因，进行代谢调控研究，　探明代谢调控机理，进行有针对性的基因敲除和优良　明Ｃａｓ９蛋白是抵抗病毒的基础　】　。２００９年，揭示了　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统是通过Ｃａｓ９蛋白识别外源　ＲＮＡｓ，然后进行干扰或切割阻止其表达，阻止病毒和　其它原核生物人侵　引。２０１１年，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统　作用机制被阐述　，同时推测Ｃａｓ９、ｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ—　ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　ｃｒＲＮＡ）和ｃｒＲＮＡ共同作用降解与ｃｒＲＮＡ　互补的外源ＤＮＡ分子＿】　。２０１２年，Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ和　Ｄｏｕｄｎａ两位科学家使用重组Ｃａｓ９和体外转录的　ｃｒＲＮＡ证实ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统可以对特定的ＤＮＡ　位点进行切割，提出可利用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统进行　基因组编辑口　。２０１３年，验证ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统对　人和小鼠进行基因组编辑的可行性＿】　，并首次证实　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统能够用于植物进行基因组定点编　辑ｌ＿２　，并发表了ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统能有效的进行基　因定点沉默，可同时调控多个基因，该技术适用于基因　组编辑、多种生物医学研究、基因组功能分析和微生物　代谢工程等［。¨。此后人们应用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技术在　生命科学领域开展了大量的研究工作，其强大的功能　和应用领域被逐步开拓。　１．２　ｃＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９的作用机理　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统是细菌和古细菌在长期演化　过程中形成的一种适应性免疫防御系统，广泛存在于　细菌和古细菌的基因组中Ｅ２２］。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统的　基因的定点整合和多个优良农业性状的聚合，将为草　业领域基因遗传改良研究带来突破性进展。　ｌ　ｃＲＩｓＰＲ／ｃａｓ９系统概述　核心部分包括基因组（染色体或质粒）中的ＣＲＩＳＰＲ　阵列和Ｃａｓ９蛋白，ＣＲＩＳＰＲ阵列由一个前导序列　１．１　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统的发展历程　１９８７年Ｉｓｈｉｎｏ等［６　在对一种细菌的碱性磷酸酶　基因进行研究时，发现一段串联的短回文重复结构。　（１ｅａｄｅｒ）和重复序列（ｒｅｐｅａｔｓ）及来源于病毒或质粒等　外源ＤＮＡ的间隔序列（ｓｐａｃｅｒ）相间组成，外源ＤＮＡ　的间隔序列前体（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ）侧翼有一段保守短序　列，即间隔序列前体旁基序ＰＡＭ（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ　ａｄｊａ—　ｃｅｎｔ　ｍｏｔｉｆ），是获取ＤＮＡ片段所需的识别序列。　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９与靶位点识别的特异性主要依赖于　１９９３年，Ｍｏｊｉｃａ等　在极端耐盐的古细菌中发现一段　具有３０个碱基并被３６个碱基隔开的重复回文序列，　与已知的微生物的重复序列家族都不具有一致性，推　测这些存在于古细菌中的重复序列结构可能具有重要　功能　ｊ。截至２０００年，先后在２０余种不同的细菌和　ｓｇＲＮＡ与靠近ＰＡＭ（ＮＧＧ）处１０～１２　ｂｐ碱基的配　草业科学　第３４卷　对。Ｃａｓ９蛋白往往与ＣＲＩＳＰＲ位点的重复序列相连，　是一类较大的多态性家族，包括一些核酸酶、解旋酶、　有物种进行基因组编辑　。４）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统可　以同时对靶基因的不同位点进行编辑，也可以同时针　对多个基因进行编辑［３　，其在基因操作中的优势也比　较明显。５）应用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统进行基因修饰可　聚合酶和ＲＮＡ结合蛋白等，具有核酸相关的功能域。　在ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统中当噬菌体病毒或质粒入侵　时，系统会将噬菌体的一段ＤＮＡ序列重组并整合到　ＣＲＩＳＰＲ　５　端的两个重复序列之间，当病毒再次入侵　时，系统将能够识别入侵者携带的外源核酸中的特殊　片段，ＣＲＩＳＰＲ系统转录生成ｃｒＲＮＡ与系统编码　遗传，具有直接获得纯合子的可能，可同时对两个位点　切割，然后在单链ＤＮＡ模板的介导下进行同源重组，　在两个位点同时编辑＿３　，缩短试验周期。６）　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统可获得没有筛选基因、报告基因等　外源基因的转基因植物，外源插人基因可以在后代的　ｔｒａｃｒＲＮＡ结合形成向导ＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ　ｇｕｉｄｅ　ＲＮＡ，　ｓｇＲＮＡ），ｓｇＲＮＡｓ与Ｃａｓ９蛋白结合形成蛋白复合　物，该复合物特异性识别并整合入侵噬菌体的ＤＮＡ　序列后，Ｃａｓ９蛋白具有核酸内切酶的活性，可将与　ｃｒＲＮＡ互补的双链ＤＮＡ切割，形成双链断裂，导致人　分离中很容易与靶突变位点发生分离，从而获得无筛　选基因的遗传改良作物＿３　，大大提高人们对转基因作　物的接受程度。　侵噬菌体或质粒ＤＮＡ降解，抵御入侵的病毒及外源　ＤＮＡ，提供免疫防御＿２　。　。　科学家们依据ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９系统在细菌体内的　免疫防御原理，通过人工改造ｓｇＲＮＡ和Ｃａｓ９蛋白，　Ｃ髂９蛋白　Ｃ柚９　应用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统进行基因组编辑研究（图１），　设计ｓｇＲＮＡ序列依据识别靶基因序列（ｃｏｄｉｎｇ　ｓｅ—　ｑｕｅｎｅｅ，ＣＤＳ）区域达到精确定位功能，将设计好的　ｓｇＲＮＡ序列与Ｃａｓ９蛋白构建表达载体，转染靶细胞，　先进行基因组靶位点识别，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统与目标　ＤＮＡ结合后，直接参与目标ＤＮＡ的解旋和对ＤＮＡ　的切割使双链断裂，然后激发生物体本身的修复机制，　向导ＲＩｇＡ　ｓｇ　在修复过程中会产生碱基的缺失或插入，造成ＤＮＡ　的突变　，结合人工设计修复模板，完成基因组的定　点敲除、插入、替换引入外源基因等操作。随着研究的　不断深入开展，该项技术将会更加高效地应用在与基　因组编辑相关的研究中。　靶标序列　Ｔ￣－ｇｅｔ￣ｔｕｅｎｅｅ　１．３　ｃＲＩｓＰＲ／ｃａｓ９系统的优势　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统作为新一代的基因组编辑技　术，表现出许多优越性：１）实验操作简便、周期短、成　本低，只需设计ｓｇＲＮＡ就可以靶向不同的位点，针对　基因的编码区构建出功能缺失突变体，开展基因转录　图１　ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９系统工作原理示意图　Ｆｉｇ．１　Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ　ｄｉａｇｒａｍ　ｄｅｓｃｒｉｂｉｎｇ　ｔｈｅ　ｗｏｒｋｉｎｇ　ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９　ｓｙｓｔｅｍ　注：根据文献Ｅ４］和［２５］整理而成。　Ｎｏｔｅ：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ［４］ａｎｄ［２５］．　和翻译水平的研究＿２　。２）系统靶向精确性更高，更　具有可控性。通过改变ｓｇＲＮＡ的序列实现对基因的　２　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统的功能及应用领域　特异性修饰，较短的ｓｇＲＮＡ序列使ＣＲＩｓＰＲ／Ｃａｓ９的　切割效率更高。可以通过对Ｃａｓ９蛋白的修饰，让它不　切断ＤＮＡ双链，而只是切开单链，这样可以大大降低　切开双链后带来的染色体变异风险［２。　。３）靶位点　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统可用于基因位点各种修饰方　式，包括基因敲除、基因修复、同源重组、定点整合、大　片段删除以及多基因同时敲除蛋白质定位、抑制或激　活基因转录及表观基因组编辑等，随着研究的深入，更　多的功能将会被开发利用　。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９作为　选择的广泛性，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９要求靶位点序列在生物　基因组中广泛存在，使得该项技术几乎可以应用到所　ＲＮＡ靶向的基因组定向编辑新技术，因其强大的功　第６期　王丹等：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９基因组编辑技术及其在草类植物中的应用　１２０７　能，在生命科学的各个领域均能展开相关的应用研究。　病　］，应用性抗菌药物［５９　等方面都开展了相关研究，　并取得一定的进展。　２．１微生物领域　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统是从细菌抗噬菌体病毒系统　中演变而来，通过对ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统有针对性地　编辑微生物基因组靶向杀死野生型细胞，已成功应用　于肺炎链球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ｌ＿３　］和大肠　杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）＿３　，同时开展了酿酒酵母　（ＳａｃｃｈａｒｏＴｇｌｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等位基因的置换ｌ３　，提高　２．４植物领域　应用ＣＲ１ＳＰＲ／Ｃａｓ９基因编辑技术在基因组的原　位实现对基因的定点突变、定点整合、基因置换及基因　修复等，是植物遗传改良和分子设计的理想途径。通　过基因的定点突变与置换，获得目标性状的遗产改良，　可以避免转基因表达的不可控性和食品安全顾虑，是　一了乳酸杆菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）潜在应用价值研究口　，对　病毒基因组展开全面系统研究＿＿３　，伴随ＣＲＩＳＰＲ／　Ｃａｓ９系统的深入研究，该项技术在微生物领域的应用　将全面展开。　种比较理想和高效的作物遗传改良方法。通过　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９能更加快速高效的实现植物性状的改　良，对植物基因功能的研究与应用具有重要的意义。　目前已经在包括模式植物拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉ—　ａｎａ）、烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ），以及重要农作物水　稻（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ）、小麦（Ｔｒｉｔｉｃａｍ　ａｅｓｔｉｖｕｍ）等在内　的多种植物中开展基因组定点编辑研究（表１）。　２．４．１　拟南芥　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技术应用于模式植物　拟南芥，开展了对绿色荧光蛋白报告基因ＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ）和乙醇脱氢酶基因ＡＤＨ１（ａｌｃｏ—　ｈｏｌ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　１）位点突变研究，通过对Ｔ２、Ｔ３代　２．２动物领域　利用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技术对基因组进行精确编　辑，有效提高了研究效率，而且大大缩短了育种年限。　目前ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９介导的基因靶向修饰成功地应用　于多种动物研究应用，在模式动物秀丽线虫（Ｃａｅ—　ｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ　ｅｌｅｇａｎｓ）＿４　、果蝇（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｅｌａｎｏ—　ｇａｓｔｅｒ）　、斑马鱼（Ｄａｎｉｏ　ｒｅｒｉｏ）Ｅ４ｚ］、爪蟾（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ）［”］、小鼠（Ｍｕｓ　ＵＳＣＵ￣Ｓ）［　］、大鼠（Ｒａｔｔｕｓ　稳定遗传性检测表明：其突变效果稳定且符合孟德尔　ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）［４５　中采用Ｃａｓ９一ｓｇＲＮＡ技术实现靶基因　的定点敲除和修饰。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技术将构建的　Ｃａｓ９　ｍＲＮＡ／ｓｇＲＮＡ注射受精卵，可以高效地获得基　因敲除的猪（Ｓｕｓ　ｓｃｒｏｆａ）［４引，成功获得了肌肉生长抑　遗传定律［６　。　。利用ＣＲＩｓＰＲ／Ｃａｓ９技术对拟南芥赤　霉素应答基因ＧＡＩ（ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｃ　ａｃｉｄ　ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ），胁迫　应答基因　ＡＺ１（　ａｓｍｏｎａｔｅ—ｚｉｍ—ｄｏｍａｉｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ１），油　菜素内脂受体基因ＢＲ　Ｉ１（ｂｒａｓｓｉｎｏｓｔｅｒｏｉｄ　ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　１），镁螯合酶基因ＣＨＬＩ（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ　ｃｈｅｌａｔａｓｅ　ｓｕｂ—　ｕｎｉｔ　１），种皮颜色调控基因ＴＴ４（ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔ　ｔｅｓｔａ　４）　制素ＭＳＴＮ（Ｍｙｏｓｔａｔｉｎ）基因敲除的绵羊（Ｏｖｉｓ　ａｒｉ—　ｅｓ）ｌ４　，并建立在活体动物细胞中观察特定基因座的　方法［蚰］。此外在兔（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ　ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）ｌ４　、猴　（Ｍａｃａｃａ　ｍｕｌａｔｔａ）　。。等动物中也获得了应用　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技术成功进行基因敲除的报道。　等不同基因的１２个靶位点进行编辑，在Ｔ。代中单个　突变植物后代发现约２２　的单株为纯合体　］，诱导拟　南芥ＡＤＨ１和ＴＴ４基因位点，结果均能有效诱导同　２．３医学领域中应用基因治疗　当ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９基因编辑技术诞生，人们就开　始探讨这项技术应用于医学领域的研究，尝试应用同　源修复途径发生的突变［６引，对卵细胞特异性启动子　ＥＣ１．２（ｅｇｇ　ｃｅｌｌ—ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｇｅｎｅ）相关基因位点进行编辑　研究，实现多基因的突变［６　。　２．４．２　烟草　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统在烟草中的应用，构　源介导的修复机制，将正确的序列引入细胞中替代突　变的序列，进行基因修复，以此达到基因治疗的目的。　应用ＣＲＩＳＰＲ系统研究在活细胞中有效激活基因，促　建靶向番茄红素脱氢酶ＰＤＳ（ｐｈｙｔｏｅｎｅ　ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ）基　因位点的Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ，采用ＲＥ—ＰＣＲ方法分析，结　果表明突变率为１．８　～２．４　。通过ＣＲＩＳＰＲ／　进对整个基因组的功能筛选以及特定疾病的基因鉴　定＿５　。应用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技术构建小鼠癌症模　型＿５引，人干细胞阿尔茨海默病模型　，加速对病症的　研究工作。此外，利用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技术修复肝细　胞中Ｆａｈ突变基因［６４３，修复囊肿性纤维化跨膜传导　受体基因｜５　、肿瘤基因敲除Ｅ５６］、遗传疾病缺陷基因的　修复　，在逆转录病毒和ＤＮＡ病毒感染引起的疾　Ｃａｓ９系统敲除烟草的两个转录因子基因ＰＤＳ和　ＰＤＲ６，插入或缺失频率约１６．２　～２０．３　，在靶向　报告基因ＧＵＳ（Ｊ３一ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ，ＧＵＳ）、番茄红素脱　氢酶ＮｂＰＤＳ、戊烯基／－甲基烯丙基二磷酸合酶基因　ＮｂｌｓｐＨ等的编辑研究中，也证实了ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９　系统成功应用于烟草ｌｌ６　。　ｌ２Ｏ８　草　业　科　学　第３４卷　拟南芥Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ　ＧＦＰ　ＡＤＨｊ　［６ｏ］　［６１］　［６２］　［６３］　［６４］　［６５］　ＧＡＩ，ＢＲｎ。ＪＡＺＩ，ＣＨｆＪ儿，ＴＴ４　ＡＤＨｊ。Ｔ丁４　ＥＴＣ２　烟草Ｎｉｃ’ｏｔｉａｎａ　ｔａｂａ　ｃ“，”　ＧＦＰ、ＰＤｓ　ＮｔＰＤＳ、ＮｔＰＤＲ６　［６６］　［６７］　［６８］　ｆｓＧＵＳ、ＮｂＰＤＳ、ＮｂｌｓｐＨ　水稻Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ　Ｒ０（　５、ＳＰＰ、ｙＳＡ　（）　ＰＤＳ，（　ＰＭＳ３，（）　ＥＰＳＰＳ，０　ＤＥＲＦｊ，０　ＭＳＨｊ，（）　＾　ｙＢ５　ＯｓＭｙＢｊ，ＯｓＲ０Ｃ５，ＯｓＳＰＰ，ＯｓｙＳＡ　ＢＥＩ　［６９］　［７ｏＪ　［７１］　［７２］　ＯｓＭＰＫ５　ＰＴ（ｊ１，ＰＴＧ１．１，ＰＴＧ２，ＰＴＧ２．１　ＴａＬ０Ｘ２　ＥＳＴ　［７３］　ＴａＭｌ　０　Ａ，ＴｕＭｌ　（）Ｂｌ，ＴｎＭｌ，（）一Ｄｌ　ｐＣｉｎｏｘｌ，ｐＣｉｎｏｘ２，ｐＣｗｐｄｓｌ，ｐＣｚｖｐｄｓ２　毛米ＺｅａⅢ“　ＺｍＰＤＳ．ＺｍＩＰＫ１Ａ．ＺｍｊＰＫ，ＺｍＭＲＰ４　Ｚ１７２ＨＫＴ１　大豆（；　（ｉｎｅⅢ“　ＧｌｙｍａＯ６ｇｌ４１８Ｏ，ＧｌｙｍａＯ８ｇ０２２９０，Ｇｌｙｍａｌ２９３７０５０　ＧＦＰ　高粱Ｓｏｒｇｈｕｍ　６　（Ｏ［ＯＵ　ＧＦＰ　马铃薯Ｓｏｌａｎｕｍ　ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ　番茄Ｉ．ｙｃｏｐｅｒｓｉ（０”　’ｕｌｅｎｌｕｍ　舌什橙Ｃｉｔｒｕｓ　ｓｉｎｅｎｓｉｓ　毛门杨Ｐｏｐｕｌｕｓ　ｇＯ１１７ｇｌｌｇＯ，＇；ａ　地钱Ｍａｒｃｈａｎｌｉａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ　自　脉根Ｌｏｔｕｓ　ｊａｐｏｎｉ　ｃ’ｌｌＳ　ＳｔＩＡＡ２　ＳｆＡＧ０７　ＣｓＰＤｓ１，ＣｓＰＤｓ２　ＰｔＰＤＳ１　ＰｔＰＤＳ２　ＡＲＦｊ　ＳＹＭＲＫ　Ｇ【，Ｓ　ＰＤＳ　［［［［玎　［［ｉ］　］　［要［　［ｌ引　［［［［［阱　［一　［一一［　　］］　］］］　］］］　蒺藜苗’蓿Ｍｅｄｉｃａｇ０　ｔｒｕｎ（’ａｔｕｌａ　２．４．３水稻利用ＣＲ１ＳＰＲ／Ｃａｓ９系统在水稻中实现　Ｄａｔｈｗａｖ　ｆｏｒ　ａｒｏｍａｔｉｃ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），转录［大ｌ　子０ｓＤＥＲＦ１、０　ＭＹＢ５、ＯｓＭＹＢ１和逆境应答相关基　因ＯｓＭＳＨｊ（ＤＮＡ　ｍｉｓｍａｔｃｈ　ｒｅｐａｉｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｏｓ—　了抗性相关基因ＲＯＣ５（ｒｉｃｅ　ｏｕｔｅｒｍｏｓｔ　ｃｅｌｌ—ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｇｅｎｅ　５）、叶绿体加工酶基因ＳＰＰ（ｓｔｒｏｍａｌ　ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　ｐｅｐｔｉｄａｓｅ）、叶绿体发育基因ＹＳＡ（ｙｏｕｎｇ　ｓｅｅｄｌｉｎｇ　ａｌ—　ＲＯＣ５、０ｓＳＰＰ、ＯｓＹＳＡ等１Ｏ个靶标基因进行定点突　变，获得转基因株系中突变率为４４．４　，其中７．７　为　纯合系Ｅ７ｏ］。针对水稻除草剂抗性基因ＢＥＬ（ｂｅｎｔａｚｏｎ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｌｅｔｈａｌ　ｇｅｎｅ）设计３个不同ｇＲＮＡｓ，结果表明　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统突变效率在２　～１６　，表型分析　显示转基因植物对除草剂苯达松敏感　。通过构建３　ｂｉｎｏ）　和周期蛋白依赖性激酶基因ＣＤＫ（ｃｙｃｌｉｎ—ｄｅ—　ｐｅｎｄｅｎｔ　ｋｉｎａｓｅ）　等基因的定点突变。针对两个水　稻亚种巾的基因敲除标记基因　ＰＤｓ（ｐｈｙｔｏｅｎｅ　ｄｅ—　ｓａｔｕｒａｓｅ　ｇｅｎｅ）、ＯｓＰＭＳ３（ｔｈｅ　ＯｓＰＭＳ３　ｇｅｎｅ　ｃｏｄｅｓ　ａ　ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ　ＲＮＡ）、ＯｓＥＰＳＰＳ（ａ　ｋｅｙ　ｅｎｚｙｍｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｈｔｔｐ：／／ｃｙｋｘ．１ｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ　第６期　王丹等：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９基因组编辑技术及其在草类植物中的应用　１２０９　个与水稻胁迫应答相关基因ＯｓＭＰＫ５不同位点配对　植株，对转基因后代分析显示ＣＲＩｓＰＲ／ｃａｓ９在番茄　的Ｃａｓ９／ｇＲＮＡｓ发现，ｇＲＮＡ与靶标ＤＮＡ的配对位　置是决定Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ打靶特异性的关键因素　７　。　Ｘｉｅ等＾７３　构建多个ｔＲＮＡ－ｇＲＮＡ多顺反子ＰＴＧ（ｐｏｌｙ—　ｃｉｓｔｒｏｎｉｃ　ｔＲＮＡ－ｇＲＮＡ　ｇｅｎｅ）基因，应用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９　中诱导的突变能够稳定遗传给后代。　２．４．１０　甜橙　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９在甜橙中应用突变　ＰＤＳ基因，检测突变频率在３．２％～３．９％，为今后利　用该技术进行柑橘的品种改良奠定了基础¨８　。　技术，获得了稳定的水稻转基因株系。　２．４．４　小麦　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统在小麦中的应用，靶　向脂氧合酶基因ＴａＬｏｘ２（１ｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ），获得稳定的　基因突变株系＿７　，靶向ＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｔａｇｓ）基因，结果表明利用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统可减少　小麦植酸含量＿７　，对ＭＬＯ（ｍｉｌｄｅｗ—ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｌｏｃｕｓ）　２．４．１１　杨树　通过分析不同ｓｇＲＮＡ结合毛白杨　ｐｄｓ靶基因ＤＮＡ序列后对突变效率的影响，其中３　端的碱基配对更为重要。利用该技术，获得多个杨树　转录因子及结构基因的敲除突变体株系，为将来开展　基因功能研究和杨树遗传改良奠定了基础　。　２．４．１２地钱　Ｓｕｇａｎｏ等　构建针对生长素正调控　因子ＡＲＦｊ（ａｕｘｉｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｆａｃｔｏｒ）基因的ｓｇＲＮＡ，转　基因位点进行突变，获得了抗白粉病的特性小麦ｌ７　，　对报告基因ｉｎｏｘ（ｉｎｏｓｉｔｏｌ　ｏｘｙｇｅｎａｓｅ）和ｐｄｓ（ｐｈｙ—　化地钱壳孢子，在Ｔ　代中检测突变率为１１．１　，这些　ｔｏｅｎｅ　ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ）基因不同位点的研究表明ＣＲＩＳＰＲ／　Ｃａｓ９系统可同时对一个基因不同位点及不同的两个　基因进行编辑＿７川。　２．４．５玉米　应用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统，获得两个靶向　突变能够以胞芽无性生殖的方式稳定遗传给后代。　在开展基础研究的同时，也开展了针对ＣＲＩＳＰＲ／　Ｃａｓ９系统的优化和提高效率等研究，Ｊｏｈｎｓｏｎ等　妇通　过设计１２个不同的ｓｇＲＮＡ，评估ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统　效率，探索优化设计方案，Ｉ　ｅｉ等　２ｌ提供了一个２６种　植物设计ｓｇＲＮＡ和检测脱靶位点的开放的网络平　植酸合成的关键酶基因ＺｍｌＰＫ（ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｐｈｙｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｋｉｎｅｓｅ）的玉米，突变率分别为ｌ６．４　和１９．１　ｌ７　。靶向　高亲和性钾转运蛋白基因ＨＫＴ（ｈｉｇｈ－ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　台，这些都促进了该项技术在植物中的应用效率。　３　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统在草类植物中的应用前景　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统在草类植物基因功能、基因代　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ），在玉米原生质体中瞬时表达和转基因玉米　植株中稳定遗传的突变体ｌ＿７　。　２．４．６　大豆　在应用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统对大豆进行　靶向基因组编辑试验中，分别应用大豆ＧｍＵ６和拟南　芥ＡｔＵ６启动子突变ＧｌｙｍａＯ６ｇｌ４１８０（ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　１】　Ｕ６　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　ｓｏｙｂｅａｎ），ＧｌｙｍａＯＳｇ０２２９０和Ｇ　ｖ—　谢及表达调控、遗传改良等研究中具有广阔的应用前　景。　３．１基因功能研究　应用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统进行基因组编辑研究，　ｍａｌ２ｇ３７０５０基因，结果表明，使用大豆ＧｍＵ６启动　子的打靶效率明显高于使用拟南芥ＡｔＵ６启动子的打　靶效率　。Ｊａｃｏｂｓ等　构建了针对ＧＦＰ的５　和３　的两个ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９载体，结果表明，针对５　的效率　远高于３　而且突变频率随着培养时间的延长而增加。　２．４．７　高粱　利用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统，构建应用　Ｙ１５８载体，包含Ｕ６启动子、靶向红色荧光蛋白基因　ＤｓＲＥＤ２（ｒｅｄ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ）的５　端，针对高粱　幼胚进行转化，结果获得稳定表达¨８　。　针对丰富的草类植物种质资源开展基因组学研究，可　全面深入地挖掘基因功能，获得重要的遗传信息。　Ｗａｎｇ等　印应用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统对豆科模式植物　百脉根（Ｌｏｔｕｓ　ｊａｐｏｎｉｃａｓ）共生固氮ＳＮＦ（ｓｙｍｂｉｏｔｉｃ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｆｉｘａｔｉｏｎ）相关基因进行编辑研究，建构以　ＳＹＭＲＫ（ｓｙｍｂｉｏｓｉｓ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ—ｌｉｋｅｋｉｎａｓｅ）基因为靶向　的ＳＹＭＲＫ～ｓｇＲＮＡ，获得突变植株，加快了ＳＮＦ相关　基因功能的研究。草类植物资源丰富，生态适应性广　泛，在各种极端生境中都有生长，应用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９　技术将促进发掘一些在极端生境中生长的乡土草品种　的特殊性状基因，如在沙漠中生长的草类的耐旱基因，　２．４．８马铃薯通过构建含有Ｕ６启动子，ｓｇＲＮＡ靶　向编码ＩＡＡ蛋白的ＳｔｌＡＡ２（ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ａｎ　Ａｕｘ／ＩＡＡ　ｐｒｏｔｅｉｎ）基因的载体，利用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统敲除马　铃薯ＳｔｌＡＡ２基因，获得突变体，在Ｔ　中发现纯合子，　表明应用该系统可进行马铃薯基因编辑相关研究　。　２．４．９　番茄　Ｂｒｏｏｋｓ等　建构了两个ｓｇＲＮＡｓ敲除　番茄花器官发育相关基因ＳＬＡＧ０７，获得转基因突变　在盐碱地生长的草类植物的耐盐碱基因，在高海拔环　境生长的草类植物的耐寒、耐贫瘠基因等等。开展草　类植物优良基因质源的收集，实现优良基因的高效利　用　草　业科学　第３４卷　３．２基因代谢及表达调控研究　应用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统加速了科学家们探明基　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统应用在牧草和草坪草的遗传改良，　能有针对性的在基因组水平上改造牧草和草坪草的遗　因代谢途径和转录调控机制的脚步，可获得多个基因　定点敲除、插入等突变，实现基因组水平上的基因改　造、转录调控与表观遗传调控Ｅ　］。Ｍｅｎｇ等［９　利用　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统成功对豆科模式牧草蒺藜苜蓿　（Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）的ＰＤＳ基因进行定点敲除，　传性状，提高育种的目的性和可操作性，用过设计目标　结构产生可遗传变异，更加快速、高效的获得基因组靶　位点的突变、特异性变异和定向基因修饰等，加速草业　领域培育优良品种进程。根据草类植物的培育需求，　应用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统使优良基因定点整合，针对　草坪草改良抗旱、耐病、耐践踏、再生性强等性状的基　并在Ｔ。代得到１ｏ．３５　的纯合敲除突变体，为苜蓿等　豆科牧草的功能基因组学研究提供了新的研究工具。　据此，可通过设计突变同一个代谢通路上的靶基因，通　过进行不同基因功能缺失突变，建立功能基因的突变　体库，促进草类植物代谢和基因调控机理研究。探明　因，针对牧草定向改良抗逆性强、产量高、营养丰富等　基因性状，针对生态修复用途的草类植物可改良耐贫　瘠、抗逆性强、耐盐碱、抗风、抗倒伏等一些特定需求的　基因性状，同时探讨多个优良农业性状的聚合。使得　遗传改良效率更高，使牧草和草坪草育种更具科学性　和精确性。　草类植物的营养代谢、激素调控、水分运输等与生长发　育相关的代谢调控途径及生物和非生物逆境应答途　径，对于促进草类植物的资源开发、栽培利用等都具有　重要的意义。　应用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统必将加快现代牧草和草　坪草遗传改良育种进程，成为提高产量、抗性和品质的　一３．３遗传改良　目前，在草类植物遗传改良的研究中，已开展应用　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统对百脉根共生固氮ＳＮＦ相关基　因进行编辑研究＿８　，对蒺藜苜蓿基因ＧＵＳ组定向编　个重要契机，基因组编辑的研究快速发展，推动基因　的功能研究和物种的改良，必将为草业领域基因功能　基础理论研究和遗传改良应用带来广阔的应用前景，　为草业的发展带来新的契机。　辑研究　，对ＰＤＳ基因进行定点敲除研究ｌｇ　。　参考文献Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ：　［１］Ｌａｎｄｅｒ　Ｅ　Ｓ．Ｔｈｅ　ｈｅｒｏｅｓ　ｏｆ　ＣＲＩＳＰＲ．Ｃｅｌｌ，２０１６，１６４（１　２）：ｌ８—２８．　［２］Ｍａｋａｒｏｖａ　Ｋ　Ｓ，Ｈａｆｔ　Ｄ　Ｈ，Ｂａｒｒａｎｇｏｕ　Ｒ，Ｂｒｏｕｎｓ　Ｓ　Ｊ　Ｊ，Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ　Ｅ，Ｈｏｒｖａｔｈ　Ｐ，Ｍｏｉｎｅａｕ　Ｓ，Ｍｏｊｉｃａ　Ｆ　Ｊ　Ｍ，Ｗｏｌｆ　Ｙ　Ｉ，Ｙａｋｕｎｉｎ　Ａ　Ｆ，Ｏｕｓｔ　Ｊ　Ｖ　Ｄ，Ｋｏｏｎｉｎ　Ｅ　Ｖ．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＣＲＩＳＰＲ—Ｃａｓ　ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｎａｔｕｒｅ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０　１　１，９（６）：　４６７　４７７．　［３］Ｐｅｎｎｉｓｉ　Ｅ．Ｔｈｅ　ＣＲＩＳＰＲ　ｃｒａｚｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，３４１：８３３—８３６．　［４］Ｓａｎｄｅｒ　Ｊ　Ｄ，Ｊｏｕｎｇ　Ｊ　Ｋ．ＣＲＩＳＰＲ　Ｃａｓ　ｓｙｓｔｅｍｓ　ｆｏｒ　ｅｄｉｔｉｎｇ，ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ　ａｎｄ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｇｅｎｏｍｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１４，３２（４）：　３４７—３５５．　Ｅ５］Ｉ　ｉｓｔｅｄ　Ｎ．２Ｏｌ３　ｒｕｎｎｅｒｓ—ｕｐ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｍｉｃｒｏｓｕｒｇｅｒｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｍａｓｓｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，３４２：１４３４—１４３５．　［６］Ｉｓｈｉｎｏ　Ｙ，Ｓｈｉｎａｇａｗａ　Ｈ，Ｍａｋｉｎｏ　Ｋ，Ａｍｅｍｕｒａ　Ｍ，Ｎａｋａｔａ　Ａ．Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉａｐ　ｇｅｎｅ，ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ　ｆｏｒ　ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓ—　ｐｈａｔａｓｅ　ｉｓｏｚｙｍｅ　ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ，ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｐｒｏｄｕｃｔ．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，ｌ９８７，１６９（１２　Ｊ：　５４２９　５４３３．　［７］Ｍｏｊｉｃａ　Ｆ　Ｊ　Ｍ，Ｊｕｅｚ　Ｇ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ—Ｖａｌｅｒａ　Ｆ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓａｌｉｎｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｈａｌｏｆｅｒａｘ　ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ　ｓｅｇｕｅｎｃｅｓ　ａｄｊａｃｅｎｔ　ｔｏ　ｐａｒｔｉａｌｌｙ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｐｓｔｌ　ｓｉｔｅｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９３，９：６１３－６２１．　［８］Ｍｏｊｉｃａ　Ｆ　Ｊ　Ｍ，Ｆｅｒｒｅｒ　Ｃ，Ｊｕｅｚ　Ｇ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ—Ｖａｌｅｒａ　Ｆ．Ｌｏｎｇ　ｓｔｒｅｔｃｈｅｓ　ｏｆ　ｓｈｏｒｔ　ｔａｎｄｅｍ　ｒｅｐｅａｔｓ　ａｒｅ　ｐｒｅｓｅｎｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｌａｒｇｅｓｔ　ｒｅｐｌｉｃｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｒｃｈａｅａ　ｈａｌｏｆｅｒａｘ　ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ　ａｎｄ　ｈａｌｏｆｅｒａｘ　ｖｏｌｃａｎｉｉ　ａｎｄ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｒｅｐｌｉｃｏｎ　ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ—　ｇＹ．１９９５，ｌ７：８５—９３．　Ｅ９１　Ｍｏｊｉｃａ　Ｆ　Ｊ，Ｄｉｅｚ—Ｖｉｌｌａｓｅ　Ｃ，Ｓｏｒｉａ　Ｅ，Ｊｕｅｚ　Ｇ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ　ｏｆ　ａ　ｆａｍｉｌｙ　ｏｆ　ｒｅｇｕｌａｒｌｙ　ｓｐａｃｅｄ　ｒｅｐｅａｔｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｇｅｎｏｍｅｓ　ｏｆ　ａｒ—　ｃｈａｅａ，ｂａｃｔｅｒｉａ　ａｎｄ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０００，３６（１）：２４４—２４６．　［１ｏ］Ｊａｎｓｅｎ　Ｒ，Ｅｍｂｄｅｎ　Ｊ　Ｄ，ｂａａｓｔｒａ　Ｗ，Ｓｃｈｏｕｌｓ　Ｉ　Ｍ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｎｅｓ　ｔｈａｔ　ａｒｅ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＤＮＡ　ｒｅｐｅａｔｓ　ｉｎ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００２，４３（６）：５６５—１５７５．　ｈｔｔｐ：／／ｃｙｋｘ．１ｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ　第６期　王丹等：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９基因组编辑技术及其在草类植物中的应用　１２１１　ｃａ　Ｆ　Ｊ，Ｄｉｅｚ—Ｖｉｌｌａｓｅｎｏｒ　Ｃ，Ｇａｒｃｉａ—Ｍａｒｔｉｎｅｚ　Ｊ，Ｓｏｆｉａ　Ｅ．Ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｒｅｇｕｌａｒｌｙ　ｓｐａｃｅｄ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｒｅｐｅａｔｓ　ｄｅｒｉｖｅ　［儿］　Ｍｏｊｉｆｒｏｍ　ｆｏｒｅｉｇｎ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｅｌｅｍｅｎｔ．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，２００５，６Ｏ（２）：１７４—１８２．　　Ｐ，Ｍｏｉｎｅａｕ　Ｓ，Ｒｏｍｅｒｏ　Ｄ　Ａ，Ｈｏｒｖａｔｈ　Ｐ．Ｃｒｉｓｐｒ　ｐｒｏｖｉｄｅｓ　ａｃｑｕｉｒｅｄ　ｒｅ—　［１２］　Ｂａｒｒａｎｇｏｕ　Ｒ，Ｆｒｅｍａｕｘ　Ｃ，Ｄｅｖｅａｕ　Ｈ，Ｒｉｃｈａｒｄｓ　Ｍ，Ｂｏｙａｖａｌｓｉｓｔａｎｃｅ　ａｇａｉｎｓｔ　ｖｉｒｕｓｅｓ　ｉｎ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００７，３１５：１７０９—１７１２．　　Ｌ　Ａ。Ｓｏｎｔｈｅｉｍｅｒ　Ｅ　Ｊ．ＣＲＩＳＰＲ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ　ｌｉｍｉｔｓ　ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ　ｇｅｎｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｉｎ　ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ　ｂｙ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ＤＮＡ．Ｓｃｉ—　［１３３　Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉｅｎｅｅ，２００８，３２２：１８４３—１８４５．　ｊｋｈｕｉｓ　Ｒ　Ｊ　Ｈ，Ｓｎｉｊｄｅｅｒｓ　Ａ　Ｌ，Ｄｉｃｈｍａｎ　Ｍ　Ｊ，Ｍａｋａｒｏｖａ　Ｋ　Ｓ，Ｋｏｏｎｉｎ　Ｅ　Ｖ，　Ｅ１４］　Ｂｒｏｕｎｓ　Ｓ　Ｊ，Ｊｏｒｅ　Ｍ　Ｍ，Ｌｕｎｄｇｒｅｎ　Ｍ，Ｗｅｓｔｒａ　Ｅ　Ｒ，ＳｌｉＯｏｓｔ　Ｊ．Ｓｍａｌｌ　ＣＲＩＳＰＲ　ＲＮＡｓ　ｇｕｉｄｅ　ａｎｔｉｖｉｒａｌ　ｄｅｆｅｎｓｅ　ｉｎ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００８，３２１：９６０—９６４．　ｅ　Ｃ　Ｒ，Ｚｈａｏ　Ｐ，Ｏｌｓｏｎ　Ｓ，Ｄｕｆｆ　Ｍ　Ｏ，Ｇｒａｖｅｌｅｙ　Ｂ　Ｒ，Ｗｅｌ１ｓ　Ｌ，Ｔｅｒｍｓ　Ｒ　Ｍ，Ｔｅｒｍｓ　Ｍ　Ｐ．ＲＮＡ—ｇｕｉｄｅｄ　ＲＮＡ　ｃｌｅａｖａｇｅ　ｂｙ　ａ　Ｅｌ５］　ＨａｌＣＲＩＳＰＲ　ＲＮＡ—Ｃａｓ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｃｅｌｌ，２００９，１３９（５）：９４５—９５６．　ｆ　Ｙ　Ｉ，Ｋｏｏｎｉｎ　Ｅ　Ｖ．Ｕｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃａｓ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｆａｍｉｌｉｅｓ　ａｎｄ　ａ　ｓｉｍｐｌｅ　ｓｃｅｎａｒｉｏ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｏｒｉｇｉｎ　ａｎｄ　ｅ—　［１６３　Ｍａｋａｒｏｖａ　Ｋ　Ｓ，Ａｒａｖｉｎｄ　Ｌ，Ｗ０ｌｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ＣＲＩＳＰＲ—Ｃａｓ　ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｄｉｒｅｃｔ，２０１１，６：３８．　ｔｃｈｅｖａ　Ｅ，Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ　Ｋ，Ｓｈａｒｍａ　Ｃ　Ｍ，Ｇｏｎｚａｌｅｓ　Ｋ，Ｃｈａｏ　Ｙ，Ｐｉｒｚａｄａ　Ｚ　Ａ，Ｅｃｋｅｒｔ　Ｍ　Ｒ，Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ　Ｅ．ＣＲＩＳＰＲ　ＲＮＡ　ｍａｔｕｒａ—　［１７］　Ｄｅｌｔｉｏｎ　ｂｙ　ｔｒａｎｓ—ｅｎｃｏｄｅｄ　ｓｍａｌ１　ＲＮＡ　ａｎｄ　ｈｏｓｔ　ｆａｃｔｏｒ　ＲＮａｓｅ　Ｉｌｉ．Ｎａｔｕｒｅ，２０１１，４７１：６０２—６０７．　ｉｎｓｋｉ　Ｋ，Ｆｏｎｆａｒａ　Ｉ，Ｈａｕｅｒ　Ｍ，Ｄｏｕｄｎａ　Ｊ　Ａ，Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ　Ｅ．Ａ　ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ　Ｄｕａｌ　ＲＮＡ　ｇｕｉｄｅｄ　ＤＮＡ　ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ　［１８］　Ｊｉｎｅｋ　Ｍ，Ｃｈｙｌｉｎ　ａｄａｐｔｉｖｅ　ｂａｃｔｅｒｉａ１　ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１２，３３７：８１６～８２１．　　，Ｒａｎ　Ｆ　Ａ，Ｃｏｘ　Ｄ，Ｌｉｎ　Ｓ，Ｂａｒｒｅｔｔｏ　Ｒ，Ｈａｂｉｂ　Ｎ，Ｈｓｕ　Ｐ　Ｄ，Ｗｕ　Ｘ　Ｂ，Ｊｉａｎｇ　Ｗ　Ｙ，Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ　Ｉ　Ａ，Ｚｈａｎｇ　Ｆ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　ｇｅ—　［１９］　Ｃｏｎｇ　Ｉｎｏｍｅ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｕｓｉｎｇ　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ　ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，３３９：８１９－８２３．　　Ｊ，Ｇａｏ　Ｃ　Ｘ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｇｅｎｏｍｅ　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｒｏｐ　ｐｌａｎｔｓ　ｕｓｉｎｇ　ａ　ＣＲＩＳＰＲ—Ｃａｓ　ｓｙｓｔｅｍ．Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏ—　Ｃ２ｏ］　Ｓｈａｎ　Ｑ　Ｗ，Ｗａｎｇ　Ｙ　Ｐ，Ｌｉｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，３１（８）：６８６—６８８．　　Ｌ　Ｓ，Ｌａｒｓｏｎ　Ｍ　Ｈ，Ｇｉｌｂｅｒｔ　Ｉ　Ａ，Ｄｏｕｄｎａ　Ｊ　Ａ，Ｗｅｉｓｓｍａｎ　Ｊ　Ｓ，Ａｒｋｉｎ　Ａ，¨ｍ　Ｗ　Ａ．Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ　ＣＲＩＳＰＲ　ａｓ　ａｎ　ＲＮＡ—ｇｕｉｄｅｄ　Ｅ２１］　Ｑｉｐｌａｔｆｏｒｍ　ｆｏｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｃｅｌｌ，２０１３，１５２：１１７３—１１８３．　ｖｅ　ｉｍｍｕｎｅ　ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１１，１４（３）：３２１—３２７．　Ｅ２２］　Ｔｅｒｎｓ　Ｍ　Ｐ，Ｔｅｒｎｓ　Ｒ　Ｍ．ＣＲＩＳＰＲ—ｂａｓｅｄ　ａｄａｐｔｉｎｇ：Ｔｈｅ　ｎｅｗ　ｆｒｏｎｔｉｅｒ　ｏｆ　ｇｅｎｏｍｅ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｗｉｔｈ　ＣＲＩＳＰＲ—Ｃａｓ９．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１４，３４６：　［２３］　Ｄｏｕｄｎａ　Ｊ　Ａ，Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ　Ｅ．Ｇｅｎｏｍｅ　ｅｄｉｔｉ１２５８０９６．　ｅｄｅｎｈｅｆｔ　Ｂ，Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ　Ｓ　Ｈ，Ｄｏｕｄｎａ　Ｊ　Ａ．ＲＮＡ—ｇｕｉｄｅｄ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍｓ　ｉｎ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ａｎｄ　ａｒｃｈａｅａ．Ｎａｔｕｒｅ，２０　１　２，４８２：　Ｅ２４］　Ｗｉ３３１—３３８．　　ｆｏｒ　ｅｄｉｔｉｎｇ　ｐｌａｎｔ　ｇｅｎｏｍｅｓ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１６，２５（５）：　［２５］　Ｓａｍａｎｔａ　Ｍ　Ｋ，Ｄｅｙ　Ａ，Ｇａｙｅｎ　Ｓ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９：Ａｎ　ａｄｖａｎｃｅｄ　ｔｏｏｌ５６１—５７３．　［２６］　Ｈｏｒｖａｔｈ　Ｐ，Ｂａｒｒａｎｇｏｕ　Ｒ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ，ｔｈｅ　ｉｍｍｕｎｅ　ｓｙｓｔｅｍ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ａｎｄ　ａｒｃｈａｅａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１０，３２７：１６７—１７０．　［２７］　Ｈｓｕ　Ｐ　Ｄ，Ｌａｎｄｅｒ　Ｅ　Ｓ，Ｚｈａｎｇ　Ｆ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ＣＲＩＳＰＲ—Ｃａｓ９　ｆｏｒ　ｇｅｎｏｍｅ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｃｅｌｌ，２０１４，１５７（６）：　ｌ２６２一ｌ２７８．　　Ｗ，Ｔｅｎｇ　Ｆ，Ｌｉ　Ｔ，Ｚｈｏｕ　Ｑ．Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｇｅｒｍｌｉｎｅ　ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｇｅｎｅ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｒａｔ　ｕｓｉｎｇ　［２８］　ＬｉＣＲＩＳＰＲ—Ｃａｓ　ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，３１（８）：６８４—６８６．　ｖａｌｉｌａ　Ｃ　Ｓ，Ｄａｗｌａｔｙ　Ｍ　Ｍ，Ｃｈｅｎｇ　Ａ　Ｗ，Ｚｈａｎｇ　Ｆ，Ｊａｅｎｉｓｃｈ　Ｒ．Ｏｎｅ—ｓｔｅｐ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｉｃｅ　ｃａｒｒｙｉｎｇ　ｍｕｔａ—　［２９］　Ｗａｎｇ　Ｈ，Ｙａｎｇ　Ｈ，Ｓｈｉｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｇｅｎｅｓ　ｂｙ　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ—Ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｇｅｎｏｍｅ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｃｅｌｌ，２０１３，１５３（４）：９１０～９１８．　［３Ｏ］　Ｊｉａｎｇ　Ｗ　Ｙ，Ｂｉｋａｒｄ　Ｄ，Ｃｏｘ　Ｄ，Ｚｈａｎｇ　Ｆ，Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ　Ｉ　Ａ．ＲＮＡ—ｇｕｉｄｅｄ　ｅｄｉｔｉｎｇ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｇｅｎｏｍｅｓ　ｕｓｉｎｇ　ＣＲＩＳＰＲ—Ｃａｓ　ｓｙｓｔｅｍｓ．　Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，３１（３）：２３３—２３９．　　Ｊ　Ｆ，Ｎｏｒｖｉｌｌｅ　Ｊ　Ｅ，Ａａｃｈ　Ｊ，ＭｃＣｏｒｍａｃｋ　Ｍ，Ｚｈａｎｇ　Ｄ　Ｄ，Ｂｕｓｈ　Ｊ，Ｃｈｕｒｃｈ　Ｇ　Ｍ，Ｓｈｅｅｎ　Ｊ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　ａｎｄ　ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａ—　Ｅ３１］　Ｌｉｔｉｏｎ—ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｇｅｎｏｍｅ　ｅｄｉｔｉｎｇ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ａｎｄ　Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ　ｕｓｉｎｇ　ｇｕｉｄｅ　ＲＮＡ　ａｎｄ　Ｃａｓ９．Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ１ｏｇｙ，　２０１３，３：６８８—６９１．　［３２］　Ｙａｎｇ　Ｈ，Ｗａｎｇ　Ｈ，Ｓｈｉｖａｌｉｌａ　Ｃ　Ｓ，Ｃｈｅｎｇ　Ａ　Ｗ，Ｓｈｉ　Ｉ　，Ｊａｅｎｉｓｃｈ　Ｒ．Ｏｎｅ—ｓｔｅｐ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｉｃｅ　ｃａｒｒｙｉｎｇ　ｒｅｐｏｒｔｅｒ　ａｎｄ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ　ａｌｌｅｌｅｓ　ｂｙ　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ—ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｇｅｎｏｍｅ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｃｅｌｌ，２０１３，１５４（６）：１３７０—１３７９．　［３３］Ｚｈｏｕ　Ｈ　Ｂ，Ｌｉｕ　Ｂ，Ｗｅｅｋｓ　Ｄ　Ｐ，Ｓｐａｌｄｉｎｇ　Ｍ　Ｈ，Ｙａｎｇ　Ｂ．Ｌａｒｇｅ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ　ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　ｈｅｒｉｔａｂｌｅ　ｓｍａｌｌ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９　ｉｎ　ｒｉｃｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１４，４２（１７）：１０９０３—１０９１４．　Ｅ３４］Ｓｈａｌｅｍ　Ｏ，Ｓａｎｊａｎａ　Ｎ　Ｅ，Ｈａｒｔｅｎｉａｎ　Ｅ，Ｓｈｉ　Ｘ，Ｓｃｏｔｔ　Ｄ　Ａ，Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ　Ｔ　Ｓ，Ｈｅｃｋｌ　Ｄ，Ｅｂｅｒｔ　Ｂ　Ｉ　，Ｒｏｏｔ　Ｄ　Ｅ，Ｄｏｅｎｃｈ　Ｊ　Ｇ，Ｚｈａｎｇ　Ｆ．　ｈｔｔｐ：／／ｃｙｋｘ．１ｚｕ。ｅｄｕ．ｃｎ　ｌ２１２　草业科学　第３４卷　Ｇｅｎｏｍｅ—ｓｃａｌｅ　ＣＲＩＳＰＲ—Ｃａｓ９　ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２Ｏ１４，３４３：８４—８７．　ａｎｇ　Ｗ，Ｂｉｋａｒｄ　Ｄ，Ｃｏｘ　Ｄ，Ｚｈａｎｇ　Ｆ，Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ　Ｉ　Ａ．ＲＮＡ—ｇｕｉｄｅｄ　ｅｄｉｔｉｎｇ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｇｅｎｏｍｅｓ　ｕｓｉｎｇ　ＣＲＩＳＰＲ—Ｃａｓ　ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｎａ　［３５］　Ｊｉｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，３１（３）：２３３—２３９．　［３６］　Ｊｉａｎｇ　Ｙ，Ｃｈｅｎ　Ｂ，Ｄｕａｎ　Ｃ，Ｓｕｎ　Ｂ　Ｂ，ｒａｎｇ　Ｊ　Ｊ，ｒａｎｇ　Ｓ．Ｍｕｈｉｇｅｎｅ　ｅｄｉｔｉｎｇ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｇｅｎｏｍｅ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ＣＲＩＳＰＲ　Ｃａｓ９　ｓｙｓｔｅｍ．Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１５，８１（７）：２５０６—２５１４．　Ｅ３７］　Ｄｉｃａｒｌｏ　Ｊ　Ｅ，Ｎｏｒｖｉｌｌｅ　Ｊ　Ｅ，Ｍａｌｌ　Ｐ，Ｒｉｏｓ　Ｘ，Ａａｃｈ　Ｊ，Ｃｈｕｒｃｈ　Ｇ　Ｍ．Ｇｅｎｏｍｅ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｉｎ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ｕｓｉｎｇ　ＣＲＩＳＰＲ—Ｃａｓ　ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１３，４１（７）：４３３６—４３４３．　ｊｋｅｒｅｎ　Ｊ　Ｐ，Ｂｒｉｔｔｏｎ　Ｒ　Ａ．Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　ｇｅｎｏｍｅ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｉｎ　ｌａｃｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ，２０１４，１３（１）：１—１０．　［３８］　Ｐｉ　Ｔ，Ｄｅｎｇ　Ｗ，Ｔｓａｏ　Ｓ　Ｗ，Ｃｈｅｎ　Ｈ　Ｉ　，Ｋｏｋ　Ｋ　Ｈ，Ｊｉｎ　Ｄ　Ｙ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａ　９　［３９］　Ｙｕｅｎ　Ｋ　Ｓ，Ｃｈａｎ　Ｃ　Ｐ，Ｗｏｎｇ　Ｎ　Ｈ，Ｈｏ　Ｃ　Ｈ，Ｈｏ　Ｔ　Ｈ，Ｌｅｉｍｅｄｉａｔｅｄ　ｇｅｎｏｍｅ　ｅｄｉｔｉｎｇ　ｏｆ　Ｅｐｓｔｅｉｎ　Ｂａｒｒ　ｖｉｒｕｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｃｅｌｌｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０１５，９６：６２６—６３６．　［４ｏ］　Ｆｒｉｅｄｌａｎｄ　Ａ　Ｅ，Ｔｚｕｒ　Ｙ　Ｂ，Ｅｓｖｅｈ　Ｋ　Ｍ，Ｃｏｌａｉａｃｏｖｏ　Ｍ　Ｐ，Ｃｈｕｒｃｈ　Ｇ　Ｍ，Ｃａｌａｒｅｏ　Ｊ　Ａ．Ｈｅｒｉｔａｂｌｅ　ｇｅｎｏｍｅ　ｅｄｉｔｉｎｇ　ｉｎ　Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ　ｖｉａ　ａ　ＣＲＩＳＰＲ—Ｃａｓ９　ｓｙｓｔｅｍ．Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１３，１０（８）：７４１—７４３．　ｂｂｉｔ　Ｃ，Ｐｏｎｔｉｎｇ　Ｃ　Ｐ，Ｌｉｕ　Ｊ　Ｉ　．Ｈｉｇｈｌｙ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ（　ＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９　ｓｙｓ—　［４１］　Ｂａｓｓｅｔｔ　Ａ　Ｒ，Ｔｉｔｅｒｎ．Ｃｅｌ１　Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１３，４（１）：２２０　２２８．　［４２］　Ｈｗａｎｇ　Ｗ　Ｙ，Ｆｕ　Ｙ　Ｆ，Ｒｅｙｏｎ　Ｄ，Ｍａｅｄｅｒ　Ｍ　Ｉ　，Ｔｓａｉ　Ｓ　Ｑ，Ｓａｎｄｅｒ　Ｊ　Ｄ，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ　Ｒ　Ｔ，Ｙｅｈ　Ｊ　Ｒ　Ｊ，Ｊｏｕｎｇ　Ｊ　Ｋ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｇｅｎｏｍｅ　ｅｄｉ—　ｔｉｎｇ　ｉｎ　ｚｅｂｒａｆｉｓｈ　ｕｓｉｎｇ　ａ　ＣＲＩＳＰＲ　Ｃａｓ　ｓｙｓｔｅｍ．Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，３ｌ（３）：２２７—２２９．　ｓｈ　Ｍ　Ｂ，Ｆｉｓｈｅｒ　Ｍ，（）ｏｍｅｎ—Ｈａｊａｇｏｓ　Ｊ，Ｔｈｏｍｓｅｎ　Ｇ　Ｈ，Ｇｒａｉｎｇｅｒ　Ｒ　Ｍ．Ｓｉｍｐｌｅ　ａｎｄ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９一ｍｅｄｉａ　［４３］　Ｎａｋａｙａｍａ　Ｔ，Ｆｉｔｅｄ　ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｉｎ　Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ．Ｇｅｎｅｓｉｓ，２０１３，５ｌ：８３５—８４３．　［４４］　Ｋｏｉｋｅ—Ｙｕｓａ　Ｈ，Ｌｉ　Ｙ，Ｔａｎ　Ｅ　Ｐ，Ｖｅｌａｓｃｏ—Ｈｅｒｒｅｒａ　Ｍ　Ｄ　Ｃ，Ｙｕｓａ　Ｋ．Ｇｅｎｏｍｅ　ｗｉｄｅ　ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｉｎ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｃｅｌｌｓ　ｗｉｔｈ　ａ　ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ　ＣＲＩＳＰＲ—ｇｕｉｄｅ　ＲＮＡ　ｌｉｂｒａｒｙ．Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎ。ｌｏｇｙ，２０１４，３２：２６７—２７３．　［４５］　Ｓｈａｏ　Ｙ　Ｊ，Ｇｕａｎ　Ｙ　Ｔ，Ｗａｎｇ　１　，Ｑｉｕ　Ｚ　Ｇ，Ｌｉｕ　Ｍ　Ｚ，Ｃｈｅｎ　Ｙ　Ｔ，Ｗｕ　Ｉ　Ｊ，Ｌｉ　Ｙ　Ｍ，Ｍａ　Ｘ　Ｙ，Ｉ　ｉｕ　Ｍ　Ｙ，Ｉ　ｉ　Ｄ　Ｉ　．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ—ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｇｅｎｏｍｅ　ｅｄｉｔｉｎｇ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒａｔ　ｖｉａ　ｄｉｒｅｃｔ　ｉｎｉｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｏｎｅ—ｃｅｌｌ　ｅｍｂｒｙｏｓ．Ｎａｔｕｒｅ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２０１４，９（１０）：２４９３　２５１　２．　　Ｔ，Ｔｅｎｇ　Ｆ，Ｇｕｏ　Ｒ，Ｌｉ　Ｗ，Ｚｈｏｕ　Ｑ．（）ｎｅ—ｓｔｅｐ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｐｉｇｓ　ｂｙ　ｚｙｇｏｔｅ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ　ｓｙｓｔｅｍ．Ｃｅｌｌ　［４６］　ＨａｌＲｅｓｅａｒｃｈ，２０１４，２４：３７２—３７５．　［４７］　Ｈａｎ　Ｈ　Ｂ，Ｍａ　Ｙ　Ｈ，Ｗａｎｇ　Ｔ，Ｉ　ｉａｎ　Ｉ　，Ｔｉａｎ　Ｘ　Ｚ，Ｈｕ　Ｒ，Ｄｅｎｇ　Ｓ　Ｉ　，Ｉ　ｉ　Ｋ　Ｐ，Ｗａｎｇ　Ｆ，Ｌｉ　Ｎ，Ｉ　ｉｕ　Ｇ　Ｓ，Ｚｈａｏ　Ｙ　Ｆ，Ｉ　ｉａｎ　Ｚ　Ｇ．（）ｎｅ—ｓｔｅｐ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｙｏｓｔａｔｉｎ　ｇｅｎｅ　ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｓｈｅｅｐ　ｖｉａ　ｔｈｅ　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９　ｓｙｓｔｅｍ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｈｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，　２Ｏ１４，１（１）：２　５．　ｌｂｅｒｔ　ｌ　Ａ，Ｃｉｍｉｎｉ　Ｂ　Ａ，Ｓｃｈｎｉｔｚｂａｕｅｒ　Ｊ，Ｚｈａｎｇ　Ｗ，Ｌｉ　Ｇ　Ｗ，Ｐａｒｋ　Ｊ，Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ　Ｅ　Ｈ，Ｗｅｉｓｓｍａｎ　Ｊ　Ｓ，Ｏｉ　Ｉ　Ｓ，Ｈｕａｎｇ　Ｂ．　［４８］　Ｃｈｅｎ　Ｂ，ＧｉＤｙｎａｍｉｃ　ｉｍａｇｉｎｇ　ｏｆ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ｌｏｃｉ　ｉｎ　ｌｉｖｉｎｇ　ｈｕｍａｎ　ｃｅｌｌｓ　ｂｙ　ａｎ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ　ｓｙｓｔｅｍ．（；ｅｌｌ，２０１　３，１５５：１４７９　１４９１．　［４９］　Ｙａｎ　Ｑ　Ｍ，Ｚｈａｎｇ　Ｑ　Ｊ，ｒａｎｇ　Ｈ　Ｑ，Ｚｏｕ　Ｑ　Ｊ，Ｔａｎｇ　Ｃ　Ｃ，Ｆａｎ　Ｎ　Ｎ，Ｌａｉ　１　Ｇ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｕｌｔｉ　ｇｅｎｅ　ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｒａｂｂｉｔｓ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ　ｓｙｓｔｅｍ．Ｃｅｌｌ　Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，２０１４，３（１）：１２．　ｕ　Ｙ　Ｙ，Ｓｈｅｎ　Ｂ，Ｃｕｉ　Ｙ　Ｑ，Ｃｈｅｎ　Ｙ　Ｃ，Ｗａｎｇ　Ｊ　Ｙ，Ｗａｎｇ　１　，Ｋａｎｇ　Ｙ，Ｚｈａｏ　Ｘ　Ｙ，Ｓｉ　Ｗ，Ｉ　ｉ　Ｗ，Ｘｉａｎｇ　Ａ　Ｐ，Ｚｈｏｕ　Ｚ　Ｍ，Ｌｉ　Ｆ　Ｑ，Ｔａｎ　［５Ｏ］　ＬｉＴ，Ｐｕ　Ｘ　Ｑ，Ｗａｎｇ　Ｆ，Ｊｉ　Ｓ　Ｈ，Ｚｈｏｕ　Ｑ，Ｈｕａｎｇ　Ｘ　Ｘ，ｊｉ　Ｗ　Ｚ，Ｓｈａ　Ｊ　Ｈ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｎｅ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ　ｍｏｎｋｅｙ　ｖｉａ　Ｃａ￣９／　ＲＮＡ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｇｅｎｅ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｉｎ　ｏｎｅ—ｃｅｌｌ　ｅｍｂｒｙｏｓ．Ｃｅｌｌ，２０１４，１５６：８３６—８４３．　ｇｈａｍ　Ｍ　Ｄ，Ｔｒｅｖｉｎｏ　Ａ　Ｅ，Ｊｏｕｎｇ　Ｊ，Ａｂｕｄａｙｙｅｈ　Ｏ　Ｏ，Ｂａｒｃｅｎａ　Ｃ，Ｈｓｕ　Ｐ　Ｄ，Ｈａｂｉｂ　Ｎ，Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ　Ｊ　Ｓ，Ｎｉｓｈｉｍａ　［５１］　Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ　Ｓ，Ｂｒｉｓｕ　Ｈ，Ｎｕｒｅｋｉ　Ｏ，Ｚｈａｎｇ　Ｆ．Ｇｅｎｏｍｅ—ｓｃａｌｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｂｙ　ａｎ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ　ＣＲＩＳＰＲ—Ｃａｓ９　ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｎａｔｕｒｅ，２０１４，５１　７：　５８３　５８８．　ａｔｔ　Ｒ　Ｊ，Ｃｈｅｎ　Ｓ　Ｄ，Ｚｈｏｕ　Ｙ，Ｙｉｍ　Ｍ　Ｊ，Ｓｗｉｅｃｈ　Ｉ　，Ｋｅｍｐｔｏｎ　Ｈ　Ｒ，Ｄａｈｌｍａｎ　Ｊ　Ｅ，Ｐａｒｎａｓ　Ｏ，Ｅｉｓｅｎｈａｕｒｅ　Ｔ　Ｍ，Ｊｏｖａｎｏｖｉｃ　Ｍ，Ｇｒａ—　［５２２　Ｐｌｈａｍ　Ｄ　Ｂ，Ｊｈｕｎｊｈｕｎｗａｌａ　Ｓ，Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ　Ｍ，Ｘａｖｉｅｒ　Ｒ　Ｊ，Ｉ　ａｎｇｅｒ　Ｒ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ　Ｄ　Ｇ，Ｈａｃｏｈｅｎ　Ｎ，Ｒｅｇｅｖ　Ａ，Ｆｅｎｇ　Ｇ　Ｐ，Ｓｈａｒｐ　Ｐ　Ａ，　Ｚｈａｎｇ　Ｆ．ＣＲＩＳＰＲ—Ｃａｓ９　ｋｎｏｃｋｉｎ　ｍｉｃｅ　ｆｏｒ　ｇｅｎｏｍｅ　ｅｄｉｔｉｎｇ　ａｎｄ　ｃａｎｃｅｒ　ｍｏｄｅｌｉｎｇ．Ｃｅｌｌ，２０１４，１５９（２）：４４０—４５５．　　Ｄ，Ｋｗａｒｔ　Ｄ，Ｃｈｅｎ　Ａ，Ｓｐｒｏｕｌ　Ａ，Ｊａｃｏｂ　Ｓ，Ｔｅｏ　Ｓ，Ｏｌｓｅｎ　Ｋ　Ｍ，Ｇｒｅｇｇ　Ａ，Ｎｏｇｇｌｅ　Ｓ，Ｔｅｓｓｉｅｒ　Ｉ　ａｖｉｇｎｅ　Ｍａｒｃ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｉｎｔｒｏ—　［５３］　Ｐａｑｕｅｔｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ　ａｎｄ　ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｕｓｉｎｇ　ＣＲＩＳＰＲ／（　ａｓ９．Ｎａｔｕｒｅ，２０１６，５３３：１　２５．　［５４］　Ｙｉｎ　Ｈ，Ｘｕｅ　Ｗ，Ｃｈｅｎ　Ｓ　Ｄ，Ｂｏｇｏｒａｄ　Ｒ　Ｉ　，Ｂｅｎｅｄｅｔｔｉ　Ｅ，Ｇｒｏｍｐｅ　Ｍ，Ｋｏｔｅｌｉａｎｓｋｙ　Ｖ，Ｓｈａｒｐ　Ｐ　Ａ，Ｊａｃｋｓ　Ｔ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ　Ｄ　Ｇ．Ｇｅｎｏｍｅ　ｅｄｉｔｉｎｇ　ｗｉｔｈ　Ｃａｓ９　ｉｎ　ａｄｕｌｔ　ｍｉｃｅ　ｃｏｒｒｅｃｔｓ　ａ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．Ｎａｔｕｒｅ　Ｂ　ｏｔｅｃｈｎ０１ｏｇｙ，２０１４，３２（６）：５５１—５５３．　ｌｉ　Ｖ，Ｄｅｋｋｅｒｓ　Ｊ　Ｆ，Ｈｅｏ　Ｉ，Ｄｅｍｉｒｃａｎ　Ｔ，Ｓａｓａｋｉ　Ｎ，Ｂｏｙｍａｎｓ　Ｓ，Ｃｕｐｐｅｎ　Ｅ，Ｅｎｔ　Ｃ　Ｋ，Ｎｉｅｕｗｅｎｈｕｉｓ　Ｅ　Ｅ　［５５］　Ｓｃｈｗａｎｋ　Ｇ，Ｋｏｏ　Ｂ　Ｋ，ＳａｓｓｅｌＳ，Ｂｅｅｋｍａｎ　Ｊ　Ｍ，Ｃｌｅｖｅｒｓ　Ｈ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｒｅｐａｉｒ　ｏｆ　ＣＦＴＲ　ｂｙ　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９　ｉｎ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｏｒｇａｎｏｉｄｓ　ｏｆ　ｃｙｓｔｉｃ　ｆｉｂｒｏｓｉｓ　ｐａ—　ｈｔｔｐ：／／ｃｙｋｘ．１ｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ　第６期　王丹　等：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９基因组编辑技术及其在草类植物中的应用　１２１３　ｔｉｅｎｔｓ．Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　ＣｅｌＩ，２０ｌ３，１３（６）：６５３—６５８．　ｎ　Ｈ，Ｔａｍｍｅｌａ　Ｔ，Ｐａｐａｇｉａｎｎａｋｏｐｏｕｌｏｓ　Ｔ，Ｊｏｓｈｉ　Ｎ　Ｓ，Ｃａｉ　Ｗ　Ｘ，Ｙａｎｇ　Ｇ，Ｂｒｏｎｓｏｎ　Ｒ，Ｃｒｏｗｌｅｙ　Ｄ　Ｇ，Ｚｈａｎｇ　Ｅ５６］　Ｘｕｅ　Ｗ，Ｃｈｅｎ　Ｓ　Ｄ，ＹｉＦ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ　Ｄ　Ｇ，Ｓｈａｒｐ　Ｐ　Ａ，Ｊａｃｋｓ　Ｔ．ＣＲＩＳＰＲ—ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｄｉｒｅｃｔ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｎｃｅｒ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｍｏｕｓｅ　ｌｉｖｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ，２０１４，５１４：　３８Ｏ一３８４．　　Ｄ　Ｇ　Ｋａｂａｄｉ　Ａ　Ｍ，Ｔｈａｋｏｒｅ　Ｐ　Ｉ，Ｍａｊｏｒｏｓ　Ｗ　Ｈ，Ｒｅｄｄｙ　Ｔ　Ｅ，Ｇｅｒｓｂａｃｈ　Ｃ　Ａ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９一ｂａｓｅｄ　ｇｅｎｏｍｅ　［５７］　Ｏｕｓｔｅｒｏｕｔｅｄｉｔｉｎｇ　ｆｏｒ　ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｔｈａｔ　ｃａｕｓｅ　ｄｕｃｈｅｎｎｅ　ｍｕｓｃｕｌａｒ　ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｎａｔｕｒｅ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２０１５，６：６２４４．　ａｚ　Ａ，Ｍａｒｌｅｔｔ　Ｊ，Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｙ，Ｌｉ　Ｍ，Ｓｕｚｕｋｉ　Ｋ，Ｘｕ　Ｒ，Ｈｉｓｈｉｄａ　Ｔ，Ｃｈａｎｇ　Ｃ　Ｊ，Ｅｓｔｅｂａｎ　Ｃ　Ｒ，Ｙｏｕｎｇ　Ｊ，Ｂｅｌｍｏｎ　［５８］　Ｌｉａｏ　Ｈ　Ｋ，Ｇｕ　Ｙ，Ｄｉｔｅ　Ｊ　Ｃ　Ｉ　．Ｕｓｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９　ｓｙｓｔｅｍ　ａｓ　ａｎ　ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｄｅｆｅｎｓｅ　ａｇａｉｎｓｔ　ＨＩＶ一１　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ　Ｃｏｍｍｕｎｉ—　ｃａｔｉｏｎｓ，２０１５，６：６４１３．　［５９］　Ｂｉｋａｒｄ　Ｄ，Ｅｕｌｅｒ　Ｃ　Ｗ，Ｊ　ｉａｎｇ　Ｗ　Ｙ，Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ　Ｐ　Ｍ，Ｇｏｌｄｂｅｒｇ　Ｇ　Ｗ，Ｄｕｐｏｒｔｅｔ　Ｘ，Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉ　Ｖ　Ａ，Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ　Ｌ　Ａ．Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ　ＣＲＩＳＰＲ—Ｃａｓ　ｎｕｃｌｅａｓｅｓ　ｔｏ　ｐｒｏｄｕｃｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ—ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１４，３２（１１）：１１４６—１１５０．　ａｎｇ　Ｗ，Ｙａｎｇ　Ｂ，Ｗｅｅｋｓ　Ｄ　Ｐ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９一ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｇｅｎｅ　ｅｄｉｔｉｎｇ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ　ａｎｄ　ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ　ｏｆ　ｍｏｄｉ—　［６Ｏ］　Ｊｉｌｅｄ　ｇｅｎｅｓ　ｉｆｎ　ｔｈｅ　Ｔ２　ａｎｄ　Ｔ３　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ．ＰｌｏＳ　Ｏｎｅ，２０１４，９（６）：ｅ９９２２５．　［６１］　Ｓｃｈｉｍｌ　Ｓ，Ｆａｕｓｅｒ　Ｆ，Ｐｕｃｈｔａ　Ｈ．Ｔｈｅ　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ　ｓｙｓｔｅｍ　ｃａｎ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ｎｕｃｌｅａｓｅ　ｆｏｒ　ｉｎ　ｐｌａｎｔａ　ｇｅｎｅ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ａｎｄ　ａｓ　ｐａｉｒｅｄ　ｎｉｃｋ—　ａｓｅｓ　ｆｏｒ　ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ　ｉｎ　ｈｅｒｉｔａｂｌｅ　ｐｒｏｇｅｎｙ．Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｊｏｕｒｎａｌ，２０１４，８０（６）：１１３９—１１５０．　　Ｐ　Ｌ，Ｙａｎｇ　Ｄ　Ｉ　，Ｗａｎｇ　Ｚ，Ｚｈａｎｇ　Ｚ　Ｊ，Ｚｈｅｎｇ　Ｒ，Ｙａｎｇ　Ｌ，Ｚｅｎｇ　Ｉ　，Ｉ　ｉｕ　Ｘ　Ｄ，Ｚｈｕ　Ｊ　Ｋ．　［６２］　Ｆｅｎｇ　Ｚ　Ｙ，Ｍａｏ　Ｙ　Ｆ，Ｘｕ　Ｎ　Ｆ，Ｚｈａｎｇ　Ｂ　Ｔ，ＷｅｉＭｕｌｔｉｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｒｅｖｅａｌｓ　ｔｈｅ　ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ，ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，ａｎｄ　ｐａｔｔｅｒｎｓ　ｏｆ　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ—ｉｎｄｕｃｅｄ　ｇｅｎｅ　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　Ａｒａｂｉ—　ｄｏｐｓｉｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０１４，１１１（１２）：４６３２—４６３７．　［６３］　Ｆａｕｓｅｒ　Ｆ，Ｓｃｈｉｍｌ　Ｓ，Ｐｕｃｈｔａ　Ｈ．Ｂｏｔｈ　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ—ｂａｓｅｄ　ｎｕｃｌｅａｓｅｓ　ａｎｄ　ｎｉｃｋａｓｅｓ　ｃａｎ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ　ｆｏｒ　ｇｅｎｏｍｅ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ．Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｊｏｕｒｎａｌ，２０ｌ４，７９（２）：３４８　３５９．　［６４］　Ｗａｎｇ　Ｚ　Ｐ，Ｘｉｎｇ　Ｈ　Ｉ　，Ｄｏｎｇ　Ｌ，Ｚｈａｎｇ　Ｈ　Ｙ，Ｈａｎ　Ｃ　Ｙ，Ｗａｎｇ　Ｘ　Ｃ，Ｃｈｅｎ　Ｑ　Ｊ．Ｅｇｇ　ｃｅｌｌ—ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ—ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ　ｇｅｎｅｒａｔｅｓ　ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ　ｍｕｔａｎｔｓ　ｆｏｒ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｔａｒｇｅｔ　ｇｅｎｅ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｉｎ　ａ　ｓｉｎｇｌｅ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｇｅｎｏｍｅ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　２０１５，１６：１４４．　［６５］　Ｎｅｋｒａｓｏｖ　Ｖ，Ｓｔａｓｋａｗｉｃｚ　Ｂ，Ｗｅｉｇｅｌ　Ｄ，Ｊｏｎｅｓ　Ｊ　Ｄ　Ｇ，Ｋａｍｏｕｎ　Ｓ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｍｏｄｅｌ　ｐｌａｎｔ　ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ　ｕｓｉｎｇ　Ｃａｓ９　ＲＮＡ—ｇｕｉｄｅｄ　ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，３１：６９１—６９３．　［６６］　Ｇａｏ　Ｊ　Ｐ，Ｗａｎｇ　Ｇ　Ｈ，Ｍａ　Ｓ　Ｙ，Ｘｉｅ　Ｘ　Ｄ，Ｗｕ　Ｘ　Ｗ，Ｚｈａｎｇ　Ｘ　Ｔ，ｗｕ　Ｙ　Ｑ，Ｚｈａｏ　Ｐ，Ｘｉａ　Ｑ　Ｙ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９一ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｔａｒｇｅｔｅｄ　ＩｌｌＵ—　ｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｉｎ　Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ．Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１５，８７（１）：９９—１１Ｏ．　［６７］　Ｙｉｎ　Ｋ　Ｑ，Ｈａｎ　Ｔ，Ｌｉｕ　Ｇ，Ｃｈｅｎ　Ｔ　Ｙ，Ｗａｎｇ　Ｙ，Ｙｕ　Ａ　Ｙ，Ｌｉｕ　Ｙ．Ａ　ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓ—ｂａｓｅｄ　ｇｕｉｄｅ　ＲＮＡ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ＣＲＩＳＰＲ／　Ｃａｓ９　ｒｎ’ｅｄｉａｔｅｄ　ｐｌａｎｔ　ｇｅｎｏｍｅ　ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１５，５：１４９２６．　［６８２　Ｆｅｎｇ　Ｚ　Ｙ，Ｚｈａｎｇ　Ｂ　Ｔ，Ｄｉｎｇ　Ｗ　Ｎ，Ｌｉｕ　Ｘ　Ｄ，Ｙａｎｇ　Ｄ　Ｉ　，Ｗｅｉ　Ｐ　Ｌ，Ｃａｏ　Ｆ　Ｑ，Ｚｈｕ　Ｓ　Ｈ，Ｚｈａｎｇ　Ｆ，Ｍａｏ　Ｙ　Ｆ，Ｚｈｕ　Ｊ，Ｋ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｇｅ—　ｎｏｍｅ　ｅｄｉｔｉｎｇ　ｉｎ　ｐｌａｎｔｓ　ｕｓｉｎｇ　ａ　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ　ｓｙｓｔｅｍ．Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１３，２３（１０）：１２２９－１２３２．　　Ｍ，Ｔｏｋｉ　Ｓ．Ｍｕｌｔｉｇｅｎｅ　ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ　ｏｆｆｔａｒｇｅｔ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９　ｓｙｓｔｅｍ　ｉｎ　ｒｉｃｅ．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　［６９］　Ｅｎｄｏ　Ｍ，ＭｉｋａｍｉＰｈｙｓｉｏｌｏｙ，２０１５，５６（１）：４１　４７．　［７Ｏ］　Ｚｈａｎｇ　Ｈ，Ｚｈａｎｇ　Ｊ　Ｓ，Ｗｅｉ　Ｐ　Ｉ　，Ｚｈａｎｇ　Ｂ　Ｔ，Ｇｏｕ　Ｆ，Ｆｅｎｇ　Ｚ　Ｙ，Ｍａｏ　Ｙ　Ｆ，Ｙａｎｇ　Ｌ，Ｚｈａｎｇ　Ｈ，Ｘｕ　Ｎ　Ｆ，Ｚｈｕ　Ｊ　Ｋ．Ｔｈｅ　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９　ｓｙｓｔｅｍ　ｐｒｏｄｕｃｅｓ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｎｄ　ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ　ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｇｅｎｅ　ｅｄｉｔｉｎｇ　ｉｎ　ｒｉｃｅ　ｉｎ　ｏｎｅ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｊｏｕｒｎａｌ，２０　１　４，　１２（６）：７９７—８０７．　［７１］　Ｘｕ　Ｒ　Ｆ，Ｉ　ｉ　Ｈ，Ｑｉｎ　Ｒ　Ｙ，Ｗａｎｇ　Ｌ，Ｌｉ　Ｉ　，Ｗｅｉ　Ｐ　Ｃ，Ｙａｎｇ　Ｊ　Ｂ．Ｇｅｎｅ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ～ｍｅｄｉａｔｅｄ　ＣＲＩＳＰＲ—Ｃａｓ　ｓｙｓｔｅｍ　ｉｎ　ｒｉｃｅ．Ｒｉｃｅ，２０１４，７（１）：５－８．　［７２］　Ｘｉｅ　Ｋ，Ｙａｎｇ　Ｙ．ＲＮＡ　ｇｕｉｄｅｄ　ｇｅｎｏｍｅ　ｅｄｉｔｉｎｇ　ｉｎ　ｐｌａｎｔｓ　ｕｓｉｎｇ　ａ　ＣＲＩＳＰＲ—Ｃａｓ　ｓｙｓｔｅｍ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｌａｎｔ，２０１３，６（６）：１９７５—１９８３．　［７３］　Ｘｉｅ　Ｋ，Ｍｉｎｋｅｎｂｅｒｇ　Ｂ，Ｙａｎｇ　Ｙ　Ｎ．Ｂｏｏｓｔｉｎｇ　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９　ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　ｅｄｉｔｉｎｇ　ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ　ｔＲＮＡ—ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ＵＳＡ，２０１５，ｌ１２（１１）：３５７０　３５７５．　［７４］　Ｓｈａｎ　Ｑ　Ｗ，Ｗａｎｇ　Ｙ　Ｐ，Ｌｉ　Ｊ，Ｚｈａｎｇ　Ｙ，Ｃｈｅｎ　Ｋ　Ｉ　，Ｉ　ｉａｎｇ　Ｚ，Ｚｈａｎｇ　Ｋ，Ｌｉｕ　Ｊ　Ｘ，Ｊｅｆｆｘｉ　Ｊ　Ｚ，Ｑｉｕ　Ｊ　Ｌ，Ｇａｏ　Ｃ　Ｘ．Ｇｅｎｏｍｅ　ｅｄｉｔｉｎｇ　ｉｎ　ｒｉｃｅ　ａｎｄ　ｗｈｅａｔ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ　ｓｙｓｔｅｍ．Ｎａｔｕｒｅ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２０１４，９（１０）：２３９５—２４１０．　ｏｎａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｔａｇｓ　ｏｆ　ｂｒｅａｄ　ｗｈｅａｔ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉｖｕｍ）ａｎｄ　ａ—　［７５］　Ｓｈａｒｍａ　Ｓ，Ｕｐａｄｈｙａｙ　Ｓ　Ｋ．Ｆｕｎｃｔｉｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＣＲＩＳＰＲ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｓｉｔｅｓ　ｆｏｒ　ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｇｅｎｏｍｅ　ｅｄｉｔｉｎｇ．Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１４，４（１）：１１—２２．　［７６］　Ｗａｎｇ　Ｙ　Ｐ，Ｃｈｅｎｇ　Ｘ，Ｓｈａｎ　Ｑ　Ｗ，Ｚｈａｎｇ　Ｙ，Ｌｉｕ　Ｊ　Ｘ，Ｇａｏ　Ｃ　Ｘ，Ｑｉｕ　Ｊ　Ｌ．Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ　ｅｄｉｔｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｒｅｅ　ｈｏｍｏｅｏａｌｌｅｌｅｓ　ｉｎ　ｈｅｘａｉｐｌｏｉｄ　ｈｔｔｐ：／／ｃｙｋｘ．ｉｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ　１２１４　草业．科学　第３４卷　ｂｒｅａｄ　ｗｈｅａｔ　ｃｏｎｆｅｒｓ　ｈｅｒｉｔａｂｌｅ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｔｏ　ｐｏｗｄｅｒｙ　ｍｉｌｄｅｗＮａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｅｈｎｏｌｏｇｙ，２０１４，３２（９）：９４７—９５１．　［７７３　Ｕｐａｄｈｙａｙ　Ｓ　Ｋ，Ｋｕｍａｒ　Ｊ，Ａｌｏｋ　Ａ，Ｔｕｌｉ　Ｒ．ＲＮＡ　Ｇｕｉｄｅｄ　ｇｅｎｏｍｅ　ｅｄｉｔｉｎｇ　ｆｏｒ　ｔａｒｇｅｔ　ｇｅｎｅ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｗｈｅａｔＧ３：Ｇｅｎｅｓ／（　ｅ　．ｎｏｍｅｓ／Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２Ｏ１３，３：２２３３—２２３８．　ｓ　ｉｎ　Ｚｅａ　ｍａｙｓ　ｕｓｉｎｇ　ＴＡＩ　ＥＮｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ　ｓｙｓｔｅｍＪｏｕｒ　［７８］　Ｌｉａｎｇ　Ｚ，Ｚｈａｎｇ　Ｋ，Ｃｈｅｎ　Ｋ　Ｉ　，Ｏａｏ　Ｃ　Ｘ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉ．ｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１４，４１（２）：６３—６８．　Ｅ７９］Ｘｉｎｇ　Ｈ　Ｉ　，Ｄｏｎｇ　Ｌ，Ｗａｎｇ　Ｚ　Ｐ，Ｚｈａｎｇ　Ｈ　Ｙ，Ｈａｎ　Ｃ　Ｙ，Ｌｉｕ　Ｂ，Ｗａｎｇ　Ｘ　Ｃ，Ｃｈｅｎ　Ｑ　Ｊ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９　ｔｏｏｌｋｉｔ　ｆｏｒ　ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　ｇｅｎｏＩｎｅ　ｅｄｉｔｉｎｇ　ｉｎ　ｐｌａｎｔｓ．ＢＭＣ　Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１４，１４：３２７．　［８ｏ］　Ｓｕｎ　Ｘ　Ｊ，Ｈｕ　Ｚ，Ｃｈｅｎ　Ｒ，Ｊｉａｎｇ　Ｑ　Ｙ，Ｓｏｎｇ　Ｇ　Ｈ，Ｚｈａｎｇ　Ｈ，Ｘｉ　Ｙ　Ｊ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｉｎ　ｓｏｙｂｅａｎ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ＣＲＩＳＰＲ—Ｃａｓ９　ｓｙｓ—　ｔｅｒｎ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１５，５：１０３４２．　［８１］　Ｊａｃｏｂｓ　Ｔ　Ｂ，Ｌａｆｙｅｅｔｅ　Ｐ　Ｒ，Ｓｃｈｍｉｔｚ　Ｒ　Ｊ，Ｐａｒｒｏｔｔ　Ｗ　Ａ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｇｅｎｏｍｅ　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｓｏｙｂｅａｎ　ｗｉｔｈ　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９．ＢＭＣ　Ｂｉｏ—　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１５，１５：１６－２５．　［８２］　Ｊｉａｎｇ　Ｗ，Ｚｈｏｕ　Ｈ，Ｂｉ　Ｈ，Ｆｒｏｍｍ　Ｍ，Ｙａｎｇ　Ｂ，Ｗｅｅｋｓ　Ｄ　Ｐ．Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ—ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｇｅｎｅ　ｍｏｄ　ｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ，ｔｏｂａｃｃｏ，ｓｏｒｇｈｕｍ　ａｎｄ　ｒｉｃｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１３，４１（２０）：ｅ１８８．　ｏｎｇ　Ｘ　Ｙ，Ｍｅｎｇ　Ｆ　Ｒ，Ｃｕｉ　Ｘ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｉｎ　ｐｏｔａｔｏ　ｂｙ　ｔｈｅ　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９　［８３］　Ｗａｎｇ　Ｓ　Ｈ，Ｚｈａｎｇ　Ｓ　Ｂ，Ｗａｎｇ　Ｗ　Ｘ，Ｘｉｓｙｓｔｅｍ．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔ，２０１５，３４（９）：１４７３—１４７６．　　Ｃ，Ｎｅｋｒａｓｏｖ　Ｖ，Ｌｉｐｐｍａｎ　Ｚ　Ｂ，Ｅｃｋ　Ｊ　Ｖ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｇｅｎｅ　ｅｄｉｔｉｎｇ　ｉｎ　ｔｏｍａｔｏ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｆｉｒｓｔ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ　ｒｅｇｕ—　［８４］　Ｂｒｏｏｋｓｌａｒｌｙ　ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ　ｓｈｏｒｔ　ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ　ｒｅｐｅａｔｓ／ＣＲＩＳＰＲ—ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　９　ｓｙｓｔｅｍ．Ｐｌａｎｔ　ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０１４，１６６（３）：１２９２—１２９７．　［８５］　Ｊｉａ　Ｈ，Ｗａｎｇ　Ｎ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｇｅｎｏｍｅ　ｅｄｉｔｉｎｇ　ｏｆ　ｓｗｅｅｔ　ｏｒａｎｇｅ　ｕｓｉｎｇ　Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ．ＰＩ　ｏＳ　Ｏｎｅ，２０１４，９（４）：ｅ９３８０６．　［８６］　刘婷婷，范迪，冉玲玉，姜渊忠，刘瑞，罗克明．应用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技术在杨树中高效敲除多个靶基因．遗传．２０１５，３（１０）：１０４４—　１０５２．　Ｉ　ｉｕ　Ｔ　Ｔ，Ｆａｎ　Ｄ，Ｒａｎ　ＬＹ，Ｊｉａｎｇ　Ｙ　Ｚ，Ｌｉｕ　Ｒ，Ｌｕｏ　Ｋ　Ｍ．Ｈｉｇｈｌｙ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９一ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｆ　ｍｕｌｔｉ—　ｐｉｅ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　Ｐｏｐｕｌｕｓ．Ｈｅｒｅｄｉｔａｓ，２０１５，３７（１０）：１０４４—１０５２．（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ）　［８７］　Ｓｕｇａｎｏ　Ｓ　Ｓ，Ｓｈｉｒａｋａｗａ　Ｍ，Ｔａｋａｇｉ　Ｊ，Ｍａｔｓｕｄａ　Ｙ，Ｓｈｉｍａｄａ　Ｔ，Ｈａｒａ—Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ　Ｉ，Ｋｏｈｃｈｉ　Ｔ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９一ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｎｍｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｌｉｖｅｒｗｏｒｔ　Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ　Ｌ．Ｐｌａｎｔ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０１４，５５（３）：４５７—４８１．　［８８］　Ｗａｎｇ　Ｉ　Ｘ，Ｗａｎｇ　Ｌ　Ｉ　，Ｔａｎ　Ｑ，Ｆａｎ　Ｑ　Ｉ　，Ｚｈｕ　Ｈ，Ｈｏｎｇ　Ｚ　Ｉ　，Ｚｈａｎｇ　Ｚ　Ｍ，Ｄｕａｎｍｕ　Ｄ　Ｑ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｙｍｂｉｏｔｉｃ　ｎｉｔｒｏ　ｇｅｎ　ｆｉｘａｔｉｏｎ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　Ｌｏｔｕｓ　ｊａｐｏｎｉｃａｓ　ｕｓｉｎｇ　ＣＲＩＳＰＲ—Ｃａｓ９．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ　ｉｎ　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１６，ＤＯＩ：１０．３３８９／ｆｐｌｓ．２０１６．　０ｌ３３３．　［８９］　Ｍｉｃｈｎｏ　Ｊ　Ｍ，Ｗａｎｇ　Ｘ　Ｂ，Ｌｉｕ　Ｊ　Ｑ，Ｃｕｒｔｉｎ　Ｓ　Ｊ，Ｋｏｎｏ　Ｔ　Ｊ　Ｙ，Ｓｔｕｐａｒ　Ｒ　Ｍ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｆ　ｓｏｙｂｅａｎ　ａｎｄ　Ｍｅｄｉｃａｇ０　ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ　ｕｓｉｎｇ　ａ　ｎｅｗ　ｗｅｂ—ｔｏｏｌ　ａｎｄ　ａ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｃａｓ９　ｅｎｚｙｍｅ．ＧＭ　Ｃｒｏｐｓ＆Ｆｏｏｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｉｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｔｈｅ　Ｆｏｏｄ　Ｃｈａｉｎ，２０１５，６（４）：２４３—２５２．　［９０］　Ｍｅｎｇ　Ｙ　Ｙ，Ｈｏｕ　Ｙ　Ｉ　，Ｗａｎｇ　Ｈ，Ｊｉ　Ｒ　Ｈ，Ｌｉｕ　Ｂ，Ｗｅｎ　Ｊ　Ｑ，Ｎｉｕ　Ｉ　Ｆ，Ｉ　ｉｎ　Ｈ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｂｙ　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９　ｓｙｓｔｅｍ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｍｏｄｅｌ　ｌｅｇｕｍｅ　Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１７，３６：３７１—３７４．　ｃｈ　Ｖ，Ｆｉｌｌｅｒ　Ｓ，Ｓａｍａｃｈ　Ａ，Ｉ　ｅｖｙ　Ａ　Ａ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｓ　ｏｆ　ＣＲＩＳＰＲ—Ｃａｓ　ｎｕｃｌｅａｓｅｓ　ｃｌｅａｖａｇｅ　ｅｆｆｉｃｉｅｎ．．　［９１］　Ｊｏｈｎｓｏｎ　Ｒ　Ａ，Ｇｕｒｅｖｉｃｙ　ｉｎ　ｐｌａｎｔａ．Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１５，８７：１４３—１５６．　［９２］　Ｌｅｉ　Ｙ，Ｉ　ｕ　Ｉ　，Ｉ　ｉｕ　Ｈ　Ｙ，Ｌｉ　Ｓ，Ｘｉｎｇ　Ｆ，Ｃｈｅｎ　Ｉ　Ｌ．ＣＲＩＳＰＲ—Ｐ：Ａ　ｗｅｂ　ｔｏｏｌ　ｆｏｒ　ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｓｉｎｇｌｅ—ｇｕｉｄｅ　ＲＮＡ　ｄｅｓｉｇｎ　ｏｆ　ＣＲＩＳＰＲ—ｓｙｓ—　ｔｅｍ　ｉｎ　ｐｌａｎｔｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｌａｎｔ，２０１４，７（３）：１４９４—１４９６．　［９３］　Ｚｈａｎｇ　Ｄ　Ｄ，Ｌｉ　Ｚ　Ｘ，Ｉ　ｉ　Ｊ　Ｆ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｇｅｎｅ　ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｐｌａｎｔｓ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｇｅ—　ｎｏｍｉｃｓ，２０ｌ６，４３（５）：２５】一２６２．　（责任编辑王芳）　ｈｔｔｐ：／／ｃｙｋｘ．１ｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ