快速去除冰冻红细胞甘油的方法改进研究

冯娜;兰静;彭鹏;王锦;刘娜;张嫄;赵京文

【摘 要】目的 建立冰冻红细胞快速去甘油的方法.方法 采用三步法快速去除冰冻红细胞中的甘油.通过控制制备时盐水的浓度、作用时间及离心次数,用高浓度盐水大量稀释冰冻红细胞后,离心去除盐水,加入相应体积的生理盐水重悬,来达到快速去除甘油的目的.分别对比了常规法和改良法制备的冰冻解冻去甘油红细胞的血红蛋白含量、游离血红蛋白含量、甘油残留量、白细胞残留量及血细胞比容5个方面的指标.结果 传统去甘油的方法大约需要1h,三步法去甘油大约需要15 min,极大地缩短了时间,提高了效率.对去甘油红细胞进行相关检测,甘油残留量和白细胞残留量符合《全血与成分血质量要求(2012版)》的规定,血红蛋白含量略低于规定.结论 快速解冰冻去甘油方法具有时间短、效率高的优点,但仍需进一步改进和优化以使产品质量全面达到国家标准.%Objective To establish a method to rapidly remove glycerol in frozen red blood cells(RBC).Methods The glycerol in frozen RBC was removed by using three-step method as following:the frozen RBC were diluted by adding salt solution with high

concentration.The salt solution was removed through centrifugation.The RBC were resuspended in normal saline of corresponding volume.Three-step method could acbieve the quick removal of glycerol by controlling tbe concentration salt water and action time.The indexes of hemoglobin,free hemoglobin,glycerol residue,residual white blood cell(WBC) and hematocrit of frozen-deglycerolized RBC were compared between conventional and improved methods.Results The traditional method to remove glycerol needed 1h approximately,while the three step

method only needed 15 mins approximately,greatly shortening the time and improving the efficiency.The related tests for removing glycerol RBC,except hemoglobin content was slightly lower than the \"The quality requirements for whole blood and blood components (2012 edition)\rest of them all meeted the requirements.Conclusion The three-step method has the advantages of short time and high cfficiency.However,it still needs to be further improved and optimized to make the quality of product meet the national standard. 【期刊名称】《现代检验医学杂志》 【年(卷),期】2018(033)002 【总页数】3页(P105-107)

【关键词】去甘油;冰冻红细胞;三步法

【作 者】冯娜;兰静;彭鹏;王锦;刘娜;张嫄;赵京文

【作者单位】陕西省血液中心/西安市中心血站,西安 710061;陕西省血液中心/西安市中心血站,西安 710061;陕西省血液中心/西安市中心血站,西安 710061;陕西省血液中心/西安市中心血站,西安 710061;陕西省血液中心/西安市中心血站,西安 710061;陕西省血液中心/西安市中心血站,西安 710061;陕西省血液中心/西安市中心血站,西安 710061 【正文语种】中 文 【中图分类】R457.12

冰冻红细胞，是指将悬浮红细胞保存于40%的甘油中用以延长红细胞保存时间，通常在-80℃下可保存10年。在血液供应紧张及稀有血型的血液应用时，可以将冰冻红细胞去除甘油，进而替代悬浮红细胞用于患者，用来缓解临床用血压力。在实际应用中，冰冻红细胞解冰冻去甘油耗费时间较长，同时如何能快速去除甘油并且不损伤红细胞是关键问题。近年来，众多学者将细胞膜运输的数学模型与冰冻红细胞去甘油相结合，使得去甘油的时间极大的缩短[1]，并通过优化的实验流程以避免渗透损失。Lusianti等[2]经过微积分计算，确定冰冻红细胞分别与20.4 g/dl盐水孵育8 s，3 g/dl盐水孵育22 s后，可去除冰冻红细胞中绝大部分的甘油[1，3]。

为缩短去除甘油的时间，同时保持红细胞的稳定。我们选择使用三种不同浓度的盐溶液(20.4，3及0.9 g/dl)分别洗涤冰冻红细胞，并优化试验步骤，结果报告如下。 1 材料和方法

1.1 研究对象 随机选取100人份的悬浮红细胞制备成冰冻红细胞，然后从每人份取10 ml的冰冻红细胞作为检测样本，将制备好的冰冻红细胞分装为1 ml/管，冻存于-80℃保存[4]待检测。

1.2 试剂和仪器 SysmexKX-21三分类血细胞计数仪(上海希森美康仪器设备有限公司)，血浆游离血红蛋白检测试剂盒(北京瑞尔达生物科技有限公司)，三酰甘油检测试剂盒(浙江东瓯诊断产品有限公司)，大容量细胞计数池。 1.3 方法

1.3.1 将冰冻红细胞置于37℃水浴中融化1 min。在融化的冰冻红细胞中加入不同浓度的盐溶液，离心后，检测上清液中的游离血红蛋白浓度及甘油含量，用生理盐水重悬红细胞沉淀。解冰冻去甘油后进行血浆游离血红蛋白、白细胞残留量及甘油残留量的检测。

1.3.2 实验分组设计：以不同洗涤浓度和离心次数为变量，分成实验组1，2和对照组，研究分组的血样均来源配对同源样品。实验组1分组时每次以5倍体积盐水进行洗涤，最后一遍离心；实验组2在两次加入5倍体积盐水洗液后，进行离心，再加入第三次洗液；对照组为目前使用的常规方法。

具体为：实验组1：在1 ml融化的冰冻红细胞中加入4 ml 20.4 g/dl盐溶液，快速混匀后加入20 ml 3 g/dl盐溶液，快速混匀后加入100 ml 0.9 g/dl盐溶液；3 000 r/min离心5 min，弃上清，最后加入1 ml 0.9 g/dl盐溶液重悬。 实验组2：在1 ml融化的冰冻红细胞中加入4 ml 20.4 g/dl盐溶液，快速混匀后加入20 ml 3 g/dl盐溶液；3 000 r/min离心5 min，弃上清，加入5 ml 0.9 g/dl盐溶液重悬，3 000 r/min离心5 min，弃上清，加入1 ml 0.9 g/dl盐溶液重悬。

对照组：按照《血站技术操作规程(2015版)》的冰冻红细胞解冻去甘油的制备要求，使用全自动红细胞处理仪进行解冰冻去甘油操作，也是目前血站系统冰冻红细胞解冻去甘油采用的常规方法。

1.4 统计学分析 实验数据采用spss19.0软件分析，采用t检验。组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果

2.1 两种改良法解冰冻红细胞与常规方法的红细胞质量监测指标比较 见表1。红细胞含量、血细胞比容两个指标，红细胞实验组1与对照组比较差异无统计学意义(t值=1.680，P>0.05)；而血红蛋白浓度(g/L)为(82±4 vs 96±6)，差异有统计学意义(t=2.35，P<0.05)；实验组2与对照组比较，红细胞含量、血细胞比容和血红蛋白浓度3个指标，差异均有统计学意义(t值分别为2.851，3.114，2.980，均P<0.05)。实验组1与实验组2比较，红细胞含量、血细胞比容和血红蛋白浓度3个指标实验组1优于实验组2，但两组差异无统计学意义(P>0.05)。

表1

两种改良法解冰冻红细胞与常规方法的红细胞指标(n=100)检测项目实验组1实验组2对照组实验组1与对照组tP 实验组2与对照组tP红细胞含量(×1012/L)血红蛋白浓度(g/L)血细胞比容

3.54±0.1682±40.33±0.022.45±0.1668±40.27±0.023.56±0.2296±60.34±0.021.6802.3511.820>0.05<0.05>0.05 2.8513.1142.980<0.05<0.05<0.05 2.2 两种改良去甘油后的解冰冻红细胞与常规方法的质量检测指标 按照《全血与成分血质量要求(2012版)》[5](以下简称“国家标准”)对解冰冻去甘油红细胞进行质量检测，将融化的冰冻红细胞去除甘油后，测量上清液中血浆游离血红蛋白含量、甘油含量及白细胞残留量，结果见表2。实验组1与对照组比较，游离血红蛋白含量、甘油残留量和白细胞残留量3项指标比较，差异均有统计学意义(t值分别为2.633，2.342，2.050，均P<0.05)。实验2组与对照组比较，游离血红蛋白含量、甘油残留量和白细胞残留量3项指标比较，差异均有统计学意义(t值分别为2.532，2.331，2.010，P<0.05)。实验组1和实验组2的质量检测指标均优于对照组，符合国家标准。 表2

两种改良法去甘油后的解冰冻红细胞与常规方法的质量比较(n=100)检测项目实验组1实验组2对照组实验组1与对照组tP 实验组2与对照组tP血浆游离血红蛋白含量(g/L)甘油残留量(g/L)白细胞残留量(≤1×105个

/ml)0.35±0.050.73±0.070.04±0.0040.42±0.070.89±0.080.04±0.0040.81±0.061.26±0.060.05±0.0042.6332.3422.050<0.05<0.05<0.05 2.5322.3312.010<0.05<0.05<0.05

3 讨论 正常红细胞保存期为28～35天，全血及红细胞类血液成分在保存过程中，红细胞会遭受不同程度的破坏，原因是红细胞膜上的脂蛋白及脂质成分会随着

保存时间的延长而减少，细胞内K+降低，Na+，Ca+升高，红细胞变性能力下降，渗透脆性增加，一旦受外界影响，Hb会从细胞内逸出，形成游离血红蛋白(FHb)[6]。冰冻红细胞保存期可达到10年，甘油冻存技术对于延长红细胞的保存期，增强采供血机构的保障应急能力具有重要的使用价值，但是解冰冻去甘油耗费时间较长，而且存在红细胞溶血的问题。去甘油而导致的红细胞溶血主要是因为：①去甘油会产生渗透梯度的改变[7]；②红细胞肿胀程度超过最大承受限度。传统的方法已使用近30年，去甘油的原理为缓慢、逐渐改变溶液成分，避免渗透损失的发生[8，9]，但紧急情况下整个解冰冻过程耗时较长，有可能无法及时保证血液供应。

为缩短解冰冻的时间，我们设计了快速从冰冻红细胞中去除甘油的两种方法，实验组2相比实验组1减少了洗液体积，更有利于实际操作，但是在红细胞含量、血细胞比容和血红蛋白浓度3个指标实验组1优于实验组2，只是两组没有统计学差异。通过对比试验发现，采用实验组的方法除解冻后成品的血红蛋白浓度低于传统方法的对照组外，其他各项指标均与对照组无差异，部分质量指标优于对照组。我们分析实验组血红蛋白浓度低于传统方法的原因可能为：高浓度盐溶液洗涤去甘油后，使红细胞变形溶血，最佳的去甘油的平衡时间依赖于甘油的渗透性，而检测单个红细胞的甘油渗透性，发现其差异较大，难以选择适合于所有细胞的最佳时间。另外在去甘油期间，混合动力学也会影响预期结果与实验结果的一致性。由于混合溶液时间过短，使溶液未完全混合，可能导致样本中部分的溶液成分有所差异，导致细胞的损伤，造成成品的血红蛋白浓度偏低。因此，在下一步的研究中，需要在考虑这些可变性的条件下，继续优化实验条件。

在本研究中所建立的去甘油的实验方法，可以较快地完成冰冻红细胞去甘油，缩短成品的制备时间，可以提高应急相应速度。在下一步的研究中，除继续优化实验条件、提高血红蛋白等指标外，我们拟进行K+，ATP，2，3-二磷酸甘油酸以及可

变形性的测量，对红细胞的质量进行更为全面地评估。同时，我们也会调整溶液成分，在保证各项指标达到国标的前提下，尽量减少洗液的使用量，使该方法适合于日常工作中的使用。 参考文献：

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