缩写词ＡｃｒＡｍｐＡＰＳｂｐＢＳＡｃＤＮＡｄｄＨ２０ＤＥＰＣＤＭＳＯＤＮＡ心ＴＰＤＴＴＥ．ｃｏｌｉＥｌＥ２Ｅ３ＥＤｌ’ＡＥＲＥＲＡＤＧＡＰＤＨＩＰＴＧＬＢＭ．ＭＬＶｍＲＮＡＯＤ缩写词表缩写词表英文ａｃｒｙｌａｍｉｄｅａｍｐｉｃｉｌｌｉｎａｍｍｏｎｉｕｍｐｃｒｓｕｌｆａｔｅｂａｓｅｐａｉｒ（ｓ）ｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｄｏＩｌｂｌｅｄｉｓｔｉｌｌｅｄｗａｔｅｒｄｉｅｔｈｙｌｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌＥｓｅｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＵｂｉｑｕｉｔｉｎ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇｅｎｚｙｍｅｌＵｂｉｑｕｉｔｉｎ—ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇｅｎｚｙｍｅＵｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎｌｉｇａｓｅｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃａｃｉｄＥｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍＥＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎＧｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅＩｓｏｐｒｏｐｙｌ－·Ｂ－－Ｄ－·ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅＬｌｌｒｉａ—ＢｅｒｔａｎｉｍｅｄｉｕｍＭｏｌｏｎｅｙｒｏｕｔｉｎｅｌｅｕｋｅｍｉａｖｉｒｕｓｍｅｓｓｅｎｇｅｒｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｏｐｔｉｃａｌｄｅｎｓｉｔｙⅡ中文丙烯酰胺氨苄青霉素过硫酸铵碱基（对）牛血清白蛋白互补ＤＮＡ双蒸水焦碳酸二乙酯二甲基亚砜脱氧核糖核苷酸脱氧核苷三磷酸二硫苏糖醇大肠埃希菌泛素激活酶泛素交联酶泛素蛋白连接酶乙二胺四乙酸内质网ＥＲ相关降解３磷酸甘油脱氢酶异丙基硫代半乳酸糖苷ＬＢ培养基莫氏鼠白血病病毒信使核糖核酸光密度值ＰＡＧＥＰＣＲＰＤＰＥＧＰＩＰＥＳＰＭＳＦＲＩＮＧＲＮＡＲＴ－ＰＣＲＳＤＳＤＳＴＢＥＴＢＳＴＴＥＭＥＤ田Ｍ％ｓＸ—ｇａｌ缩写词表ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎＰａｒｋｉｎｓｏｎ’Ｓｄｉｓｅａｓｅｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ－Ｎ，Ｎ＇－ｂｉｓ·（２一ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ）ＰｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｐｈｏｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅＲｅａｌｌｙｉｎｔｅｒｅｓｔｉｎｇｎｅｗｇｅｎｅｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｐｏｌｙｍｅｒｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎｓｙｎｔｈｅｔｉｃｄｒｏｐｏｕｔｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅｔｒｉｓ／ｂｏｆｉｃａｃｉｄ（ｂｕｆｆｅｒ）ＴｒｉｓｂｕｆｆｅｒｅｄｓｆｌｉｎｅｃｏｎｔａｉｎｉｎｇＴｗｅｅｎ２０Ｎ，Ｎ，Ｎ’＇Ｎ’－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｔｒｉｓ－（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ５－ｂｒｏｍｏ－－４－ｃｈｌｏｒｏ－３－ｉｎｄｏｌｙｌ—Ｂ—Ｄ—ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅＩＩＩ聚丙烯酰胺凝胶电泳聚合酶链反应帕金森氏病聚乙二醇哌嗪一Ｎ，Ｎ’一双（２一乙磺酸）苯甲基磺酰氟真正感兴趣新基因核糖核酸逆转录聚合酶链反应ＳＤ培养基十二烷基硫酸钠Ｔｒｉｓ／硼酸电泳缓冲液Ｔｒｉｓ洗膜缓冲液Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’．四甲基乙二胺跨膜结构三（羟甲基）氨基甲烷５．溴一４一氯一３一吲哚一Ｄ—Ｄ一半乳糖苷酶同济大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任由本人承担。签名：．年月日学位论文版权使用授权书本人完全了解同济大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检索以及提供本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权按有关规定向国家有关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在不以赢利为目的的前提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。学位论文作者签名：年月日经指导教师同意，本学位论文属于保密，在本授权书。指导教师签名：年月Ｅｔ年解密后适用学位论文作者签名：年月日第部分基因在内质网应激巾－的作用⑧ＴＥＢ４摘要摘要目的：利用已有的ＴＥＢ４截短体基因重组质粒和ＴＥＢ４的ＲＮＡ干扰重组质粒转染入胚肾２９３细胞，建立ＴＥＢ４过表达及其ＲＮＡ干扰细胞模型。毒素诱导细胞模型发生内质网应激，检测细胞内质网应激相关基因（ＣＨＯＰ、ＧＲＰ７８、ＧＲＰ９４）表达的变化。探讨某些毒素诱导内质网应激时，ＴＥＢ４截短体基因对内质网应激相关因子ｍＲＮＡ和蛋白水平表达的影响，及其在细胞应激中的作用。方法：ｌ、用脂质体转染法将ＴＥＢ４截短体重组质粒（ｐＥＧＦＰ．ＴＥＢ４）和ＴＥＢ４的ＲＮＡ干扰片段重组质粒（ｐＳｕｐｅｒ－ＥＧＦＰ．ＲＮＡｉ）分别瞬时转染人胚肾２９３细胞，建立相应的ＴＥＢ４截短体过表达细胞模型和ＴＥＢ４干扰细胞模型。以分别转染ｐＥＧＦＰ－Ｎ２和ｐＳｕｐｅｒ．ＥＧＦＰ质粒的２９３细胞为对照组。２、实时荧光定量ＰＣＲ（ＲＴ．ＰＣＲ）、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测各组细胞模型中ＴＥＢ４的表达，以确定细胞模型是否制备成功。３、转染４８小时后，分别以鱼藤酮、衣霉素和Ａ１３２５．３５蛋白诱导各组细胞模型发生内质网应激，在毒素作用不同时间收获细胞，ＲＴ．ＰＣＲ、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法测定内质网应激相关因子ＣＨＯＰ、ＧＲＰ７８和ＧＲＰ９４在不同细胞模型组中的表达，探讨ＴＥＢ４在内质网应激中的作用。结果：ｌ、ＲＴ．ＰＣＲ、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法分别检测到ＥＧＦＰ．ＴＥＢ４过表达细胞模型组中ＴＥＢ４的ｍＲＮＡ水平的表达量是其对照组ｐＥＧＦＰ－Ｎ２的２．０２倍，蛋白水平的表达量是其对照组ｐＥＧＦＰ．Ｎ２的１．１３倍；相对于对照组ｐＳｕｐｅｒ－ＥＧＦＰ，ＥＧＦＰ．Ｉ埘灿干扰细胞模型组中ＴＥＢ４的ｍＲＮＡ水平及蛋白水平的抑制率分别是６２．９６％和６０．８２％。表明细胞模型建立成功。２、衣霉素诱导的内质网应激中，２４小时和４８小时，ＴＥＢ４干扰组中ＧＲＰ７８、ＧＲＰ９４的ｍＲＮＡ和蛋白水平都明显高于ＴＥＢ４过表达组（ｐ＜Ｏ．０ｌ，ｐ＜０．０１）；各组间ＣＨＯＰ的表达无论是ｍＲＮＡ水平还是蛋白水平都没有显著差异。Ａ１３２５．３５蛋白诱导内质网应激作用４小时，ＴＥＢ４干扰组中ＣＨＯＰ的ｍＲＮＡ和蛋白水平都明显高于ＴＥＢ４过表达组（ｐ＜０．０５，ｐ＜Ｏ．０５）；而２４小时后，ＣＨＯＰ的ｍＲＮＡ和蛋白水平表达量很低，各组之间没有显著差异。作用２４小时后，ＴＥＢ４干扰组中ＧＲＰ７８的ｍＲＮＡ和蛋白水平都明显高于ＴＥＢ４过表达组（ｐ＜０．０１，ｐ＜０．０５）。在鱼藤酮诱导细胞后未检测出基因明显表达变化。摘要结论：在衣霉素和Ａ１３２５－３５蛋白诱导２９３细胞发生内质网应激中，ＴＥＢ４截短体缓解了应激引起的ＣＨＯＰ、ＧＲＰ９４和ＧＲＰ７８基因的表达上调。关键词：ＴＥＢ４，内质网应激，实时荧光定量ＰＣＲ，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ，２９３细胞２ＡＢＳＴＲＡＣＴＡＢＳＴＲＡＣＴＯｂｊｅｃｔｉｖｅＷｉｔｈｔｈｅｐｅｒｓｅｖｅｒａｔｅｄｏｖｅｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇａｎｄｉｎｔｅｆｅｆｉｎｇＴＥＢ４ｆｒａｃｔｉｏｎｏｎｍｏｄｅｌｓ，ｔｏｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＴＥＢ４ｆｒａｃｔｉｏｎｓｏｍｅＥＲ－ｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅ（ＣＨＯＰ，ｉｎｔｈｅｈｕｍａｎＧＲＰ７８，ＧＲＰ９４）ｏｎｔｈｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｆｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍ（ＥＲ）ｓｔｒｅｓｓｅｍｂｒｙｏｋｉｄｎｅｙ２９３ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１）ＴｈｅｓｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｉｏｎｓｐＥＧＦＰ－ＴＥＢ４ａｎｄｐＳｕｐｅｒ－ＥＧＦＰ－ＲＮＡｉｗｅｒｅｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｉｎｔｏ２９３ｃｅｌｌｓｕｓｉｎｇＬｉｐｏｆｅｃｔａｒｎｉｎｅ，ｗｉｔｈｐｌａｓｍｉｄｓｐＳｕｐｅｒ－ＥＧＦＰａｎｄｐＥＧＦＰ－Ｎ２ａｓｃｏｎｔｒ０１．（２）ＡｌｌＡ１３２５－３５ｏｆｔｈｅｃｅｌｌｇｒｏｕｐｓｗｅｒｅｅｘｐｏｓｅｄｔｏＲｏｔｅｎｏｎｅ，ＴｕｎｉｃａｍｙｃｉｎｏｒｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙｔｏａｓｉｎｄｕｃｅＥＲｓｔｒｅｓｓ．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＥＲＳｔｒｅ辎－ｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅｓｓｕｃｈｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ．ＣＨＯＰ，ＧＲＰ７８ａｎｄＧＲＰ９４ＷａｓｔｅｓｔｅｄｂｙＲＴ－ＰＣＲａｎｄＲｅｓｕｌｔｓ（１）ＴＥＢ４ｏｖｅｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｆｒａｃｔｉｏｎｇｅｎｅＷａｓｃｈｅｃｋｅｄｔｏｂｅｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｈｉｇｈｌｙｉｎｇｒｏｕｐＥＧＦＰ－ＴＥＢ４ｃｅｌｌｓ；ａｎｄｔｏｂｅｋｎｏｃｋｅｄｄｏｗｎｇｒｅａｔｌｙｉｎｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇｇｒｏｕｐｏｆＥＧＦＰ－ＲＮＡｉｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅｃｅｌｌｍｏｄｏｌｓｗｅｒｅｓｕｃｅｓｓｆｕｌｌｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．ａ（２）ＥｘｐｏｓｕｒｅＧＲＰ７８ａｎｄｏｆａｌｌｔｈｅｃｅｌｌｇｒｏｕｐｓｔｏＴｕｎｉｃａｍｙｃｉｎｒｅｓｕｌｔｅｄｉｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｉｎｃｒｅａｓｅｏｆＧＲＰ９４．Ｔｈｅｙｗｅｒｅｕｐ—ｒｅｇｕｌａｔｅｄｍｏｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇｇｒｏｕｐａｆｔｅｒ２４ｔｈａｎｉｎｏｖｅｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｇｒｏｕｐａｎｄａｎｙ４８ｈｏｕｒｓ（ｐ＜ｏ．０１；ｐ＜０．０１）．ＣＨＯＰＷａｓｄｉｓｃｒｅａｓｅｄｇｒａｄｕａｌｌｙａｎｄＣａｎｎｏｔｆｏｕｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｆｔｅｒ４８ｈｏｕｒｓ．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｇｅｎｅＣＨＯＰＷａｓｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄａｆｔｅｒｔｈａｎｉｎｏｖｅｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｇｒｏｕｐａｆｔｅｒ４Ａｆｌ２５．３５ｉｎｄｕｃｅｄＥＲｓｔｒｅｓｓｉｎｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇｇｒｏｕｐｏｆｇｅｎｅＧＲＰ７８ｈｏｕｒｓ（ｐ＜Ｏ．０５）．Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｔｒｅｓｓ２４ＷａｓｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄａｆｔｅｒＡｆｌ２５－３５ｉｎｄｕｃｅｄＥＲｈｏｕｒｓｉｎｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇｏｆｔｈｅｓｅｇｒｏｕｐｔｈａｎｉｎｎｏｏｖｅｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｇｒｏｕｐ（ｐ＜０．０５；ｐ＜０．０５）．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｇｅｎｅｓＷａｓｏｂｖｉｏｕｓｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｗｈｅｎｔｈｅｇｒｏｕｐｓＯｉｌｅｘｐｏｓｅｄｔｏｒｏｔｅｎｏｎｅａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｇｅｎｅｓｈｏｗｅｄｎｏｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓａｌｌｔｈｅｓｅｃｏｎｄｉｔｉＯＩＩＳ．ａｎｄＴｕｎｉｃａｍｙｃｉｎＡｐ２５－３５ＣａｎｉｎｄｕｃｅＥＲｓｔｒｅｓｓｉｎｔｈｅｓｅ２９３ｃｅｌｌｍｏｄｅｌｓ，ａｎｄＴＥＢ４ｆｒａｃｔｉｏｎｒｅｐｒｅｓｓｅｄｔｈｅｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＣＨＯＰ，ＧＲＰ９４ａｎｄＧＲＰ７８ｇｅｎｅｄｕｒｉｎｇＥＲｓｔｒｅｓｓ．３ＡＢＳＴＲＡＣＴＫｅｙＷｏｒｄｓ：ＴＥＢ４，２９３ｃｅｌｌｓ，Ｒｅａｌ—ＴｉｍｅＰＣＲ，ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ，ＥＲｓｔｒｅｓｓ４第１章前言第１章前言１．１神经退行性疾病神经退行性疾病是老年人常见病，主要包括多巴胺能神经元退化造成的帕金森病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ）和胆碱能神经元退化引起的阿尔茨海默病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ）。据报道神经元的老化、ＡＴＰ合成障碍、氧化应激、感染、一氧化碳中毒以及基因突变、遗传倾向等与本病的发生有关。随着老龄化社会的加速到来，ＰＤ严重地危害着人类的健康和生命，也给社会带来了相当大的经济负担。阿尔茨海默病是～种常见的以进行性记忆、认知功能丧失为临床特征的神经退行性疾病。典型的脑病理特征是大量老年斑、神经元纤维缠结形成以及神经元丢失。目前就其发病机制有多种假说，包括胆碱能假说，基因假说，金属离子假说，１３淀粉样蛋白（Ｂ～ａｍｙｌｏｉｄ，Ａ１３）级联假说、ｔａｕ蛋白过度磷酸化假说和突触功能障碍假说等。近年来的研究表明ＡＤ神经元死亡还与内质网（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍ，ＥＲ）功能的异常有关【Ⅻ。帕金森病是以中脑多巴胺（Ｄｏｐａｍｉｎｅ，ＤＡ）能神经元细胞内形成路易小体（Ｌｅｗｙｂｏｄｙ，ＬＢ）为主要特征的中枢神经系统病变性疾病。从目前研究来看，与遗传、环境因素、感染、衰老、氧化应激、自由基过多形成以及神经营养因子缺乏等有关，是多种机制协同作用的结剽１１Ｊ。其特征性的病理改变是黑质细胞死亡，残存的黑质细胞胞浆内出现路易小体。ＰＤ按病因分为家族性和散发性。家族性ＰＤ被认为是基因缺陷所致，例如在一些ＰＤ家系中发现ａ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ、ｐａｒｋｉｎ和ＵＣＨＬ．１基因突变【１２】。这些突变基因均与泛素一蛋白酶体系统（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ．ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅｓｙｓｔｅｒｍ，ＵＰＳ）有关。其中ｐａｒｋｉｎ是泛素Ｅ３连接酶，是主要涉及家族帕金森氏病的基因【１３】，定位于６号染色体上，在多种组织表达。１．２内质网应激细胞应激是多细胞生物生命活动过程中不可缺少的组成内容，是其籍以存活的需要，贯穿生物全部寿命周期中。细胞应激作为维持机体自身稳定的重要负调节机制，不仅参与了胚胎发生、组织塑型、发育、衰老等生理过程，而且与许多疾病的发生有关。内质阿（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｒｎ，ＥＲ）是一种非常重要的亚细胞结构，是分泌性蛋白及膜蛋白在细胞内进行折叠、修饰和组装的场所。ＥＲ内驻留有大量的分子伴侣蛋白和折叠酶，它们组建成了一个调控蛋白质折叠的“质控系统”。非折叠或错误折叠的多肽及没有组装好的蛋白将滞留在ＥＲ，然后通过泛素．蛋白酶体途径被清除，这就是所谓的ＥＲ相关的降解（ＥＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ，ＥＲＡＤ）。第１章前言在病理情况下如蛋白质糖基化的抑制，钙离子稳态的改变，二硫键减少等可引发ＥＲ内非折叠或错折叠蛋白的聚集【５】。当非折叠或错折叠蛋白在ＥＲ内堆积超过生理条件下ＥＲ的处理能力时，称为ＥＲ应激。ＥＲ应激可激发细胞的非折叠蛋白反应（ｕｎｆｏｌｄｅｄｐｒｏｔｅｉｎｒｅｓｐｏｎｓｅ，ＵＰＲ），促进蛋白质的正常折叠或降解异常折叠的蛋白质，发挥细胞自我保护作用。而ＥＲ应激过度或反应机制的失调可导致异常折叠蛋白在细胞内过度堆积干扰细胞正常功能，或通过ＥＲ应激相关的凋亡途径引起细胞调亡，导致疾病的发生。ＵＰＲ包括：（１）分子伴侣蛋白：免疫球蛋白结合蛋Ｅｌ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ，ＢｉＰ）也称为葡萄糖调节蛋白７８（ｇｌｕｃｏｓｅＧＲＰ９４和蛋白二硫键异构酶（ｐｒｏｔｅｉｎｄｉｓｕｌｆｉｄｅｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ７８，ＧＲＰ７８）、ｉｓｏｍｅｒａｓｅ，ＰＤＩ）等表达增加以协助ｌｉｋｅＥＲ错误折叠或非折叠的蛋白质正常折型６Ｊ；（２）通过ＰＥＲＫ（ＰＫＲｋｉｎａｓｅ，ＰＥＲＫ）ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ介导的途径减少蛋白质翻译；（３）激活ＥＲ相关蛋白降解（ＥＲｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ，ＥＲＡＤ）系统将无法修复的蛋白质由ＥＲ运输至胞浆，通过泛素一蛋白酶体系统降解【７Ｊ。如果ＥＲ应激过强，通过ＵＰＲ机制不能修复蛋白质的异常改变，将导致细胞的损害或调亡。在ＵＰＲ过程中，定位于ＥＲ的蛋白合成上调以增强未折叠蛋白的折叠能力，同时与ＥＲ相关蛋白降解有关的蛋白合成也同步上调，如ＨＲＤｌ／Ｄｅｒ３ｔｇ］。ＣＨＯＰ基因属于Ｃ／ＥＢＰ转录因子家族，常与该家族的其他成员形成二聚体。在非应激状态下，它的表达水平很低，而在内质网应激中，其表达量大大增加。有文献报道，ＣＨＯＰ的过表达导致细胞周期阻滞和细胞凋亡，ＣＨＯＰ是内质网应激的标志之一。ＣＨＯＰ能够下调Ｂ细胞淋巴瘤／白血病一２蛋白（Ｂ．ｃｅｌｌｌｙｍｐｈｏｍａ／ｌｅｕｋｅｍｉａ－２ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｂｅｌ．２）的表达【４¨。目前认为伴侣蛋白ＢｉＰ的上升能够阻碍细胞发生凋亡，但ＣＨＯＰ表达上调同时使细胞作好凋亡的准备，当不利因素持续存在、ＥＲＳ过于强烈时，细胞就发生凋亡。ＥＲ应激存在于神经退行性疾病中，包括ＰＤ、ＡＤ、亨廷顿病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎｓｄｉｓｅａｓｅ，ＨＤ）及其它多谷氨酰胺病等。蛋白沉积是许多神经退行性疾病的共同特征，神经细胞内蛋白的聚集影响了神经信号传递及轴突运输，并激活了与细胞死亡等有关的细胞内的信号通路。例如，Ｑ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ基因突变后可能减少含有神经递质的囊泡到达突触部位，使多巴胺从囊泡中丢失；同时基因突变导致这些蛋白的错误折叠增加并聚集在ＥＲ而诱发ＥＲ应激，使囊泡中的多巴胺进一步减少。Ｐａｒｋｉｎ蛋白的氨基端含有类似泛素的区域和两个ＲＩＮＧ结构域，在ＥＲＡＤ中发挥Ｅ３活性。在早发性ＰＤ中，Ｐａｒｋｉｎ常因发生突变而失去Ｅ３的活性。Ｐａｒｋｉｎ作为Ｅ３的蛋白底物已被发现，其中包括与Ｇ蛋白偶联的跨膜蛋白Ｐａｅｌ受体（Ｐａｅｌ—Ｒ），Ｐａｅｌ—Ｒ的错误折叠形成聚集体，这种蛋白也发现于路易小体，说明Ｐａｅｌ－Ｒ也能６第１章前言在ＰＤ中起直接作用。１．３泛素蛋白酶体系统泛素蛋白酶体系统（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ．ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅｓｙｓｔｅｍ，ＵＰＳ）是真核细胞内蛋白降解的主要生物化学通路之一，不仅负责细胞内突变、受损的和异常折叠的蛋白质的降解，调节短寿命蛋白质的水平，而且还参与调节细胞周期进程、基因转录调节、受体胞吞、抗原呈递、细胞增生与分化以及信号转导等各种细胞生理过程。泛素是一个高度保守的７６个氨基酸的多肽，它以泛素单体或者多聚泛素链的形式存在。泛素要经过一系列反应才能结合到底物蛋白上，使底物发生泛素化，包括泛素激活酶（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ．ａｃｔｉｖａｔｉｎｇｅｎｚｙｍｅ，ＵＢＡ，Ｅ１），泛素交联酶（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇｅｎｚｙｍｅ，ＵＢＣ，Ｅ２）和底物特异性的泛素．蛋白连接酶（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ．ｐｒｏｔｅｉｎｌｉｇａｓｅ，Ｅ３），即多个泛素分子通过异肽键（ｉｓｏｐｅｐｔｉｄｅｂｏｎｄ）附着在靶蛋白上，形成分支状的多聚泛素链，Ｅ３酶特异性地使泛素和底物蛋白结合，泛素化的蛋白被运送到２６Ｓ的蛋白酶体而被最终降解，同时泛素被释放出并被重新利用。真核细胞蛋白质的泛素化修饰是仅次于磷酸化的最常见的调控方式之一【ｌｌ。ＴＥＢ４本身也是一种内质网降解的底物，它依赖其Ｎ端的环指结构，通过蛋白酶体系统的作用方式促进自身降解。许多Ｅ３连接酶有一个特殊的共性，即依赖环指结构而诱导自身降解。ＴＥＢ４和这些具有环指结构的蛋白一样，在蛋白酶体系统中由自带的环指结构诱导自身泛素化。这种自身诱导的降解可能起着调节过表达ＴＥＢ４蛋白的作用，并且已在肿瘤坏疽因子的受体相关因子２（ＴＲＡＦ２）ｑｈ有显示。有些内质网膜相关ＲＩＮＧ—ＣＨ蛋Ｅｔ（ＭＡＲＣＨ），如鼠科的微疱疹病毒１２４１ｍＫ３和Ｋａｐｏｓｉ肉瘤疱疹病毒编码的ｋＫ３与ｋＫ５ｔ２５１，能抑制细胞表面的姗Ｃ—Ｉ复合物与共刺激物分子（ＩＣＡＩＶＩ—ｌ、Ｂ７．２）。过表达的ＴＥＢ４和它的环指突变异种都不影响ＭＩＩＣ－１分子，Ｆａｓ，ＴｆＲ，ＣＤ４，和Ｂ７．２Ｏｉａｓｓｉｎｋ样。泛素．蛋白酶体系统的异常引起细胞毒性蛋白的聚集可能在家族性和散发性ＰＤ的发病机制中起主要作用。目前，已有至少编码５种蛋白的基因的突变联系于ＰＤ．ａ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ、Ｐａｒｋｉｎ、泛素Ｃ末端水解酶Ｌ１（ＵＣＨ—ＬＩ）、ＤＪ—ｌ及ＰＩＮＫｌ。也已有大量的散发性ＰＤ患者蛋白酶体功能不良的证据。这些不同的变化通过不同的机制使得应该被清除的多余蛋白在细胞内堆积，导致ＰＤ发生。当Ｑ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ基因发生突变时，胞内ａ—ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ蛋白异常折叠或表达过度，抵ｅｔａｌ未发表）的表达，推定ＴＥＢ４并不与其它一些ＭＡＲＣＨ蛋白的功能一抗蛋白酶体降解，引起胞内异常Ｑ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ堆积。大量Ｑ—ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ相互聚７第１章前言集，表现出神经毒性；同时，错误折叠和聚集的Ｑ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ直接诱发了线粒体功能丧失。Ｐａｒｋｉｎ基因突变导Ｐａｒｋｉｎ作为Ｅ３泛素蛋白连接酶的功能障碍。蛋白底物因不能被泛素化后降解而在细胞内聚集，这些底物可能蓄积引起神经毒性。同时，未被泛素化的蛋白聚集后，细胞对环境应激的敏感性大大增加，随后直接或间接激活细胞死亡通路。１．４ＴＥＢ４蛋白ＴＥＢ４蛋白（Ｍｅｍｂｒａｎｅ．ａｓｓｏｃｉａｔｅｄＲＩＮＧ．ＣＨＩＶ，ＭＡＲＣＨＩＶ）是内质网膜镶嵌蛋白，其Ｎ端位于细胞质中，Ｃ端指向内质网内腔。它位于染色体５ｐ１５．２的１０．４—１０．５Ｍｂｐ处，在对与ＴＥＢ４同源的大鼠、线虫Ｃ、疟蚊和果蝇的氨基酸序列同源性比较时发现，ＴＥＢ４的序列高度保守。Ｄｏａｌ０（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆａｌｐｈａ２）是其在酵母中的同源体，具有Ｅ３连接酶活性。ＴＥＢ４在许多器官表达，如心、脑、胎盘、肺、骨骼肌、肾、胰、脾、胸腺、前列腺、睾丸、卵巢和小肠，由此表明ＴＥＢ４在细胞中参与广泛的看家功能。人ＴＥＢ４蛋白由９１０个氨基酸组成，包含环指结构（ＲＩＮＧ．ｆｉｎｇｅｒ）域和十三个跨膜域。这个环指结构域位于蛋白的Ｎ端，具有特殊的Ｃ４ＨＣ３结构。环指结构是含有两个锌离子结合八个半胱氨酸（－ｃｙｓ）残基和组氨酸（．ｈｉｓ）残基形成的双环，Ｅ３连接酶的环指结构是由ｃｙｓ和ｈｉｓ残基的不同排列形成的１２Ｊ。它是许多基因具有泛素连接酶作用的重要结构，参与了膜相关Ｅ３连接酶的催化反应。有的蛋白带有非典型的环指结构，如Ｐａｒｋｉｎ中发现的双环指结构。目前，在啤酒酵母中已确认存在两种Ｅ３连接酶，分别是Ｈｒｄｌ／Ｄｅｒ３［２ｓＪ和ＤｏａｌＯ。Ｄｏａｌ０是ＴＥＢ４在酵母中的同源体，编码的蛋白为１５１ＫＤ。在ＴＥＢ４和Ｄｏａｌ０蛋白内区的第６５０至第８００残基处存在一个氨基酸序列相似部位，称为ＴＥＢ４．Ｄｏａｌ０（ＴＤ）域［４１。在对细胞质酵母杂交因子ａ２（ｆａｅｔｏｒ－ａ２）降解的研究中，Ｄｏａｌ０被确认为是一个新的Ｅ３泛素连接酣２９１。它由一种降解指示信号Ｄｅｇｌ促进蛋白的泛素化。Ｄｅｇｌ存在与酵母杂交因子ａ２（ｆａｃｔｏｒ－ａ２）的Ｎ端残基中。在发挥Ｅ３连接酶活性时，ＤｏａｌＯ依赖于泛素耦连酶（ＥＺ）Ｕｂｅ６和Ｕｂｃ７。一些底物的降解信号最初是在酵母中被确定【３引。产生这些底物的酵母蛋白是以泛素连接酶Ｄｏａｌ０做为研究对象的。因此作为酵母Ｄｏａｌ０的同源体，对人类ＴＥＢ４基因的缺损与神经退行性疾病的关系的研究，具有很大的研究意义。在泛素结合酶参与的赖氨酸残基特定位点的泛素反应中，与ＴＥＢ４蛋白分离的环指结构在体外能催化泛素的连接【１１。这些特性与Ｅ３酶有关。ＴＥＢ４自身是内质网降解的酶作用底物，以依赖环指结构的方式促进降解。在与ＴＥＢ４同源的大鼠、线虫Ｃ、疟蚊和果蝇的氨基酸序列核对时发现，ＴＥＢ４的序列高度保守。ＴＥＢ４８第１章前言在不同种属之间表达的高度保守性和组织表达的广泛性‘¨，Ｎ．一末端典型的环指结构域及其表现出的泛素一蛋白连接酶活性，都显示出ＴＥＢ４在维持细胞内蛋白含量和正常代谢中起着重要作用，以及ＴＥＢ４与神经退行性疾病的紧密相关性。本实验室长期从事神经分子生物学方面的研究【１５．１６肿】。我们通过比较帕金森病人脑组织黑质区和其它区域的多巴胺能神经细胞，发现ＴＥＢ４截短体基因，并且ＴＥＢ４截短体在无路易小体的多巴胺能神经细胞中高表达【ｌ引。推测其与ＰＤ等神经退行性疾病紧密关联。ＴＥＢ４包含两种剪接体，一种是全长，另一种是截短体。经证实，在脑内ＴＥＢ４以截短体的形式存在，它的截短体剪切掉了其Ｎ．末端包括ＲＩＮＧ结构域在内的４２０个氨基酸序列，只保留Ｃ．末端４９０个氨基酸序列。下图是包含９１０个氨基酸残基的ＴＥＢ４全长与脑内包含４９０个氨基酸残基的ＴＥＢ４截短体的关系示意图。ＮＨ２ＣｏｏＨ９１０个氨基酸残基含Ｃ４ＨＣ３ＲＩＮＧ结构域的ＴＥＢ４全长ＮＨ２ＣＯＯＨ４９０个氨基酸残基的ＴＥＢ４截短体为什么ＴＥＢ４截短体基因在无ＬＢ的多巴胺能神经细胞中高表达？这是否影响神经退行性病进程？其具体作用机制是什么？为了进一步研究ＴＥＢ４的这些相关作用，本实验室已经成功构建ＴＥＢ４截短体表达重组质粒和ＲＮＡ干扰重组质粒。在此基础上，选取三种毒素构建神经细胞损伤模型，进而观察ＴＥＢ４基因在细胞应激中的作用。Ａ１３蛋白（ＡｍｙｌｏｉｄＢ．ｐｒｏｔｅｉｎ）是淀粉样前体ＡＰＰ蛋白的代谢产物啪１，它在Ｙａｎｋｎｅｒ等首先脑组织中含量的异常增加是ＡＤ脑神经细胞的凋亡的主要诱因。观察到较高浓度的Ａｐ能引起神经元退化和死亡，并证实引起毒性的必需结构是其２５～３５位的氨基酸序列（ＡＢ２５－３５）口¨。衣霉素（ｔｕｎｉｅａｍｙｅｉｎ）为放线菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｙｓｏｓｕｐｅｒｆｉｃｕｓ）产生的核苷酸抗生素。可抑制具有被膜（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）的病毒的繁殖。它是目前常用的内质网应激诱导剂，尤其在体外研究中，广泛应用于对细胞内质网应激反应性细胞凋亡的机理研究、各种致病因素与内质网凋亡途径之间的关系研究等。鱼藤酮（ｒｏｔｅｎｏｎｅ）对多巴胺神经元具有神经毒性作用，作为ＰＤ．致病的一个环境危险因子，已成为ＰＤ研究的热点。故本文分别以衣霉素、鱼藤酮和Ａ１３２５．３５蛋白诱导人胚肾２９３细胞发生内质网应激，９第１章前言实时荧光定量ＰＣＲ法和ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ技术测定内质网应激相关因子ＣＨＯＰ、ＧＲＰ７８和ＧＲＰ９４在２９３细胞中的表达。结果显示ＴＥＢ４截短体蛋白参与调解内质网应激相关因子的表达。１０第２章材料第２章材料２．１材料２．１。１菌株与细胞株ＤＨ５ａ大肠杆菌：本实验室保存人２９３细胞：由上海复旦大学医学院惠赠２．１．２质粒ｐＥＧＦＰ－Ｎ２为本实验室保存ｐＳＵＰＥＲ－ＥＧＦＰ为本实验室保存２．１．３主要仪器及物品超净工作台：吴江市江南净化工程有限公司高速冷冻离心机：Ｂｉｏｆｕｇｅ１５Ｒ，ＨｅｒａｃｕｓｓｅｐａｔｃｈＳｐｅｅｄＶａｃＲＰｌｕｓＳＣ１１０，ｓａｖａｎｔ培养箱：ＦｏｒｍａＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ显微镜：Ｏｌｙｍｐｕｓ紫外投射仪：上海长明光学电子仪器厂凝胶成像系统：ＵＶＰＰＣＲ仪：ＰＥＲＫＩＮＥＬＭＥＲ，Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司电子天平：ＤｅｌｔａＲａｎｇｅ水浴箱：ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ紫外分光光度计：ＤＵＲ６４０Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ，ｂｅｃｍａｎ电泳仪：江苏兴化市分析仪器厂实时定量ＰＣＲ仪：ＦＴＣ２０００荧光定量分析仪深低温冰箱：ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ公司垂直电泳设备：ＢＩＯ—ＲＡＤ电转移装置：上海天能仪器设备厂ＰＶＤＦ膜：ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｅｈ第２章材料定性滤纸：上海博光生物有限公司铝箔纸：上海友生实业有限公司０．２２滤器：ＳａｒｔｏｒｉｕｓＡＧ３７０７０Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ脱色摇床：江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司六孔板、６ｍｍ培养皿：Ｃｏｓｔａｒ公司２．１．４主要试剂及试剂盒Ｍ－ＭＬＶ逆转录酶：Ｐｒｏｍｅｇａ公司Ｔ４ＤＮＡＬｉｇａｓｅ：ＴａＫａＲａ公司限制性内切酶：ＴａＫａＲａ公司ＤＮＡ凝胶回收试剂盒：Ｑｉａｇｅｎ公司质粒小量抽提试剂盒：上海博光生物公司质粒中量抽提试剂盒：北京天为时代科技有限公司脂质体转染试剂盒Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００：庆大霉素：上海博光生物公司Ｇ４１８及ｂｕｆｆｅｒ：上海博光生物公司Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司Ｆｏｒｍａｎｚａ溶解液：上海博光生物公司胎牛血清：ＢＩＯＣＨＲＯＭＡＧ公司Ｔａｑ酶、ｄＮＴＰ、ＲＮＡ酶抑制剂、ＬｏａｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ：ＴａＫａＲａ公司ＤＭＥＭ冻干粉：Ｇｉｂｃｏ公司非必需氨基酸：Ｇｉｂｃｏ公司丙酮酸钠：Ｇｉｂｏｏ公司蛋白酶抑制剂：Ｓｉｇｍａ公司Ｋｉｔ：ＴａＫａＲａ公司ＰｉｅｒｅｅＢＣＡＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙＲＴ－ＰＣＲ（ｒｅａｌＡｍｙｌｏｉｄｔｉｍｅ试剂盒）：ＴａＫａＲａ公司１３－ｐｒｏｔｅｉｎｆｒａｇｍｅｎｔ２５－３５：Ｓｉｇｍａ公司鱼藤酮：Ｓｉｇｍａ公司衣霉素：Ｓｉｇｍａ公司１２第２章材料抗体Ｇｒｐ９４ａｎｔｉｂｏｂｙ：ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ公司Ｐｕｒｉｆｉｅｄａｎｔｉ—ｃｈｏｐ（ＧＡＤＤｌ５３）：ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ公司Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉ－１３－ａｃｔｉｎ：Ｓｉｇｍａ公司ＭＡＲＣＨ６ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｂｙ：ＡｂｎｏｖａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎＧｒｐ７８／Ｂｉｐ．ＡＢＣＡＭ公司Ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔＩｇ－ＲＯＣＫＬＡＮＤ公司Ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅＩｇ－ＲＯＣＫＬＡＮＤ公司’其余国产试剂均为分析纯。普通ＰＣＲ所用引物由上海Ｉｖｉｔｒｏｇｅｎ公司合成。定量ＰＣＲ’所用引物由上海Ｉｖｉｔｒｏｇｅｎ公司合成。１３第３章方法第３章方法３．１质粒的去内毒素中量抽提质粒中量抽提按博大泰克有限公司去内毒素质粒中抽试剂盒操作流进行。所提取的重组质粒ＥＧＦＰ．ＴＥＢ４、ＥＧＦＰ．ＲＮＡｉ、ＥＧＦＰ－Ｎ２和ｐＳｕｐｅｒ．ＥＧＦＰ均为实验室保存。操作步骤如下：将５０ｍｌ过夜培养物离心，使细菌沉淀，弃上清。用２ｍｌ溶液Ｉ振荡至彻底悬浮细菌，然后加入３ｍｌ溶液Ⅱ，立即轻柔颠倒离心管数次，至菌体充分裂解，随后将离心管放置于冰上５—１０ｍｉｎ，加入３ｍｌ溶液ＩⅡ，立即温和颠倒离心管数次，有絮状沉淀出现，室温放置１０ｍｌ。１２０００ｒｐｍ离心１０分钟。取上清到一个干净的１５ｍｌ离心管中，随后加入０．６倍体积的异丙醇，混匀后于．２０＂１２放置３０ｍｉｎ，１２０００ｒｐｍ／４‘Ｃ离心２５ｍｉｎ。去掉上清收集沉淀，溶于２５０ｐｌｄｄＨ２０并加入２５０１１０ｍｇ／ｍｌＲｎａｓｅＡ，３７℃保温３０ｍｉｎ。加入等体积的结合缓冲液，混匀后转移到离心吸附柱中，１２０００ｒｐｍ离心ｌｍｉｎ，倒掉收集管中的液体。加入８０００１漂洗缓冲液，静置１ｍｉｎ后于１２０００ｒｐｍ离心ｌｍｌ，倒掉收集管中的液体。重复两次。再次１２０００ｒｐｍ离心２ｍｉｎ，倒掉收集管中的液体。小心取出离心吸附柱将其转到一个干净的１．５ｍｌ离心管中，加入１５００１ｄｄＨ２０洗脱ＤＮＡ，放置１分钟，１２０００ｒｐｍ离心１分钟，收集洗脱液，．２０℃保存。紫外分光光度法检测抽提得到的重组质粒的浓度。３．２．细胞转染３．２．１培养液及试剂配制（１）ＤＭＥＭ培养液：ＤＭＥＭ培养基一袋（１Ｌ），ＮａＨＣ０３２．４３８９，ＨＥＰＥＳ２．３８３ｌｇ，ｄｄＨ２０８００ｍｌ。用１ＭＨＣＩ调节ＰＨ值至７．２－－－７．４，定容至１０００ｍｌ，０．２ｐａｎ滤膜过滤分装，４℃备用。（２）标准培养基：胎牛血清２０ｍｌ＋庆大霉素５００ｕｌ＋ＤＭＥＭ培养液１７６ｍ１＋非必需氨基酸２ｍｌ＋丙酮酸钠２ｍｌ，ＤＭＥＭ培养液定容至２００ｍｌ，４＂Ｃ保存备用。（３）０．０４％ＥＤＴＡ：ＥＤＴＡ－Ｎａｌｇ，ＮａＣＬ４０９，ＫＣｌｌｇ，Ｎａ２ＨＰ０４５．７５９，ＫＨ２Ｐ０４１９，调节ＰＨ值至７．２～７．４，定容至２５０ｍｌ，即为１０倍浓缩液。高温高压消毒（１２１℃，２０分钟），４＂Ｃ保存，使用时稀释１０倍。（４）（３４１８．１９Ｇ４１８粉剂溶解于２．５ｍｌＧ４１８Ｂｕｆｆｅｒ，即为４００ｍｇ／ｍｌ浓缩液，使用时每１００ｍｌ培养液中加２００ｕｌ浓缩液，即终浓度为８００ｐｇ／ｍｌ。．（５）０．２５％胰酶：胰蛋白酶０．２５９，ＥＤＴＡ液１００ｍｌ，搅拌混匀，抽滤分装，一２０℃保存备用。１４第３章方法（６）细胞冻存液：按胎牛血清：ＤＭＳＯ＝９：ｌ配制。（７）胎牛血清（Ｆｅｔａｌ．２０℃保存备用。（８）庆大霉素：使用时每１００ｍｌ培养液中加２５０ｕｌ硫酸庆大霉素注射液，即终浓度为１０ｎｇ／ｕｌ。３．２．２实验步骤３．２．２．１ｃａｌｆｓｅｒｕｍ，ＦＣＳ）分装：超净工作台内分装为２０ｍｌ／支，２９３细胞的培养及传代用标准培养基培养细胞，Ｃ０２细胞培养箱（５％Ｃ０２，３７４Ｃ）孵育细胞，每２＂－＇３天换液一次。细胞呈单层生长到７０％左右即进行细胞传代。细胞传代：去除培养瓶内的培养残液，加入０．０４％ＥＤＴＡ，漱洗后吸出，再加入１００－－－２００ｕｌ０．２５％胰酶（覆盖整个瓶底），３７℃孵育３－５分钟。镜下观察细胞形态变化，待细胞变圆，折光增强，用含血清培养液中止消化，反复吹打瓶壁，制成细胞悬液，移入离心管，１５００ｒｐｍ，室温离心５分钟后，去上清，用新鲜培养液悬浮沉淀，以３－４ｘ１０４个细胞／ｍｌ浓度传代，置于Ｃ０２培养箱（５％Ｃ０２，３７℃）继续培养。３．２．２．２细胞冻存方法用０．２５％胰酶消化细胞，１５００ｒｐｍ室温离心５分钟后去上清，用适量冻存液悬浮细胞，制成浓度为ｌ＇５ｘ１０４个细胞／ｍｌ的细胞悬液，加入１．５ｍｌ于灭菌冻存管内，依次置４＂Ｃ３０分钟，．２０＂（２２小时，最后移入液氮中。３．２．２．３瞬时转染２９３细胞株（１）取对数生长期贴壁２９３细胞株接种至６孔培养板，１８小时后，进行基因转染；（２）将ｐＥＧＦＰ—ＴＥＢ４质粒２１．ｔｇ加无血清培养液１００１上１；置于１．５ｍｌ离心管室温下混匀放置５分钟；（３）将脂质体Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ刑２０００２１．ｄ加无血清培养液１００肛１；置于１．５ｍｌ离心管混匀，室温下放置５分钟；（４）将（２）和（３）置于１．Ｓｍｌ离心管混匀，室温下放置２０分钟；（５）将（４）中混匀的ＤＮＡ与脂质体混合物加入６孔培养板，２００ｐＦ孔；培养板移入３７＂（２含５％Ｃ０２温育转染６小时；（６）换液，加入含ＩＯ％ＦＣＳ的ＤＭＥＭ培养液放置于３７℃培养箱中继续培养，培养２４＂－－４８小时后在倒置荧光镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况。将ＴＥＢ４转染的２９３细胞记为ＥＧＦＰ．ＴＥＢ４。第３章方法（７）以同样方法得到ｐＳｕｐｅｒ－ＥＧＦＰ－ＲＮＡｉ、ｐＥＧＦＰ－Ｎ２以及ｐＳｕｐｅｒ－ＥＧＦＰ表达的２９３细胞，分别记为ＥＧＦＰ．ＲＮＡｉ、ＥＧＦＰ．Ｎ２和ｐＳｕｐｅｒ－ＥＧＦＰ。３．３定量ＰＣＲ检测ＴＥＢ４基因过表达和干扰效果３．３．１细胞总ＲＮＡ的提取ＥＧＦＰ．ＴＥＢ４、ＥＧＦＰ．ＲＮＡｉ、ＥＧＦＰ．Ｎ２、ｐＳｕｐｅｒ－ＥＧＦＰ细胞分别培养于６ｍｍ培养皿中，培养液ｌｍｌ／每孔，３７＂Ｃ，５％Ｃ０２细胞培养箱中培养４８小时，收获细胞。本实验采用传统ＲＮＡ抽提方法，抽提ＥＧＦＰ．ＴＥＢ４、ＥＧＦＰ．ＲＮＡｉ、ＥＧＦＰ－Ｎ２和ｐＳｕｐｅｒ－ＥＧＦＰ的ＲＮＡ。操作步骤如下：（１）６ｍｍ培养皿培养４８小时，用０．２５％胰酶消化细胞３分钟，加入Ｔｒｉｚｏｌ试剂ｌｍｌ／每孔，分别收集各孔细胞于１．５ｍｌ离心管中。１００００ｒｐｍ，室温离心１０分钟后小心吸取上清至新的１．５ｍｌ离心管中。（２）加入２００ｕｌ氯仿，剧烈震荡，室温放置ｌＯ分钟。（３）１２０００ｒｐｍ，４＂Ｃ离心１５分钟。小心转移上层水相至新的１．５ｍｌ离心管。（４）加入异丙醇５００ｕｌ，颠倒混匀，室温放置ｌＯ分钟。（５）１２０００ｒｐｍ，４＂Ｃ离心１０分钟后弃去上清。（６）加入７５％乙醇ｌｍｌ，洗涤沉淀。８０００ｒｐｍ，４℃离心５分钟。（７）重复步骤（６）。（８）沉淀空气干燥，溶解于２０ｕｌＲＮａｓｅｆｒｅｅｗａｔｅｒ，即为ＲＮＡ。（９）抽提到的细胞ＲＮＡ各取２ｕｌ用于比色定量和电泳检测，其余ＲＮＡ分别１０ｕ１分装，于－６０℃保存备用。紫外分光光度计检测ＲＮＡ纯度和含量：（１）ＤＥＰＣ．Ｈ２０清洗比色皿，加入４００ｕｌＤＥＰＣ．Ｈ２０，调零。（２）加入ｌｕｌＲＮＡ溶液，充分混匀，读取２６０ｎｍ与２８０ｎｍ的吸光度数值。（３）计算Ａ２６０／Ａ２∞，分析ＲＮＡ纯度。取ｌｕｌＲＮＡ样品加入８ｕｌ甲酰胺，９５℃变性５分钟后，加入缓冲液ｌｕｌ进行ＲＮＡ电泳，检测其完整性。３．３．２逆转录将上一步骤得到的ＲＮＡ进行逆转录，试剂采用大连ＴａＫａＲａ公司的ＰｒｉｍｅＳｃｆｉｐｔ刑ＲＴ２０１ｄ。ｒｅａｇｅｎｔＫｉｔＰｅｒｆｅｃｔＲｅａｌＴｔｍｅ逆转录试剂盒。逆转录总体系为操作步骤如下：（１）在微量离心管配制下列反应液，全量为２０１ｘｌ。１６第３章方法ＴＭ５ｘＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＢｕｆｆｅｒ４山５０ｐｍｏｌ１００ｐｍｏｌ３１ｘｇＯｌｉｇｏｄＴＰｒｉｍｅｒＲａｎｄｏｍ６ｍｅｌ＇ｓＴｏｔａｌＲＮＡＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＤＥＰＣ．Ｈ２０ＴＭＲＴＥｎｚｙｍｅＭｉｘＩｌ山至２０１．ｄ（２）反转录条件如下：４２℃８５℃１５分钟５秒３．３．３引物设计各段引物的设计依据ＧＥＮＥＢＡＮＫ上检索到的已知基因序列设计，并经同源性比较以确定引物特异性。所有引物由上海Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司合成。表３．１。表３．１引物序列引物序列见３．３．４定量ＰＣＲ反应ＰＣＲ反应为两步法，试剂采用大连ＴａＫａＲａ公司的ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘ量ＰＣＲ试剂盒。其中ｅＤＮＡＰｒｅｍｉｘＥｘＧｒｅｅｎＥｘＴａｑＴＭ定１１３Ｉ此（１０倍稀释），引物１Ｌ（内含Ｔ￡ＫａＩｈｐＬ（终浓度０．２ｌａＭ），２ｘＳＹＢＲＴａｑＴＭ１２．５ＩｌＥｘＴａｑＨＳ，４×ｄＮＴＰｓ，Ｍ９２＋，ＳＹＢＲＩ等），加ＤＥＰＣ水至２５ｐＬ。按下列条件扩增：９５℃１０秒预变性，然后９５℃５秒，６０℃１５秒，７２℃１５秒，共４０个循环。分别由引物ＴＥＢ４和ＩＢ－Ａｃｔｉｎ进行ＰＣＲ，每个样品重复做两管。每次实验均设空白对照，空白对照为不加ＤＮＡ模板。标准曲线的制作：选取对照组未转染２９３细胞的ｃＤＮＡ样本做标准曲线。样本做ｌＯ倍的梯度稀释，选取５个梯度（１倍、１０倍、１００倍、１０．００倍、１００００倍），在扩增过程中，ＦＴＣ２０００荧光定量分析仪自动读出Ｃｔ值，并以模板浓度的对数值为横坐标，１７第３章方法Ｃｔ值为纵坐标，绘制出标准曲线。根据标准曲线计算样本ｍＲＮＡ的相对浓度：利用待测样本的Ｃｔ值（两个复管的平均值）求出相应的基因拷贝数，以待测基因的拷贝数与内参的拷贝数的比值作为检测结果，计算出ＥＧＦＰ．ＴＥＢ４、ＥＧＦＰ．ＲＮＡｉ、ＥＧＦＰ－Ｎ２以及ｐＳｕｐｅｒ－ＥＧＦＰ细胞内ＴＥＢ４基因的ｍＲＮＡ的相对表达量。３．４ＲＴ－ＰＣＲ方法检测各细胞模型组ＣＨＯＰ、ＧＲＰ７８、ＧＩ冲９４基因的表达３．４．１诱导２９３细胞发生内质网应激（１）细胞转染与分组：ＥＧＦＰ．ＴＥＢ４、ＥＧＦＰ－Ｎ２、ＥＧＦＰ．ＲＮＡｉ、ｐＳｕｐｅｒ－ＥＧＦＰ分别转染２９３细胞，依次记为：过表达组、过表达对照、干扰组、干扰对照（图３．１），３７℃，５％Ｃ０２细胞培养箱中培养。（２）培养４８小时后，每孔分别加入２９９／ｍＬ的衣霉素、２０ｒｔＭ／Ｌ的Ａｐ２５．３５和０．４１．ＬＭ／Ｌ的鱼藤酮培养液，３７℃继续培养。（３）按图３．１所示时间段收集各组细胞，标记。每组细胞均做两个复孔，条件完全相同。图３．１细胞分组ＥＧＦＰ－ＴＥＢ４ＥＧＦＰ－Ｎ２ＥＧＦＰ—ＲＮＡｉｐＳｕｐｅｒ·ＥＧＦＰ瞬时转染２９３细胞过表达组过表达对照干扰组干扰对照每转染组分别诱导内质网应激ｌ…·……｝＿…—一—］鱼藤酮Ａ－ｆｋ３ｊ收获细胞收获细胞衣霉素４小时１２，ｊ、时２４小时４８小时收获细胞收获细胞收获细胞收获细胞１８第３章方法３．４．２ｃＤＮＡ的获得提取细胞总ＲＮＡ（见３．３．１），逆转录合成ｅＤＮＡ（见３．３．２）。３．４．３引物设计各段引物的设计依据ＧＥＮＥＢＡＮＫ上检索到的已知基因序列设计，并经同源性比较以确定引物特异性。所有引物由上海申能博彩生物技术科技公司合成。引物序列见表３．２。表３．２引物序列３．４．４ＲＴ－ＰＣＲ反应ＲＴ－ＰＣＲ反应（见３．３．４）。３．５Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ＴＥＢ４基因过表达和干扰效果３．５．１试剂配制（１）蛋白裂解液：ＮａＣＩＯ．９９、ＴｒｉｓＥＤＴＡｌｍｌ、１０％ＮＰ－４０１０ｍｌ，ｄｄＨ２００．７９９、Ｎａ－ｄｅｏｘｙｃｈｏａｔｅ０．２５９、１００ｍＭ８０ｍｌ。用１ＭＨＣｌ调节ＰＨ值至７．４ｊ定容至１００ｍｌ。ｌＯｍｌ分装，４℃备用。（２）５ｘＴｆｉｓ－ＧｌｙｅｉｎｅＢｕｆｆｅｒ：＂Ｉｒｉｓ１５．１９＋Ｇｌｙｃｉｎｅ９４９＋ＳＤＳ５９，定容至ｌＬ，室温保存备用。（３）５ｘＳＤＳ—ＰＡＧＥＬｏａｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ：１Ｍ＂Ｉｒｉｓ—ＨＣＬ（ＰＨ６．８）１．２５ｍｌ，ＳＤＳ０．５９，ＢＰＢ２５ｍｇ，甘油２．５ｍｌ，定容至５ｍｌ，５００ｐＦ管分装，室温保存备用，使用前每５００ｕｌ中加入１３．巯基乙醇２５山。（４）膜转移缓冲液：强ｓ５．８９＋Ｇｌｙｃｉｎｅ２．９９＋ＳＤＳ０．３７９，定容至８００ｍｌ后，１９第３章方法加入２００ｍｌ甲醇，室温保存备用。（５）ＴＢＳＴＢｕｆｆｅｒ：ＩＭ＂Ｉｒｉｓ－ＨＣＬ（ＰＨ８．０）２０ｍｌ，ＮａＣｌ８．８９，Ｔｗｅｅｎ２００．５ｍｌ，搅拌混匀，定容至ｌＬ，４＂Ｃ保存备用。（６）ＳｔｒｉｐｐｉｎｇＳｏｌｕｔｉｏｎ：６０ｍＭＴｒｉｓ，２％ＳＤＳ，ＨＣＬ调节ＰＨ值至６．７，室温保存。用时每ｌＯｍｌ中加入Ｂ．巯基乙醇７０１．ｄ。３．５．２实验步骤３．５．２．１蛋白裂解液收获细胞ＥＧＦＰ．ＴＥＢ４、ＥＧＦＰ—ＲＮＡｉ、ＥＧＦＰ－Ｎ２和ｐＳｕｐｅｒ－ＥＧＦＰ细胞分别于６ｍｍ培养皿中，培养液ｌｍｌ／每孔，３７＂Ｃ，５％Ｃ０２细胞培养箱中培养４８小时，收获细胞。操作步骤如下：（１）用０．２５％胰酶消化细胞，分别收集各细胞于１．５ｍｌ离心管中。１００００ｒｐｍ，室温离心１分钟后弃上清。（２）加入ｌｍｌ冰冷的１×ＰＢＳ，反复吹打。（３）１２０００ｒｐｍ，４＂Ｃ离心１分钟，弃上清。（４）重复两次。（５）加入１００ｕｌ蛋白裂解液（含蛋白酶抑制剂），彻底悬浮，置于冰上１５．３０分钟。（６）．２０℃冷冻ｌ小时。（７）１３０００ｒｐｍ，４＂Ｃ离心１５分钟，吸取上清，转移至新的１．５ｍｌ离心管中。（８）分装，于一２０℃保存备用。３．５．２．２检测蛋白浓度试剂采用美国ＰｉｅｒｃｅＢＣＡＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙＫｉｔ蛋白定量试剂盒。按照表３．３制备标准曲线。表３．３制备ＢＳＡ标准曲线第３章方法标准曲线的制作，操作步骤如下：（１）待测蛋白样品和６种标准曲线试剂各取１０ｕｌ加入９６孔培养皿中，每个样品做两个复孔。（２）加入工作液（ＷｏｒｋｉｎｇＲｅａｇｅｎｔ，ＷＩｐＡ混匀。（３）避光３７℃孵育３０分钟。１０ｍｌ＋Ｂ０．２ｍ１）２００ｕｌ于９６孔板中，（４）待降至室温，用酶标仪５６２ｎｍ波长读取读数。（５）以吸光度的平均值为横坐标，浓度为纵坐标，绘制出标准曲线。（６）根据标准曲线计算样本蛋白的浓度。３．５．２．３Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ技术（１）按照表３．４配制ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳凝胶。蛋白样品上样约２５－３０９９／每孔：电泳条件：起始电压６０Ｖ，当示踪染料至浓缩胶时改为１２０Ｖ恒压电泳９０分钟。表３．４ＳＤＳ．ＰＡＧＥ电泳凝胶成分Ｈ２０３．３４．Ｏ２．５Ｏ．１Ｏ．１０．００４Ｈ２０３．４０．８３Ｏ．６３Ｏ．０５０．０５０．００５３０％丙烯酰胺１．５ｍ／１３０％丙烯酰胺ｌｍ／１Ｔｒｉｓ（ＰＨ６．８）Ｔｒｉｓ（ＰＨ８．８、ｌ１０％ＳＤＳｌＯ％ＡＰＳＴＥＭＥＤｌＯ％ＳＤＳ１０％ＡＰＳＴＥＭＥＤ（２）电转移：电泳结束后用夹心方法把滤纸、凝胶、ＰＶＤＦ膜、滤纸依顺序排放，用海绵布、筛孔板固定，插入电转移槽中，加入膜转移缓冲液；确保凝胶在阴极，ＰＶＤＦ膜在阳极方向。电转移条件１２０Ｖ，１．１．５小时。注意ＰＶＤＦ膜先于甲醇浸泡５秒，使其处于无机状态。（３）ＰＶＤＦ膜用丽春红快速染色，蒸馏水冲洗后ＴＢＳＴＢｕｆｆｅｒ缓冲液洗涤３次，每次５分钟。（４）ＰＶＤＦ膜置于５％脱脂奶粉的ＴＢＳＴＢｕｆｆｅｒ缓冲液中，室温封闭１小时。（５）一抗按表３．５稀释于含３％脱脂奶粉的ＴＢＳＴＢｕｆｆｅｒ缓冲液，ＰＶＤＦ膜孵育在含有一抗的杂交袋中，４℃过夜。（６）ＴＢＳＴＢｕｆｆｅｒ缓冲液洗涤ＰＶＤＦ膜３次，每次１０分钟。（７）二抗以１：１０００倍稀释于含３％脱脂奶粉的ＴＢＳＴＢｕｆｆｅｒ缓冲液，ＰＶＤＦ２１第３章方法膜置于在含有二抗的杂交袋中，除去气泡，室温孵育１小时。（８）ＴＢＳＴＢｕｆｆｅｒ缓冲液洗涤ＰＶＤＦ膜３次，每次１０分钟。（９）ＯｄｙｓｓｅｙＢＬＯＴ仪器扫描结果并保存。（１０）用ＳｔｒｉｐｐｉｎｇＳｏｌｕｔｉｏｎ洗ＰＶＤＦ膜，具体步骤如下：ＴＢＳ缓冲液洗涤ＰＶＤＦ膜２次，Ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ缓冲液５７＂Ｃ孵育２５分钟，ＴＢＳＴ缓冲液洗涤３次，每次１０分钟。表３．５一抗稀释比例３．６Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ方法检测各细胞模型组ＣＨＯＰ、ＧＲＰ７８、ＧＲＰ９４基因的表达３．６．１诱导２９３细胞发生内质网应激用终浓度为２肛ｇ／ｍＬ的衣霉素、终浓度为２０９Ｍ的Ａｐ２５－３５和终浓度为０．４９Ｍ的鱼藤酮诱导２９３细胞发生内质网应激（见３．４．１）。３．６．２细胞总蛋白的获得提取细胞总蛋白（见３．５．２．１），蛋白浓度测定（见３．５．２－２）。３．６．３Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法（见３．５．２．３）。３．７统计学处理所有数据均以均数士标准差（ｉ±ｓ）表示，ＳＰＳＳｌ３．０Ｔ检验分析各组数据。第４章结果第４章结果４１荧光显微镜下观察细胞转染结粜分别用ＥＯＦＰ－ＴＥＢ４、ＥＧＦＰ－Ｎ２、ＢＯＦＰ—ＲＮＡｉ及ｐＳｕＩ蜘－ＥＧＦＰ质粒转染入２９３细胞。转染４８小时后，荧光显徽镜下观察细胞表达绿色荧光蛋白的情况。在白光下这两种细胞形态完整清晰，活力较好。在激发光下，视野中的绝大多数细胞都发绿色荧光（图４１）。说明细胞已经成功转染。１２＾Ｃ互图４ＩＥＧＦＰ－ＴＥＢ４、ＥＧＦＰ－Ｎ２、ＥＧＦＰ－ＲＮＡｉ及ｐＳｕｐｅｒ－ＥＧＦＰ细胞荧光照片＾：ＥＧＦＰ－ＴＥＢ４细胞；Ｂ：ＥＧＦＰ－Ｎ２细胞；Ｄ。ｐＳｕｐｅｒ－ＥＧＦＰ细胞；Ａ２－Ｄ２：普通显徽镜：ｏＦ日３ＦＰ－ＲＮＡｉ细胞；Ａｌ·ＤＩ：荧光显徽镜４２总ＲＮＡ鉴定４２１％琼脂糖凝胶电泳检测总ＲＮＡ的完整性分别提取ＥＧＦＰ－ＴＥＢ４、ＥＧＦＰ－Ｎ２、ＥＧＦＰ－ＲＮＡｉ及ｐＳｕＩ把ｒ－ＥＧＦＰ４组细胞的总ＲＮＡ。电泳后２８ｓｒＲＮＡ和１８ｓｒＲＮＡ条带清晰，荧光强度之比接近２，提示ＲＮＡ保持较完整而未发生降解。电泳分析结果见图４．２。第４章结果●。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。——慷基皇：Ｌ—１２３４２８８１８８蚓４．２细胞株中总ＲＮＡ也泳踟ｌ：ＥＧＦＰ－ＴＥＢ４２：ＥＧＦＰ．Ｎ２３：ＥＧＦＰ＿ＲＮＡｉ４：Ｄｓｕｐｅｒ－ＥＧＦＰ４２２总ＲＮＡ纯度鉴定和定量取总ＲＮＡｌｕｌ稀释于４００ｕｌＤＥＰｃ水后测其ＯＤ２∞值ＲＮＡ浓度（ｕｇ／ｕ１）＝０［ｋｍＸ４０Ｘ４００／１０００ＲＮＡ各样品在２６０ｒ岫与２８０ｎｍ的光吸收值之比均约Ｉ．８，说明ＲＮ＾未发生降解及蛋白质污染。４３应用荧光定量ＰｅＲ方法检测过表达组和干扰组细胞中ＴＦ．Ｂ４的删＾表达以起始拷贝鼓的自然对数为横坐标，以循环阈值为纵坐标。每次实验均可得到一条严格的直线型标准曲线，性线相关系数＞０．蛾图４．３），实验准确性达到标准。对扩增产物进行溶解曲线分析和凝胶电泳，证明为特异性产物。３５３０詈２５２０ｌ５ＴａＲＮＡ表选盘ＴＥＢ４的标准曲线Ｐ４０．２１０ｌ－２．８８０２ｘＲ２＝ｎ９９８６图４．３同时以过表达组和干扰组细胞模型的ｃ洲＾为模板扩增肛Ａｃ硎和ＴＥＢ４（图４．４）。阻ＴＥＢ４／｝ＡＣＴＩＮ的表达量比值（图４．５）显示：ＥＧＦＰ－ＴＥＢ４过表达组第４章结果细胞模型中ＴＥＢ４ｍＲＮＡ表达量是其对照ＥＧＦＰ－Ｎ２的２．０２倍；而相对于对照组ｐＳｕｐｅｒ－ＥＧＦＰ，ＥＧＦＰ－ＲＮＡｉ干扰组细胞模型中ＴＥＢ４ｍＲＮＡ的抑制率是６２．９６％ａ确定了ＥＧＦＰ－ＴＥＢ４过表达组细胞模型中ＴＥＢ４基因过表达和ＥＧＦＰ－ＲＮＡｉ干扰组细胞模型中ＴＥＢ４的干扰效果，可以进行下面的实验。目４．４ＥＧＦＰ－ＴＥＢ４、ＥＧＦＰ－Ｎ２、ＥＧＦＰ－ＲＮＡｉ、ｐＳｕｐｅｒ－ＥＧＦＰ∞ｃＩ）ＮＡＨ为引物的扩增曲线●ＯＯＯＯ富；目赫《图４＋５如ＭＣＴＩＮ和ＴＥＢ４Ｅ６ＦＦ－Ｔ咧脚卜”阱Ｆ卜”“９嚣箩２９３细胞中ＴＥＩＭ／Ｂ－ＡＣＴＩＮ的ｍＲＮＡ表达量比值（ｉ±ｓ）４４４应用ＷｅｓｔｅｒｎＢＩｏｔ方法检测过表达组和干扰组细胞ＯＩＥａ４的蛋白表达４１蛋白含量测定以每孔吸光度的平均值为横坐标，浓度为纵坐标，每次实验均可得到一条严格的直线型标准曲线，性线相关系数＞０９８（图４６），实验准确性达到标准。第４章结果∞呻∞∞∞／／ｏ闰４．６蛋白测定标准曲线４４．２ＷｅｓｔｅｒｎＢＩｏｔ检测ＴＥＢ４蛋白表达情况一抗用ＴＥＢ４抗体（ｍａｒｌ—ＭＡＲＣＨ６）检测过表达组细胞模型和干扰组细胞模型中ＴＥＢ４蛋白表达情况（图４．７）。以ＴＥＢ４／ｐ．ＡＣＴＩＮ的表达量比值（图４８）显示：ＥＧＦＰ－ＴＥＢ４过表达组细胞模型中ＴＥＢ４蛋白表达量是其对照组ＥＧＦＰ－Ｎ２的１．１３倍；而相对于对照组ｐＳｕｐｅｒ－ＥＧＦＰ，ＥＧＦＰ－ＲＮＡｉ干扰组细胞模型中ＴＥＢ４的蛋白抑制率是６０．２８％。确定了Ｅ（３ＦＰ—ＴＥＢ４过表达组细胞模型中ＴＥＢ４基因过表达和ＲＮＡｉ干扰组细胞模型中ＴＥＢ４的干扰效果，可以进行下面的实验。ＴＥＢ４Ｊ—Ｊ—一ＡＣＴＩＮ矗＿一一目４ＥＧＦＰ－ＴＥＢ４７ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ检测ＴＥ８４的蛋白含量３：ＥＧＦＰ－ＲＮＡｉ４：ｐＳｕｐｅｒ－ＥＧＦＰ２：ＥＧＦＰ－Ｎ２曲ｌ２ｉｉｏ１８６￥０；０．４冒ｏ２“”一”““９’”５６”““１９鬻图４．８２９３细胞中ＴＥＢ４４｝ＡＣＴＩＮ的蛋白表达量比值（ｉ±ｓ）第４章结果４５衣霉素诱导的内质网应激ＲＴ－ＰＣＲ法检测衣霉素诱导细胞内质网应激时各组细胞ＣＨＯＰ、ＯＲＰ７￥、４５１ＧＲＰ９４基因的表达选择２１１９／ｍｌ的衣霉素分别作用于过表达组细胞模型和干扰组细胞模型２４小时和４８小时，荧光定量ＰＣＲ检测ＣＨＯＰ、ＯＲＰ７８、ＧＲＰ９４基因的ｍＲＮＡ表达。结果显示：在作用２４和４８小时后，干扰组细胞模型中ＧＲＰ７８、ＧＲＰ９４基因的表达明显高于其对照组（ｐ＜０．０５），且极明显高于过表达组细胞模型（ｐ＜００１）；过表达组细胞模型中ＧＲＰ７￥、ＧＲＰ９４基因的表达明显低于其对照组（ｐ＜Ｏ．０５），有显著性差异（图４．９－４．１０）；过表达组细胞模型中ＣＨＯＰ基因的表达明显低于其对照组（删．０５），且极明显低于干扰组细胞模型（ｐ＜ｏ．０１），有显著性差异（图４１１）。｜；；｜缸巨ｉｏ８『厂１ＨＩ”“跨址址簪蚓Ｉ山叫．第４章结果菖１譬０．９ｌ品器一０．Ｔｌ麓０．４图４１ＩＣＨＯＰ基田在表霉索作崩２４小时和４８小时后的ｍＲＮＡ表达餐（ｉ±ｓ）（’ｐ＜００５ｖｓｃｏｎｔｒ０６＃＃ｐ＜０叭ｖｓＴＥＢ４）４５２ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ方法检测衣霉素诱导细胞内质网应激时各组细胞ＣＨＯＰ、ＧＲＰ７８、ＧＲＰ９４基因的表达选择终浓度为２１ｔｇ／ｍｌ的衣霉素作用过表达组细胞模型和干扰组细胞模型２４小时和４８小时，检测ＣＨＯＰ、ＧＲＦＴ８、ＧＲＰ９４基因蛋白水平的表达（图４．１２）。结果显示，在作用２４小时后，过表达组细胞模型中ＧＲＰ７￥基因的表达明显低于其对照细胞（ｐ＜Ｏ．叭），干扰组细胞模型中ＧＲＰ７８、ＣＨＯＰ基因的表达明显高于过表达组细胞模型（ｐ锄．０１）．有极显著性差异：４８小时后过表达组细胞模型中ＧＲＰ７８、ＧＲＰ９４基因的表达明显低于其对照细胞（咖０５），干扰组细胞模型中ＧＲＰ７８、ＧＲＰ９４基因的表达明显高于过表达组细胞模型（ｐ＜００５），有显著性差异（图４１３．图４．１５）。一一ＨＣＨＯＰ＾ｃＴＩＮ２４ｈ４５ｈ图４１２ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ检蔫表霉素作用后的ＧＲＰ７９、ＧＲＰ９４和ＣＨＯＰ蛋白含量２：ＥＧＦＰ－Ｎ２３：ＥＧＦＰ－ＲＮＡｉ４ｉＩ：ＥＧＦＰｏＴＥＢ４ｐＳｕｐｅ∞－ＥＧＦＰ第４章结果｜｜；｜缸圉（ｉ±ｓ））举０＂３㈤圉善“４『。（ｉ±，）川一ＬＬ出．一圈４．１Ｓ孔ｚ｝２ｆ２ｈＥ：：：ｌｌ吲ｍｌＣＨＯＰ基因在衣霉素作用２４小时和４８小时后的蛋白表达量（ｉ±ｓ）（＃Ⅲ０５ｖｓＴＥＢ４）４６ＡＢ＂－３５蛋白诱导的内质网应激第４章结果瓣肌护鞭“圉塑！至堕墨——０Ｏ００●口口口一因０血图４．１８ＯＲＰ９４基因在ＡＢ２５郴作用４小时和２４小时后的ｍＲＮＡ表达董（ｉ±ｇ）（＃ｐ＜００５ｖｓＴＥＢ４）４６２Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测ＡＢ２Ⅲ蛋白诱导细胞内质嗣应激时各组细胞ＣＨＯＰ、ＧＲＰ７８、ＧＲＰ９４基因的表达Ａ赴”ｓ蛋白经３ＴＣ２４小时预处理后，以２０ＩＩＭ的终浓度分别作用于过表达组细胞模型和干扰组细胞模型４小时和２４小时，检测ＣＨＯＰ、ＧＲＰ７８、ＧＲＰ９４基因的蛋白表达情况（图４．１９）。结果显示：作用４小时后，过表达组细胞模型中ＣＨＯＰ基因的表达明显低于其对照组（ｐ＜００５），干扰组细胞模型中ＣＨＯＰ基因的表达明显高于其对照组（Ｐ（００５）和过表达组细胞模型（ｐ＜Ｏ０１）．有显著性差异（图４２６）；在作用２４小时后，过表达组细胞模型中ＧＲＰ７８基因的表达明显低于其对照组（ｐ＜００５），干扰组细胞模型中ＯＲＰ７８基因的表达明显高于其对照组（ｐ＜ｏ．０５）和过表达组细胞模型（Ｆ仉０５），有显著性差异（图４２１）；０ＲＰ９４基因的表达未受影响（图４．２２）。ＣＨＯＰ３ＲＰ７８３ＲＰ９４ＡＣＴＩＮ图４．１９ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ检测ＡｌＳ２５．３ｓ作用后的ＣＨＯＰ、ＯＲＰ９４和ＧＰ，Ｐ７８蛋白含量１：ＥＯＦＰ－ＴＥｑＢ４２：ＥＧＦＰ－Ｎ２３：ＥＧＦＰ－ＲＮＡｉ４：ｐｓｕｐｅｒ－ＥＧＦＰ第４章结果骖趾尉弘ｓ『霞ｆ警圈（ｉ±。）瓤岫圉（ｉ±。）ｉ｜｜；｜０．８㈣圉图４．２２ＯＲＰ９４基因在Ａ赴５ｄ５作用４小时和２４小时后的蛋白表达量（ｉ±ｓ）第４章结果４７鱼藤酮诱导的内质网应激４７１ＲＴ－ＰＣＲ法检测鱼藤酮诱导细胞内质同应激时各组细胞ＣＨＯＰ、ＧＲＰＴ８、ＧＲＰ９４基因的表达选择终浓度为０．６“Ｍ的鱼藤酮作用于过表达组细胞模型和干扰组细胞模型１２小时和２４小时，检测ＣＨＯＰ、ＧＲＰ７８、ＧＫＰ９４基因的ｍＲＮＡ表达量。结果显示，作用２４小时后，干扰组细胞模型中ＣＨＯＰ和ＧＲＦ７８基因的表达明显高于过表达组细胞模型（删０５），有显著性差异（图４２５－４２６），ＧＲＰ９４基因的表达未受影响（图４２４）。蘸㈣目蘸岫庐图４．２４ＧＲＰ７８基冈在鱼藤酮作用１２小时和２４小时后的ｎｌＲＮＡ表达量（ｉ±ｓ）（＃Ｄ哪０５ｖｓＴＥＢ４）第４章结果１ｌＯ０００一≥型鞋霉００ｉｌｄ‰（＃ｐ＜００５”ＴＥＢ４）２６）。图４２５ＣＨＯＰ基因在鱼藤酮作用１２小时和２４小时扁的ｍＲＮＡ表达量（ｉ±ｓ）４７２Ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔ检测鱼藤酮诱导细胞内质网应激时各组细胞ＣＨＯＰ、ＧＲＰ７８、ＧＲＰ９４基因的表达选择终浓度为０．６ｐＭ的鱼藤酮作用于过表达组细胞模型和干扰组细胞模型１２小时和２４小时，检测ＣＨＯＰ、ＧＲＰ７９、ＧＲＰ９４基因的蛋白表达量（图４结果显示，ＣＨＯＰ、ＧＲＰ７８和ＧＲＰ９４基因的表达均未受影响（图４．２７４２９）。Ｇ即叫ＧｐＰ７８图４．２６ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ检测鱼藤酮作用后的ＣＨＯＰ、ＧＲＰ９４和ＧＲＰ７８蛋白古量２：ＥＧＦＰ－Ｎ２３：ＥＧＦＰ－ＲＮＡｉＩ：ＥＧＦＰ－ＴＥＩＭ４：ｐＳｕｐｅｒ－ＥＧＦＰ第４章结果幽４２７图４２８要［蠹岫皿圉刨４２９ＣＨＯＰ基因在鱼藤酮作Ｊ｛ｊ１２小时和２４小时后的蛋白表达量（ｉ±ｓ）第５章讨论第５章讨论神经退行性疾病是老年人常见病，主要有多巴胺能神经元退化造成的帕金森病和胆碱能神经元退化引起的阿尔茨海默病。错误折叠蛋白沉积是许多神经退行性疾病的共同特征，神经细胞内错误折叠蛋白的聚集影响了神经信号传递及轴突运输，并激活了与细胞死亡等有关的细胞内的信号通路。本课题旨在研究ＴＥＢ４截短体蛋白的表达变化对神经细胞的影响，从一个全新的侧面探讨神经退行性疾病的相关发病机制，为其进一步研究提供依据。泛素连接酶Ｅ３是泛素化反应中起关键作用的酶１２２１。所有的Ｅ３都具有高度的底物特异性。蛋白质翻译后特定的修饰经常作为其相应泛素连接酶Ｅ３识别的标志。环指结构为Ｅ２和底物提供居留位点从而使Ｅ２催化泛素转移到底物上田】。许多含有Ｃ３ＨＣ４的环指结构的蛋白已经发现具有Ｅ３连接酶活性，包括酵母Ｄｏａｌ０和人ＭＡＲＣＨ蛋白。ＴＥＢ４也属于ＭＡＲＣＨ蛋白，游离的ＴＥＢ４环指结构在体外可催化泛素ｋ４８（４８位点赖氨酸）特异的反应，并涉及泛素交联酶Ｕｂｃ６和Ｕｂｃ７。一些神经退行性疾病与泛素蛋白酶体参与的相关蛋白的水解有关，其中包括内质网相关蛋白的降解。内质网是真核细胞中蛋白质翻译合成和细胞内钙离子的储存场所，对细胞应激反应起调节作用。内质网内未折叠蛋白的堆积，钙离子失稳等多种因素可触发内质网应激的发生，通过非折叠蛋白应答能够促进蛋白质的正常折叠或降解异常折叠的蛋白质。Ｈａｓｓｉｎｋ，ＧＥｅ］等人曾用１０ｐｇ／ｍｌ衣霉素分别处理细胞４小时和８小时，从而抑制内质网内糖蛋白的正常折叠。实验结果显示，Ｄｏａｌ０和Ｈｒｄｌ／Ｄｅｒ３的表达量有显著差异。在酵母中，Ｄｏａｌ０和Ｈｒｄｌ／Ｄｅｒ３是已经确定的两种Ｅ３连接酶，Ｄｏａｌ０的缺失导致内质网未折叠蛋白堆积引起轻微的应激反应，若同时缺失Ｄｏａｌ０和Ｈｒｄｌ，应激反应将会进一步恶化。这些表明，Ｄｏａｌ０是酵母ＥＲ应激和降解途径中的重要成分。基于帕金森病易感性模型，我们从ＰＤ脑黑质（ＳＮ）获得单一的含路易小体（ＬＢ）的和不含ＬＢ的多巴胺（ＤＡ）能神经元并进行ＲＮＡ指纹图表达谱的分析【１８１，发现ＴＥＢ４截短体片段在ＰＤ脑黑质区不含ＬＢ的ＤＡ能神经元表达高于含ＬＢ的相应细胞。ＴＥＢ４是一个比较新的基因，已经确定它具有Ｅ３连接酶活性，与Ｄｏａｌ０高度同源。为什么ＴＥＢ４截短体基因在无路易小体的多巴胺能神经细胞高表达，这种截第５章讨论短体的表达产物已经删除了Ｃ３ＨＣ４环指结构域，是否仍然具有泛素连接酶活性？是否参与内质网相关应激途径的蛋白降解？其在神经细胞中有何作用？与神经退行性疾病有何关系？基于神经退行性疾病（ＳＣＡ、ＰＤ、ＨＤ、ＡＤ等）的发病可能具有部分共有的机制，我们以期通过神经细胞模型探讨ＴＥＢ４截短体在神经元细胞中的作用。本实验利用实验室成功构建的ＴＥＢ４表达载体和ＲＮＡ干扰载体瞬时转染人胚肾２９３细胞，建立ＴＥＢ４干扰和过表达细胞模型，以鱼藤酮、衣霉素和ＡＤ２５．３５分别诱导细胞ＥＲ应激，检测ＥＲ应激相关因子的表达，借以推测ＴＥＢ４与ＥＲ相关应激途径的关系，进一步研究其在神经细胞中的作用。本实验检测的ＥＲ应激指标——ＧＲＰ７８、ＧＲＰ９４和ＣＨＯＰ是内质网应激的标志性蛋白，很多文献报道上述三种指标与ＥＲ应激密不可分。它们已经成为研究ＥＲ应激不可或缺的途径之一。衣霉素是一种蛋白质Ｎ一糖基化作用抑制剂，通过抑制天门冬酰胺连接的多糖合成过程中ＧＰＴ（乙酰氨基葡萄糖－ｌ－Ｐ－转移酶）活性来抑制糖蛋白的合成Ｈ们。由于糖基化作用对蛋白的折叠和可溶性非常重要，并且多数分泌蛋白是Ｎ一糖基化蛋白，所以它是目前常用的内质网应激诱导剂，尤其在体外研究中，广泛应用于对细胞内质网应激反应性细胞凋亡的机理研究、各种致病因素与内质网凋亡途径之间的关系研究等Ｈ７１。在衣霉素诱导的ＥＲ应激中，我们选择２４小时和４８小时这两个常用时间段进行研究。ＧＲＰ７８和ＧＲＰ９４基因４８小时的ｍＲＮＡ和蛋白表达量均高于２４小时，并且干扰组细胞模型中ＧＲＰ７８和ＧＲＰ９４基因无论ｍＲＮＡ水平还是蛋白水平的表达量都明显高于过表达组细胞模型。ＣＨＯＰ基因４８小时的ｍＲＮＡ和蛋白表达量明显低于２４小时，作用２４小时后，干扰组细胞模型中ＣＨＯＰ无论ｍＲＮＡ水平还是蛋白水平的表达量都明显高于过表达组细胞模型；４８小时后，ＣＨＯＰ的表达均无明显差异。结果显示，衣霉素诱导的ＥＲ应激中，ＴＥＢ４截短体蛋白影响上诉三种基因尤其是ＧＲＰ７８、ＧＲＰ９４的表达。在应激条件下，未折叠蛋白在内质网腔内积聚，ＧＲＰ７８／Ｂｉｐ与未折叠蛋白的亲和力高于跨膜蛋白，跨膜蛋白与ＧＲＰ７８／Ｂｉｐ分离而被激活，同时引起内质网应激元件基因启动子区域激活【３引，这些基因包括ＧＲＰ７８／ＢｉＰ、ＧＲＰ９４和蛋８－硫键异构酶（ｐｒｏｔｅｉｎｄｉＳＨｌｆｉｄｅｉｓｏｍｅｒａｓｅ，ＰＤＩ）等分子伴侣蛋白及生长停滞及ＤＮＡ损伤基因（ｇｅｎｅｆｏｒｇｒｏｗｔｈａｒｒｅｓｔａｎｄＤＮＡ第５章讨论ｄａｍａｇｅ，ＣＨＯＰ／ＧＡＤＤｌ５３）１３９１。ＧＲＰ９４是热休克蛋白９０家族的主要成员，抑制蛋白质翻译，减少蛋白质在内质网腔内的堆积，从而对细胞起保护作用，恢复蛋白质正确构像。本实验中，随着毒素作用时间增加，ＥＲ应激相关因子ＧＲＰ７８、ＧＲＰ９４的表达量也上调，说明ＥＲ应激压力逐渐增强，而ＴＥＢ４过表达组细胞模型中ＧＲＰ７８、ＧＩ冲９４的表达量的上调幅度都相对于对照组和干扰组细胞模型明显减小，ｍＲＮＡ和蛋白的检测结果很相似。推测过表达的ＴＥＢ４截短体可能早期通过某些途径调解蛋白降解，减缓了内质网应激压力，从而使ＧＲＰ７８、ＧＩ冲９４表达下调。在作用２４小时后，过表达组细胞模型中ＣＨＯＰ基因ｍＲＮＡ水平的表达量上调幅度明显小于其对照组和干扰组。ＣＨＯＰ基因于４８小时表达量很低，没有发现其表达差异。ＡＢ一淀粉样蛋白（ＡＢ）是阿尔茨海默病患者脑中老年斑的主要成分【４Ｉｌ，由淀粉样前体蛋白经Ｂ一分泌酶途径代谢产生，已有大量研究证明Ａ１３具有神经毒性。Ａ１３２５－３５是从其前体蛋ｔ刍ＡＰＰ上酶切下来的小肽，这一过程可在ＥＲ中进行。ＡＰＰ也属Ｉ型跨膜蛋白，在正常细胞中，分子伴侣蛋白ＢｉＰ可与ＡＰＰ结合，抑制Ａｐ２５．３５的产生［４３】。研究发现Ａ１３２５－３５可通过ＥＲ途径介导细胞的ＥＲ应激和凋亡。Ａｐ２５－３５－－个显著毒性作用是使细胞内钙离子系统紊乱，激发ＥＲ内Ｃａ２＋向胞浆释放【３羽，ＥＲ内的Ｃａ寸耗竭可诱发ＥＲ应激，而进入胞浆的Ｃａ２＋可激活钙蛋白酶，钙蛋白酶再激活ｃａｓｐａｓｅ－１２ｉＪＩ起细胞凋亡㈣。另外，许多分子伴侣蛋白如ＧＰＲ７８等都是Ｃａ２＋结合蛋白【４５１，ＥＲ内的Ｃａ２＋耗竭可以影响这些蛋白质的功能进而影响蛋白质的折叠过程，加重ＥＲ应激，导致细胞损害。在ｇｐ２５．３５蛋白诱导的内质网应激中，ＣＨＯＰ基因无论ｍＲＮＡ水平还是蛋白水平２４小时的表达量均明显低于４小时的表达量，且作用４小时后，干扰组细胞模型中ＣＨＯＰ基因的ｍＲＮＡ水平和蛋白水平的表达量明显高于过表达组细胞模型。Ｇｌ心７８基因ｍＲＮＡ水平表达量２４小时高于４小时，而蛋白水平表达量２４小时略低于４小时；Ａ艮５－３５作用２４小时后，过表达组细胞模型中ＧＲＰ７８基因的ｍＲＮＡ水平和蛋白水平的表达量明显低于干扰组细胞模型。该毒素对ＧＲＰ９４基因的表达的影响不明显。结果显示，Ａ陀５－３５诱导的内质网应激中，ＴＥＢ４截短体蛋白影响ＣＨＯＰ和ＧＲＰ７８基因的表达。ＣＨＯＰ的激活是内质网应激反应的直接结果，也是内质网应激最早期的参与蛋白之一，在非应激状态下，它的表达水平很低，而在内质网应激中，其表达量大大增加。有文献报道，ＣＨＯＰ的过表达导致细胞周期阻滞和第５章讨论细胞凋亡，而ＣＨＯＰ的缺失可使细胞避免内质网应激诱导的凋亡。ＣＨＯＰ促进凋亡的机制包括下调Ｂｃｌ－２表达、耗竭谷胱甘肽、促进反应氧族产生等；ＡＴＦ６及ＰＥＲＫ活化后能选择性诱导ＣＨＯＰ表达［４０ｌ，目前认为伴侣蛋白ＢｉＰ的上升能够阻碍细胞发生凋亡，但ＣＨＯＰ表达上调同时使细胞作好凋亡的准备，当不利因素持续存在、ＥＲＳ过于强烈时，细胞就发生凋亡。在内质网应激中，ＣＨＯＰ在凋亡信号通路中处于ｃａｓｐａｓｅｌ２及ｃａｓｐａＳｅ９的上游，其表达变化也早于ｃａｓｐａｓｅｌ２和ｃａｓｐａｓｅ９的激活【４２。。ＣＨＯＰ表达升高是ＥＲ应激的标志。结合前期实验结果与文献资料，我们把Ａｐ２５－３５的作用时间点设定为４小时和２４小时。在Ａｐ２５．３５作用４小时后ＣＨＯＰ基因ｍＲＮＡ和蛋白表达量都大大增加，此时过表达细胞模型中ＣＨＯＰ基因ｍＲＮＡ水平和蛋白水平的表达量相对于过表达对照组和干扰组细胞模型明显减小。结合前期实验结果，推测２０肛Ｍ的ＡＢ２５－３５作用２９３细胞４小时时，ＣＨＯＰ表达量达到高峰，并且过表达的ＴＥＢ４截短体蛋白对ＣＨＯＰ的调解作用在此时尤其显著。ＴＥＢ４截短体蛋白在此过程中也影响ＧＲＰ７８基因的表达。当ＥＲ应激发生后，ＴＥＢ４截短体可能参与某一个或几个途径的蛋白降解，减缓了ＥＲ应激，使ＧＲＰ７８表达量上调幅度减小。当用Ａ１３２５．３５蛋白作用２９３细胞时，与ＴＥＢ４具有相似环指结构的Ｅ３连接酶Ｐａｒｋｉｎ，其过表达基因对ＥＲ应激时ＧＲＰ７８基因的上调也有缓解作用１４６］。综合上述结果，ＴＥＢ４截短体蛋白对衣霉素和Ａ艮５．３５引起的细胞损伤可能具有保护作用，ＴＥＢ４截短体蛋白可能通过缓解细胞ＥＲ应激而进一步发挥保护作用的，ＴＥＢ４截短体蛋白影响了内质网应激相关基因ＧＲＰ７８、ＧＲＰ９４和ＣＨＯＰ的表达，缓解了内质网应激的压力。但其具体参与的途径还有待进一步研究。鱼藤酮可诱导多巴胺神经元细胞内泛素化ａ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ聚集，继而引起细胞死亡，选择性损伤多巴胺神经元ｐ５１。细胞内异常蛋白的处理、降解过程在一定程度上依赖于泛素．蛋白酶体系统和分子伴侣参与。它可选择性抑制细胞内线粒体复合酶Ｉ，线粒体功能障碍无疑造成生物能量不足，使ＵＰＳ不能正常降解ａ．ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ蛋白进而导致细胞内这种异常蛋白的逐渐聚集。研究证实无论是在大鼠体内还是在体外神经细胞内，鱼藤酮抑制复合物均可导致蛋白质羰基含量增加，而羰基是氧化应激的标志之一［３６１。鱼藤酮作为呼吸链抑制剂，已广泛用于建立细胞损伤模型。鱼藤酮诱导的内质网应激中，ＣＨＯＰ、ＧＲＰ９４和ＧＲＰ７８基因无论ｍＲＮＡ水平和蛋白水平的表达量均为１２小时高于２４小时。仅２４小时后过表达组细胞模３９第５章讨论型中ＣＨＯＰ和ＧＲＰ７８基因的ｍＲＮＡ表达量明显低于干扰组细胞模型的表达量，ＣＨＯＰ和ＧＲＰ７８基因各组问的蛋白水平表达量以及ＧＲＰ９４基因各组间的ｍＲＮＡ水平和蛋白水平的表达均未受该毒素的影响。本实验中，鱼藤酮作用下的ＥＲ应激相关因子的表达差异不显著，可能鱼藤酮作用剂量和浓度略有偏差，没有成功诱导出应激模型，我们期望下次的实验中继续摸索。由上述ＥＲ应激结果推测，ＴＥＢ４截短体基因可能具有多巴胺能神经元的保护作用，而且ＴＥＢ４在ＰＤ同一脑区的差异表达可能与路易小体的形成有关。路易小体，作为ＰＤ诊断的金标准之一，由异常磷酸化、泛素化蛋白聚集而形成，与ＥＲ应激相关。ＴＥＢ４截短体在多巴胺能神经元的高表达推测可能拮抗缓冲ＥＲ应激，促进异常蛋白的加工，从而抑制路易小体的形成。ＴＥＢ４截短体在脑中发挥神经保护功能的具体作用机制，还有待进一步研究。接下来，本课题还有很多工作要做，对于ＴＥＢ４的研究还在继续，本试验为进一步研究ＴＥＢ４的功能打下了良好的基础。⑨第二部分载体构建摘要摘要目的：分别构建ＡＴＰ合酶ＦＯ亚基Ｃ６亚单位（ＡＴＰｓｙｎｔｈａｓｅＦ０ｓｕｂｕｎｉｔ６，ＡＴＰ．Ｃ６）及人膜相关蛋白ＴＥＢ４截短体基因Ｃ末端大片段（ＴＥＢ４－Ｃ）的重组载体。方法：ＰＣＲ法扩增ＴＥＢ４一Ｃ，经纯化、双酶切后克隆入ｐＥＧＦＰ－Ｎ２载体，构建重组质粒ｐＥＧＦＰ．ＴＥＢ４．Ｃ，酶切和测序进行鉴定；同样，ＡＴＰ．Ｃ６克隆入ｐＣＭＶ．ＨＡ载体，构建ｐＣＭＶ．ＨＡ．ＡＴＰ．Ｃ６的重组质粒，酶切和测序进行鉴定。结果：双酶切重组质粒获得特定的酶切图谱，证实所合成核酸片段的正确重组：测序结果显示重组核酸片段序列与设计的序列完全相同。结论：成功构建了人膜相关蛋白ＴＥＢ４截短体基因大片段重组质粒ｐＥＧＦＰ—ＴＥＢ４．Ｃ和ＡＴＰ合酶ＦＯ亚基Ｃ６亚单位的重组质粒ｐＣＭＶ．ＨＡ．ＡＴＰ．Ｃ６，为下一步ＴＥＢ４功能域的研究打下基础。关键词：ＴＥＢ４，ＡＴＰ合酶，载体构建４１ＡＢＳＴＲＡＣＴＡＢＳＴＲＡＣＴｏｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔａｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｖｅｃｔｏｒｗｉｔｈｔｈｅＡＴＰｓｙｍｈａＳｅＦＯｓｕｂｕｎｉｔｃｏｎｓｔｒｕｃｔ６（ＡＴＰ－Ｃ６）ａｎｄｆｒａｇｍｅｎｔ（ＴＥＢ４－Ｃ）．ＭｅｔｈｏｄｓＨｕｍａｎａｎｏｔｈｅｒｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｖｅｃｔｏｒｗｉｔｈＴＥＢ４ｌａｒｇｅＴＥＢ４－ＣｗａｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙＰＣＲｍｅｔｈｏｄａｎｄｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏｔｈｅｖｅｃｔｏｒｐＥＧＦＰ－Ｎ２，ｒｅｓｕｌｔｉｎｇｉｎｐＥＧＦＰ－ＴＥＢ４一Ｃ；嘶ｔｌｌｔｈｅｓａｍｅｍｅｔｈｏｄ，ＡＴＰ—Ｃ６ＷａｓｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏｔｈｅｖｅｃｔｏｒｐＣＭＶ－ＨＡ．ＲｅｓｕｌｔｓＳｐｅｃｉｆｉｃｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅｍａｐｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍｄｏｕｂｌｅｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎ，ｖｅｒｉｆｉｅｄｃｏｒｒｅｃｔｎｅｓｓｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄｎｕｃｌｅａｔｅｆｒａｇｍｅｎｔ；ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｓｈｏｗｅｄｉｄｅｎｔｉｔｙｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｎｕｃｌｅａｔｅｆｒａｇｍｅｎｔａｎｄｔｈｅｄｅｓｉｇｎｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅ．１１１ｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆｐＥＧＦＰ－ＴＥＢ４－Ｃｗｅｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ１１１ｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｓｐＥＧＦＰ－ＴＥＢ４一Ｃｗｅｒｅｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ；ｔｈｉｓｒｅｓｅａｒｃｈｉｓｆｏｕｎｃｔｉｏｎｏｆＴＥＢ４．ａａｎｄｐＣＭＶ－ＨＡ－ＡＴＰ－Ｃ６ａｎｄｐＣＭＶ－ＨＡ—ＡＴＰ—Ｃ６ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｔｈｅｓｔｕｄｙｏｎｔｈｅＫｅｙＷｏｒｄｓ：ＴＥＢ４，ＡＴＰ，ｖｅｃｔｏｒ４２第１章材料第１章材料１．１质粒ｐＣＭＶ．ＨＡ为本实验室保存ｐＥＧＦＰ－Ｎ２为本实验室保存１．２主要仪器及物品超净工作台：吴江市江南净化工程有限公司高速冷冻离心机：Ｂｉｏｆｕｇｅ１５Ｒ，ＨｅｍｃｕｓｓｅｐａｔｃｈＳｐｅｅｄＶａｃＲＰｌｕｓＳＣｌｌＯ，ｓａｖａｎｔ紫外投射仪：上海长明光学电子仪器厂凝胶成像系统：ＵＶＰＰＣＲ仪：ＰＥＲＫＩＮＥＬＭＥＲ，Ｂｉｏ．Ｒａｄ公司电子天平：ＤｅｌｔａＲａｎｇｅ水浴箱：ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ紫外分光光度计：ＤＵＲ６４０Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ，ｂｅｃｍａｎ电泳仪：江苏兴化市分析仪器厂１．３主要试剂及试剂盒Ｍ．ＭＬＶ逆转录酶：Ｐｒｏｍｅｇａ公司Ｔ４ＤＮＡＬｉｇａｓｅ：ＴａＫａＲａ公司限制性内切酶：ＴａＫａＲａ公司ＤＮＡ凝胶回收试剂盒：Ｑｉａｇｅｎ公司质粒小量抽提试剂盒：上海博光生物公司Ｔａｑ酶、ｄＮＴＰ、ＲＮＡ酶抑制剂、ＬｏａｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ：ＴａＫａＲａ公司普通ＰＣＲ所用引物由上海Ｉｖｉｔｒｏｇｅｎ公司合成４３第２章方法第２章方２．１引物设计法各段引物的设计依据ＧＥＮＥＢＡＮＫ上检索到的已知基因序列设计。ＡＴＰ－Ｃ６基因ｃＤＮＡ全长５’引物和全长３’引物序列分别添加ＥｃｏＲ，和Ｘｈｏ，酶切位点；ＴＥＢ４截短体基因片段５’引物和３’引物序列分别添加ＥｃｏＲ，和ＢａｍＨＩ酶切位点。引物序列见表３．１。表３．１引物序列２．２２．２．１ＡＴＰ．Ｃ６的克隆ＰｅＲ反应ｂｕｆｆｅｒ５ｐｌ，ｄＮＴＰ反应体系为５０山，取人脑ｅＤＮＡｌ山为模板，１０ｘＰＣＲ（２．５ｍＭ）２ｍ，引物混合物（１０１ｘＭ）２山，Ｔａｑ酶０．５１ｘｌ，最后加水至总体积５０ｍ。循环程序为：９４。Ｃ预变性５分钟，９８。Ｃ变性１０秒，５５＂Ｃ退火１５秒，７２。Ｃ延伸２分钟，反应３０个循环。取ＰＣＲ产物５山于１％琼脂糖凝胶检测。２．２．２ＰＯＲ产物纯化ＰＣＲ产物用ＤＮＡｇｅｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ试剂盒割胶回收。操作步骤：将全部ＰＣＲ产物电泳。电泳后在紫外灯将所需的片段割胶置于１．５ｍｌ的离心管中。将割下来的胶称重。加入ＢｕｆｆｅｒＱＧ于５０＂Ｃ融胶ｌＯ分钟。加入的ＢｕｆｆｅｒＱＧ的量根据胶的重量而定，一般为胶的重量的３倍（如胶的重量为１００ｍｇ，则加入的ＢｕｆｆｅｒＱＧ的量为３００９１）。融胶后按胶的重量ｌ：ｌ加入异丙醇（如胶的重量为１００ｍｇ，则加入的异丙醇的量为１００ｌ＿ｔ１）。将溶液上柱后离心，１３０００９离心１分钟。弃流出液。再加ＢｕｆｆｅｒＱＧＯ．５ｍｌ洗涤层析柱。１３０００９离心１分钟。弃流出液。加ＢｕｆｆｅｒＰＥ０．７５ｍｌ洗涤层析柱。１３０００９离心１分钟。弃流出液。空柱１３０００９离心１分钟。换收集管。３０Ｉ－ｔｌｄｄｎ２０上柱洗脱。洗脱样品即第２章方法为纯化的ＰＣＲ产物。２．２．３酶切及其纯化用ＥｃｏＲ１和ＸｈｏＩ双酶切纯化的ＰＣＲ产物和ｐＣＭＶ－ＨＡ载体。酶切反应体系：质粒３０Ｉ．ｔｌ，１０ｘＢｕｆｆｅｒＨ４ｐｌ，ＥｃｏＲ，２“ｌ，Ｘｈｏ１２Ｉ－ｔｌ，加ｄｄＨ２０至４０ｐｌ。３７＂Ｃ，酶切４小时。将ＡＴＰ．Ｃ６的ＰＣＲ酶切产物和ｐＣＭＶ－ＨＡ载体的酶切产物用ｌ％琼脂糖凝胶电泳。割胶回收各自所需片段。操作步骤同３．１．３。２．２．４连接反应将上述两个割胶回收的产物混合，真空干燥至５ｍ，加入Ｔ４连接酶１山，Ｔ４连接酶ｂｕｆｆｅｒｌｐＩ，最后加ｄｄＨ２０至总体积１０ｐｌ。１６＂Ｃ，连接过夜。２．２．５感受态细胞的制备（Ｉｎｏｕｅ法）２．２．５．１准备Ｉｎｏｕｏ转化缓冲液２．２．５．１．１配制０．５ｍｏｌ／１的ＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．７）将１５．１９ＰＩＰＥＳ【哌嗪一Ｎ，Ｎ’一双（２一乙磺酸）】溶于８０ｍｌｄｄＨ２０中（Ｍｉｌｌｉ—Ｑ级，或与之相当级别的），用５ｍｏｌ／１ＫＯＨ调ｐＨ值至６．７，最后加ｄｄＨ２０，定容至１００ｍｌ。用０．２０ｐｍ孔径的滤膜过滤除菌。分成小份于－－２０℃保存。２．２．５．１．２配制Ｉｎｏｕｅ转化缓冲液将表３．２中组分分溶于８００ｍｌｄｄＨ２０中，然后加入２０ｍｌ０．５ｍｏｌ／ｌ的ＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．７），定容至１Ｌ。用０．２２｝ｕｎ孔径的滤膜过滤除菌。分装成小份，于一２０℃保存。表３．２ｌｎｏｕｅ转化缓冲液的配方２．２．５．２制备感受态细胞挑取一个经３７。Ｃ培养１６＂－－２０小时平皿上的ＤＨ５０单菌落（２一－－３ｍｍ直径），接种至２５ｍｌＳＯＢ培养液中，３７＂Ｃ摇床（２５０－－一３００ｒ／ｍｉｎ）培养６～８小时。晚上约６点钟，将上述初始培养物接种于三个２５０ｍｌＳＯＢ培养液中，第一个加１０ｍｌ，４５第２章方法第二个加４ｍｌ，第三个加２ｍｌ，于１８＂－２２＂Ｃ中速摇床过夜。次日早上，测量三瓶培养物的ＯＤ６００值，每４５分钟测定一次。当有一瓶的培养物ＯＤ６００＝０．５５时，将该瓶培养物置于冰上１０分钟，弃去另两瓶培养物。于４。Ｃ以２５００９离心１０分钟收集细菌。倒去上清培养液，将离心管倒扣在吸水纸上２分钟以吸干剩余液体。加８０ｍｌ预冷的Ｉｎｏｕｅ转化缓冲液重悬细菌沉淀。于４。Ｃ以２５００９离心１０分钟收集细菌。倒去上清培养液，将离心管倒扣在吸水纸上２分钟以吸干剩余液体。用２０ｍｌ预冷的Ｉｎｏｕｅ转化缓冲液轻轻重悬沉淀。加１．５ｍｌＤＭＳＯ。轻轻混匀细菌悬液，放置冰上１０分钟。迅速将悬液分装到遇冷的无菌１．５ｍｌ离心管中，没入液氮中快速冰冻感受态细胞。贮存于．７０℃备用。２．２．６重组质粒的转化与筛选取ＤＨ５０感受态细胞５０ｍ，加入连接反应液５０ａ，轻轻摇匀，冰浴３０分钟，４２℃热休克９０秒，迅速置于冰上２分钟，加入ＳＯＣ培养基４００９ｌ，３７℃温和振摇４５分钟。用无菌涂布棒分别将２００１ｄ、５０１ｄ转化的菌液涂布在ＬＢ平板（含有１０１土ｇ／ｍｌ氨苄青霉素）。３７℃平放２０分钟，然后倒置培养１２＂１６小时后，置于４。Ｃ使其显色完全。２．２．７质粒的抽提从过夜的转化培养平板上挑取单菌落接种于含１０１．Ｌｇ／ｍｌ氨苄青霉素的５ｍｌＬＢ液体培养基中，３７℃摇床（１５０ｒ／ｒａｉｎ）振摇１２＂－－１６小时。质粒抽提按上海博光生物技术有限公司质粒小抽试剂盒操作流程进行。操作步骤如下：将５ｍｌ过夜培养物３０００ｒｐｍ离心，使细菌沉淀，弃上清。用２５０斗１溶液Ｉ充分重悬细菌沉淀并转移到１．５ｍｌ离心管，重悬后应无可视沉淀。加入２５０１－ｔ１溶液ＩＩ，立即轻轻颠倒４～６次，至溶液澄清。加入３５０ｐ１溶液ＩＩＩ，立即轻轻颠倒４＂－６次，有絮状沉淀出现。冰浴１０分钟。１３０００ｒｐｍ离心１０分钟，将离心后得到的上清转移到吸附柱中，离心１分钟，弃收集管中的液体。用５００ｐ１ＢｕｆｆｅｒＳＢ洗涤吸附柱，１３０００ｒｐｍ离心１分钟，弃收集管中的液体。用５００山溶液Ⅳ洗涤吸附柱，１３０００ｒｐｍ离心１分钟，弃收集管中的液体。再重复一次。继续离心１分钟以除去残余的溶液Ⅳ。将吸附柱转到１．５ｍｌ离心管中，加入４０１ｄｄｄＨ２０洗脱ＤＮＡ，放置１分钟，１３０００ｒｐｍ离心１分钟，收集洗脱液，－２０℃保存。２．２．８酶切鉴定重组质粒‘利用ＥｃｏＲＩ和ＸｈｏＩ酶切检测重组质粒。酶切反应体系：重组质粒４９ｌ，１０ｘＢｕｆｆｅｒＨｌｉｄ，ＥｃｏＲ／和Ｘｈｏ，各０．５Ｉａｌ，加水至１０１且ｌ。第２章方法３７℃酶切４小时。ｌ％琼脂糖凝胶电泳检测重组质粒插入片段大小。由上海生工科技有限公司测序。测序所得的序列与Ｇｅｎｂａｎｋ的已知核苷酸序列进行同源性比较。２．３ＴＥＢ４截短体基因大片段的克隆按照上述基因克隆的方法将ＴＥＢ４截短体基因大片段ＴＥＢ４一Ｃ克隆到真核表达载体ＥＧＦＰ－Ｎ２上。４７第３章结果第３章结果３１ＡＴＰ－Ｃ６和ＴＥＢ４－Ｃ基因的ＰＣＲ扩增结果ＡＴＰ－Ｃ６基因扩增产物在琼脂塘凝胶６８１ｂｐ＾希显示为ｌ条带，与ＡＴＰ－Ｃ６基因预计大小一致（图３Ｉ，Ａ）；ＴＥＢ４一Ｃ基因扩增产物在琼脂塘凝胶１２０６ｂｐ左右显示为ｌ条带，与ＴＥＢ４一Ｃ基因预计大小一致（图３ｌ，Ｂ）。２１２２０００１０Ｇ０５００２５０１００Ａ图３ＩＡＴＰ－ｃ６和ＴＥＢ４－Ｃ基因的ＰｃＲ扩增结果Ａ：１：ＤＮＡＭａｒｋｅｒＢ：ｌ：ＤＮＡＭａｒｋｅｒＢ２：ＡＴＰ－Ｃ６基因２：ＴＥ９４－Ｃ基因３２酶切鉴定口翎ｖ＿’ｌ＾＿＾ＴＰ－ｃ６和ｐＥＧＦＰ－ＴＥＢ４－Ｃ重组载体ｐ卅Ｈ＾＿＾ＴＰ—∞经删和Ｘｏｈ，双酶切鉴定，琼脂糖电泳上可见在６８０ｂｐ左右有一条带（图３．２，Ａ），结果与预期相符，表明ＡＴＰ－Ｃ６已成功克隆入载体；ｐＥＣ４＝Ｐ－ＴＥＢ４－ｃ经＆胡，和矗捌ｙ，双酶切，琼脂糖电泳上可见在］２００ｂｐ左右有一条带（图３．２，Ｂ），结果与预期相符·表明片段己成功克隆入载体。第３章结果１２２１一；ｌ鎏ｍ一二二一勰器椭Ａ图３．２酶切鉴定重组质粒ＤｃＭＶ－ＨＡ－ＡＴＰ－Ｃ６和ｐＥＧＦＰ－ＴＥＢ４－ＣＡ：１：ＤＮＡＭａｒｋｅｒ２：酶切ｐＣＭＶ－ＨＡ－ＡＴＰ，－Ｃ６重组质粒Ｂ：ｈＤＮＡＭａｒｋｅｒ２：酶切ｐＥＧＦＰ－ＴＥＢ４－Ｃ重组质粒３３基因克隆的测序结果将经酶切鉴定有插入片段的质粒送到上海生工生物公司测序。测序结果见附录２。结论结论结论通过本研究得出以下结论：１．在衣霉素和Ａ１３２５－３５蛋白诱导的内质网应激中，ＲＴ－ＰＣＲ、ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ检测发现ＴＥＢ４截短体基因影响内质网应激相关因子ＣＨＯＰ、ＧＲＰ９４和ＧＲＰ７８的表达。２．成功构建了ｐＥＧＦＰ—ＴＥＢ４．Ｃ表达载体，为下面的功能域研究做好准备。３．成功构建了ｐＣＭＶ－ＨＡ．ＡＴＰ．Ｃ６载体，为下一步实验奠定基础。致谢致谢三年的研究生生涯即将结束，在此期间导师的谆谆教悔，领导的深切关怀，同事的鼓励支持，同学的精诚合作和无私帮助伴随我度过这段难忘的时光。在此论文顺利完成之际，谨向以下每一位支持帮助过我的人表示衷心的感谢。首先特别感谢我的导师李学礼副教授，在三年的求学生涯中，导师的悉心教诲使我各方面得到很大的提高，她高尚的品德、渊博的学识、严谨的作风以及丰富的科研经验值得我终身学习。再次感谢我的老师徐磊副教授，他视野开阔，治学严谨，平易近人，每当我在实验中遇到挫折向他求教时他总是能把帮我把难题化解，提出解决问题的好建议。还要感谢吕立夏副教授，她思维敏捷，思路清晰，和蔼可亲，手把手的传授实验技术，耐心的讲解实验理论使我顺利的进入分子生物学领域，她一直是我学习的榜样。另外衷心的感谢以下各位领导、老师、同学：同济大学医学院生化教研室：沈耀新，贾松，李姣，李静琪，杨翠香。同济大学医学院预防医学教研室：厉曙光教授，余金明教授，蔡智鸣副教授，张志强。分子遗传学实验平台：张军副教授，石红军。肿瘤实验平台：杨耀琴教授，陶惠红。免疫实验平台：陈小平教授，戴亚蕾教授。同济大学医学院研究生：刘立，张红娟，彭建，赵佳，张晶，乔永霞，王佳怡，李学晋，徐婷，郑永华，祁晨光，翟伟，王先辉，窦帮，成燕，程毛等。我的这篇论文是在大家的共同协作努力下完成的。最后衷心祝福所有的老师、同学、亲人和朋友们！参考文献参考文献ＦａｎｇＳ．ａｎｄＷｅｉｓｓｍａｎｎ，Ａ．Ｍ．Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ—ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅｓｙｓｔｅｍＡｆｉｅｌｄｇｕｉｄｅｔｏｕｂｉｑｕｉｔｙｌａｔｉｏｎ．ＣｅｌｌＭ０１．ＬｉｆｅＳｃｉ．６１，１５４６—１５６１；２００４．Ｓｗａｎｓｏｎ，Ｒ．，Ｌｏｃｈｅｒ，Ｍ．ａｎｄＨｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ，Ｍ．Ａｃｏｎｓｅｒｖｅｄｕｂｉｑｕｉｔｉｎｌｉｇａｓｅｏｆｔｈｅｎｕｃｌｅａｒｅｎｖｅｌｏｐｅ／ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍｔｈａｔｆｕｎｃｔｉｏｎｓｉｎｂｏｔｈＥＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄａｎｄＭａｔａｌｐｈａ２ｒｅｐｒｅｓｓｏｒｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．（２００１）ＧｅｎｅｓＤｅｖ．１５，２６６０—２６７４．Ｙｕｚｕｒｕｌｍａｉ，Ｍ撕ｋ０Ｓｏｄａ，ａｎｄＲｙｏｓｕｋｅＴａｋａｈａｓｈｉ．Ｐａｒｋｉｎｓｕｐｒｅｓｓｅｓｕｎｆｏｌｄｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓｔｒｅｓｓ－ｉｎｄｕｃｅｄｃｅｌｌｄｅａｔｈｔｈｒｏｕｇｈｉｔｓＥ３ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎｌｉｇａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．Ｎｏｖ１７；２７５（４６）：３５６６１－４；２０００．ａＨａｓｓｉｎｋ，ＧＫｉｋｋｅｒｔ，Ｍ，ＶａｎＶｏｏｒｄｅｎ．Ｓ，ｅｔａ１．ＴＥＢ４ｉｓｕｂｉｑｕｉｔｉｎｌｉｇａｓｅｏｆｔｈｅｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃＣ４ＨＣ３ＲＩＮＧｆｉｎｇｅｒ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｒｅｔｉｃｕｌｕｍ．（２００５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３８８．６４７－６５５．Ｔ，ＴｓｕｊｉａＴａｋａｈａｓｈｉＨ，ＯｈａｍａＥ，ＳｕｚｕｋｉＳ，ＨｏｒｉｋａｗａＹ，ＩｓｈｉｋａｗａＡ，ＭｏｄｔａＳ，ＩｋｕｔａＦ．Ｆ锄ｉｌｉａｌｊｕｖｅｎｉｌｅＫｉｔａｄａｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ：Ｃｌｉｎｉｃａｌａｎｄｐａｔｈｏｌｏｇｉｃｓｔｕｄｙｉｎｆａｍｉｌｙ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ４４：４３７－４４１；１９９４．Ｔ，ＡｓａｋａｗａＳ，ＨａｔｔｏｒｉＮ，ＭａｔｓｕｍｉｎｅＨ，ＹａｍａｍｕｒａｃａｕｓｅＹ，ＭｉｎｏｓｈｉｍａＳ，ＹｏｋｏｃｈｉＭ，ＭｉｚｕｎｏＹ，ＳｈｉｍｉｚｕＮ．Ｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎｔｈｅｐａｒｋｉｎｇｅｎｅｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ．Ｎａｕｔｕｒｅ３９２：６０５—６０８；１９９８．ａｕｔｏｓｏｍａｌｒｅｃｅｓｓｉｖｅｊｕｖｅｎｉｌｅＳｃｉＭｏｒｅａＥ，ＢｏｒｋＰ．Ａｎｏｖｅｌ２４：２２９－２３１；１９９９．ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎｄｏｍａｉｎｉｎｐａｒｋｉｎ．ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍＳｔｅｆａｎＧ．Ｋｒｅｆｔ，ＬｉｎＷａｎｇ，＆ＭａｒｋＨｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ．ＭｅｍｂｒａｎｅＲ．，ＤａｉＭ．，ＡｖｎｅｒＲ．，ＨａｓｓｉｎｋＥ．ＨｕｍａｎＨＲＤｌｉｓｔｏｐｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅＤｏａｌＯｕｂｉｑｕｉｔｉｎＫｉｋｋｅｒｔｌｉｇａｓｅ．（２００５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．６７５７－６７６５．Ｑ，ＶａｎＶｏｏｒｄｅｎＳ．，ＴｈａｎｅｄａｒＳ．，Ｍ．，ＤｏｏｌｍａｎＪ．，ＣｈａｕＲｏｉｔｅｌｍａｎＶ，ＷｉｅｒｔｚａｎＥ３ｕｂｉｑｕｉｔｉｎｌｉｇａｓｅｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓｆｒｏｍｔｈｅｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍ．Ｊ．Ｂｉ０１．Ｃｈｅｍ．２７９：３５２５－３５３４；２００４．１０．ＶａｎｄｅｒＲｅｉｊｄｅｎＢＡ，Ｒｅｐｅｌｉｎｃｋ－ＶｅｒｓｃｈｕｅｒｅｎＣＡ，ＬｏｗｅｎｂｅｒｇＢ，ＪａｎｓｅｎｃｌａｓｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｗｉｔｈａＪＨ．ＴＲＩＡＤｓ：Ａｎｅｗｎｏｖｅｌｃｙｓｔｅｉｎｅ—ｒｉｃｈｓｉｇｎａｔｕｒｅ．ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉ８：１５５７－１５６１；１９９９．１１．Ｙｕｚｕｒｕｌｍａｉ．ＭａｒｉｋｏＳｏｄａ，ａｎｄＲｙｏｓｕｋｅＴａｋａｈａｓｈｉ．Ｐａｒｋｉｎｓｕｐｒｅｓｓｅｓｕｎｆｏｌｄｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓｔｒｅｓｓ—ｉｎｄｕｃｅｄｃｅｌｌｄｅａｔｈｔｈｒｏｕｇｈｉｔｓＥ３ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎｌｉｇａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．Ｎｏｖ１２．１３．１７；２７５（４６）：３５６６１－４；２０００．ａ１．ＵｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｅａｃｉｄｐｒｅｖｅｎｔｓｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅＨｅｒｓｈｋｏＡ，ＣｉｅｃｈａｎｏｖｅｒＡ．Ｔｈｅｕｂｉｑｕｉｔｉｎｓｙｓｔｅｍ．ＡｎｎｕＲｅｖＢｉｏｅｈｅｍ６７：４２５－４７９；１９９８．Ｒｅｄｒｉｇｕｅｓ．ＣＭ，Ｍａ．Ｘ，ＬｉｎｅｈａｎＳｔｉｅｅｒ．Ｃｅｔｃｒｅｌｅａｓｅｉｎａｐｏｐｔｏｓｉｓｂｙｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇｍｉｔｏｅｈｏｎｄｆｉａｌｍｅｍｂｒａｎｅｄｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｎｎｅｌｆｏｒｍａｆｏｎ．ＣｅｌｌＤｅａｔｈＤｉｆｅｒ，１９９９，６（９）：８４２－－８５４．１４．ＭｏｉｌＫ．ＴｒｉｐａｒｔｉｔｅｒｒＬａｎａｇｅｍｅｎｔｏｆｕｎｆｏｌｄｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｔｈｅｅｎｄａｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍ．Ｃｅｌｌ，２０００，１０１（５）：４５１．４５４．１５．李学礼，李艳娜，吕立夏，高景霞等。ＢＤＮＦ对诱导分化的ＳＨ．ＳＹ５Ｙ细胞Ｇｌ期相关蛋白表达的影响。神经解剖学杂志，２２（１）：７１．７６；２００６李学礼，吕立夏，徐磊等。活性依赖性神经保护蛋白同源基因在帕金森病模型鼠脑中的表达。中华老年医学杂志，２２（１０）：６２８；２００３．１６．１７．李学礼，吕立夏，杨翠香等。新生大鼠小脑内发育相关基因的筛选。中国神经科学５２参考文献杂志，ｌ８：５０７—５１０；２００２．Ｍａｖｅｌｌｉ，ＡｐｏｐｔｏｓｉｓｉｓＭａｒｉｎａｂｙＣｏｍｅｌｌｉ，ＦｒａｎｃｅｓｃａｄｅｃｌｉｎｅｏｆＤｉＰａｎｃｒａｚｉｏＡＴＰａｎｄＩｒｅｎｅｉｎｉｎｄｕｃｅｄｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｓｙｎｔｈｅｓｉｓｅｒｙｔｈｒｏｌｅｕｋｅｍｉａｃｅｌｌｓ．ＦｒｅｅＲａｄｉｃａｌＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＭｅｄｉｃｉｎｅ，３４（９）：１ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊ１９０－ｌ１９９；２００３１８．ＬｉｘｉａＬｕ，ＮｅｆｆＦ，Ａｌｖａｒｅｚ—ＦｉｓｃｈｅｒＤ，ｅｔａ１．ＧｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｆｉｌｉｎｇｏｆＬｅｗｙｂｏｄｙ—ｂｅａｔｉｎｇｎｅｕｒｏｎｓｉｎＰａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓＥｘｐＮｅｕｒｏｌ，２００５，１９５（１１：２７．３９．１９．Ｈｅｌｅｎ刀ＡｍａｒｚｇｕｉｏｕｉｔａｒｇｅｔｉｎｇｔｈｅｈｕｍａｎＭ，ＷｉｉｇｅｒＭｒｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎｅｔａ１．ＰｏｓｉｔｉｏｎａｌｅｆｆｅｃｔｓｏｆｓｈｏｒｔｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡｓＴｉｓｓｕｅＦａｃｔｏｒ．Ｊ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ，２００２，ｔｒｉｇｇｅｒ３０（８）：１７５７－１７６６．２０．ＫａｎｇＪ，ＬｅｍａｉｒｅＨＧＵｎｔｅｒｂｅｃｋＡ，ｅｔａ１．ＴｈｅｐｒｅｃｕｒｓｏｒｏｆＡｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓｄｉｓｅａｓｅａｍｙｌｏｉｄａＡ４ｐｒｏｔｅｉｎｒｅｓｅｍｂｌｅｓ２１．ｃｅｌｌｓｕｒｆａｃｅｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｎａｔｕｒｅ，１９８７，３２５（６１０６）：７３３－７３６Ｓ，ｅｔａ１．ｂ－ｓｅｃｒｅｔａｓｅｃｌｅａｖａｇｅｏｆＡｌｚｈｅｉｍｅｒ’ＳａｍｙｌｏｉｄＶａｓｓａｒ心ＢｅｎｎｅｔｔｐｒｅｃｕｒｓｏｒｐｒｏｔｅｉｎＢＤ，Ｂａｂｕ－ＫｈａｎｔｈｅｂｙｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅａｓｐａｒｔｉｃｐｒｏｔｅａｓｅＢＡＣＥ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，２８６（５４４０）：７３５－７４１２２．ＪｉａｎｇＪ．Ｂａｌｌｉｎｇｅｒ，Ｃ．Ａ．，Ｗｕ，Ｙ，Ｄａｉ，Ｑ，Ｃｙｒ，Ｄ．Ｍ．ＨｏｈｆｅｌｄＪ．ａｎｄＥ３ｕｂｉｑｕｉｔｉｎＰａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｃ．ＣＨＩＰＨｓｅ７０ａｓａｉＳａＵ·ｂｏｘ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｉｇａｓｅ：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔａｒｇｅｔｆｏｒｕｂｉｑｕｉｔｙｌａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｂｉ０１．Ｃｈｅｍ．２７６：４２９３８－４２９４４；２００１．２３．Ｊｏａｚｅｉｒｏ，Ｃ．Ａ．，ＷｉｎｇｏＳ．Ｓ．，Ｈｕａｎｇ，Ｈ．，Ｌｅｖｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｈｕｎｔｅｒ，Ｔ．ａｎｄｋｉｎａｓｅｎｅｇａｔｉｖｅｒｅｇｕｌａｔｏｒｃ－ＣＢＩａｓａＬｉｕ’ＹＣ．ＴｈｅｔｙｒｏｓｉｎｅＲＩＮＧ·ｔｙｐｅ，Ｅ２－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎｌｉｇａｓｅ．Ｊ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９９．２８６：３０９－３１２．２４．Ｂａｒｔｅｅ，Ｅ．，Ｍａｎｓｏｕｄ，Ｍ．，ＨｏｖｅｙＮｅｒｅｎｂｅｒｇ，Ｂ．，Ｇｏｕｖｅｉａ＇ｋＤｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆａｎｄＦｒｕｈ，Ｋ．ｍａｊｏｒｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙｃｏｍｐｌｅｘｃｌａｓｓＩｂｙｈｕｍａｎｕｂｉｑｕｉｔｉｎｌｉｇａｓｅｓｒｅｌａｔｅｄｔｏｖｉｒａｌｉｍｍｕｎｅｅｖａｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ．Ｖｉｒ０１．２００４．７８．１１０９－ｌ１２０２５．Ｂａｒｅｌ，Ｍ．，Ｒｅｓｓｉｎｇ，Ｍ．，Ｐｉｚｚａｔｏ，Ｎ．，ｖａｎＬｅｅｕｗｅｎ，Ｄ．，ＬｅＢｏｕｔｅｉｌｌｅｒ，Ｐ，Ｌｅｎｆａｎｔ，ＥａｎｄＷｉｅｒｔｚ，Ｅ．Ｈｕｍａｎｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ－ｅｎｃｏｄｅｄｏｆＵＳ２ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙａｆｆｅｃｔｓｓｕｒｆａｃｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎＭＨＣｃｌａｓｓＩｌｏｃｕｓｐｒｏｄｕｃｔｓａｎｄｔａｒｇｅｔｓｍｅｍｂｒａｎｅ－ｂｏｕｎｄ，ｂｕｔｎｏｔｓｏｌｕｂｌｅＨＬＡ－Ｇ１ｆｏｒｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．Ｊ．１ｍｍｕｎ０１．２００３．１７１，６７５７－６７６５．２６．Ｋｉｓｈｉｎｏ，Ｔ．，Ｌａｌａｎｄｅ，Ｍ．，ａｎｄＷａｇｓｔａｆｆ，Ｊ．ＵＢＥ３Ａ／Ｆ巳６－ＡＰｍｕｔａｔｉｏｎｓｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９９７．１５：７０－７３．ｃａｕｓｅＡｎｇｅｌｍａｎ２７．Ｂａｙｓ，ＮＷＧａｒｄｎｅｒ，ＲＧＳｅｅｌｉｇ，Ｌ只Ｊｏａｚｅｉｒｏ，ＣＡ，ａｎｄＨａｍｐｔｏｎ，ＲＹ．ＮａｔＣｅｌｌＢｉ０１．２００１．３，２４－２９．２８．Ｓｗａｎｓｏｎ，Ｒ．，Ｌｏｃｈｅｒ，Ｍ．ａｎｄＨｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ，Ｍ．Ａｃｏｎｓｅｒｖｅｄｎｕｃｌｅａｒｕｂｉｑｕｉｔｉｎｌｉｇａｓｅｏｆｔｈｅｅｎｖｅｌｏｐｅ／ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍｔｈａｔｆｕｎｃｔｉｏｎｓｉｎｂｏｔｈＥＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄａｎｄｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＭａｔａｌｐｈａ２ｒｅｐｒｅｓｓｏｒｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．ＧｅｎｅｓＤｅｖ．２００１．１５：２６６０－２６７４２９．ＶａｓｈｉｓｔＳ，ＮｇＤＴ．ＭｉｓｆｏｌｄｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓａｌｅｓｏｒｔｅｄｂｙａｓｅｑｕｅｎｔｉａｌＥＲｑｕａｌｉｔｙｃｏｎｔｒ０１．ＪＣｅｌｌＢｉｏｌ，２００４，１６５：４１—５２．３０．ＷａｎｇＱ，ＣｈａｎｇａＡ．ＳｕｂｓｔｒａｔｅｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｉｎＥＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｍｅｄｉａｔｅｄｂｙＥｐｓｌ，ｍｅｍｂｅｒｏｆｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｄｉｓｕｌｆｉｄｅｉｓｏｍｅｒａｓｅｆａｍｉｌｙ．ＪＥＭＢＯ，２００３，２２：３７９２－３８０２．３１．Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．Ｎ．Ｈａｔｔｏｆｉ，Ｓ．Ｋｕｂｏ，ｅｌｐｒｏｄｕｃｔ，ｐａｒｋｉｎ，ｉｓａａ１．Ｊ．ＢｔｏｉＣｈｅｍ，２０００，ＦａｍｉｌｉａｌＰａｒｋｉｎｓｏｎｄｉｓｅａｓｅｇｅｎｅｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎｌｉｇａｓｅ．２５：３０２－３０５３２．Ｂｅｎｃｅ，Ｎ．Ｆ．，Ｓａｍｐａｔ，Ｒ．Ｍ．，ａｎｄＫｏｐｉｔｏ，Ｒ．＆２００１．Ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔｏｆｔｈｅｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－－ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅｓｙｓｔｅｍｂｙｐｒｏｔｅｉｎａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２９２：１５５２－１５５５．３３．ＧｉｌｏｒｂＴ．，Ｃｈｏｍｓｋｙ，Ｏ．，ａｎｄＫｕｌｋａ，Ｒ．Ｇ１９９８．Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｓｉｇｎａｌｓｆｏｒｕｂｉｑｕｉｔｉｎｓｙｓｔｅｍ５３参考文献ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓｉｎＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．ＥＭＢＯＪ．１７：２７５９．之７６６．３４．Ｃｈｉｅｎ，ＰＹＷａｎｇａｎｄＪ，Ｃａｒｂｏｎａｒｏ，ＤＬｅｉＳ，ＭｉｌｌｅｒＢ，ｅｔａ１．Ｎｏｖｅｌｃａｔｉｏｎｉｃｃａｒｄｉｏｌｉｐｉｎａｎａｌｏｇｕｅ—ｂａｓｅｄｌｉｐｏｓｏｍｅｆｏｒｅ伍ｃｉｅｎｔＤＮＡａｎｄｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡｄｅｌｉｖｅｒｙｉｎｖｉｔｒｏｉｎｖｉｖｏ．２００５．ＣａｎｃｅｒＧｅｎｅＴｈｅｒ．１２．３２１．３２８．３５．ＳｈｅｒｅｒＴＢ，Ｂｅｔａｒｂｅｔ＆ＴｅｓｔａＣＭ，ｅｔａ１．ＭｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｌｏｘｉｃｉｔｙｉｎｒｏｔｅｎｏｎｅｍｏｄｅｌｓｏｆＰａｒｋｉｎｓｏｎ’Ｓ３６．ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．ＪＮｅｕｒｏｓｃｉ，２００３，２３（３４）：１０７５６一１０７６４．ＬＷｏｌｖｅｔａｎｇＥ，Ｊ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，ＫＫｒａｕｅｒ，Ｋ．Ｒａｌｐｈ，Ｓｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｃｈａｉｎｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｉｎｄｕｃｅａｐｏｐｔｏｓｉｓ．ＦＥＢＳ３７．Ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ，ａｔｕｍｏｒｐｒｏｍｏｔｅｒ，ｄｉｓｃｈａｒｇｅｓＬｅｔｔ．３３９：４洲．１Ｃａ２１ＪＬｉｎｎａｎｅ，ＡＷＭｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ９９４．ｓｔｏｒｅｓｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｂＹｓｐｅｃｉｆｉｃｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｔｈｅｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍＣａ２ｌｏ汀＇Ｐａｓｅ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ８７：２４６６—２４７０．３８．ＫｕｍｒａｌＡ，ＴｕｇｙａｎＫ，ＧｏｎｅｎｃＳ，ＧｅｎｃＫＧｅｎｃＳ，ＳｏｎｍｅｚＵ，ＹｉｌｍａｚＯ，ＤｕｍａｎＮ，ＵｙｓａｌＮ，ＯｚｋａｎＨ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎａｇａｉｎｓｔｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎａｒａｔｉｏｎｅｔｈａｎｏｌ－ｉｎｄｕｃｅｄａｐｏｐｔｏｔｉｃａｎｄｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓｉｎｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇＣ５７ＢＬ／，６ｍｏｕｓｅｂｒａｉｎ．ＢｒａｉｎＲｅｓＤｅｖＢｒａｉｎＲｅｓ２００５．１６０：１４６一１５６．３９．ｓａｌｅｈＭ，Ｖ撕ｌａｎｃｏｕｒｔＪａ，ＧｒａｈａｍＩｔｋｅｔａ１．Ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｏｆｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓｂｙ４０．ｈｕｍａｎｃｈｏｐｐｏｌｙｒａｏｒｐｈｉｓｍｓ．Ｎａｔｕｒｅ，２００４，４２９（６９８７）：７５—７９．ＣｈｕＪ，Ｔ０ｎｇＭ，ｄｅｌａＭｏｎｔｅＳＭ．２００７．Ｃｈｒｏｎｉｃｅｔｈａｎｏｌｅｘｐｏｓｕｒｅｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎｃａｕｓｅｓｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｎｅｕｒｏｎｓ．ＡｅｔａａｎｄｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓｉｎｉｍｍａｔｕｒｅｃｅｎｔｒａｌｎｅｒｖｏｕｓｓｙｓｔｅｍＮｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｌ１３：６５９—６７３．４１．Ｍａｒｔｏｎ，Ａ．Ｍｉｈａｌｉｋ，Ｒ．Ｂｒａｔｉｎｃｓａｋ，Ｒ．Ａｄｌｅｆｆ，ＶＰｅｔａｋ，１．Ｖｅｇｈ，Ｍ．Ｂａｕｅｒ，ＰＡｐｏｐｔｏｔｉｃｃｅｌｌｄｅａｔｈｉｎｄｕｃｅｄａＩ．Ｋ脚ｃｓｉ，Ｐｉｎｈｉｂｉｔｓｂｙｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｏｆｅｎｅｒｇｙｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ．Ｂｃｌ－２ａｐｏｐｔｏｓｉｓｄｏｗｎｓｔｒｅａｍｏｆ４２．ｆａｌｌｏｆＡｒＰｌｅｖｅｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｅｈｅｍ．２５０：４６７－４７５；１９９７．ｅｎＲａｏＲＶ，ＰｅｅｌＡ，ｋ卜．ｉｎｏｖａＡ，ｅｔａ１．Ｃｏｕｐｌｉｎｇｐｒｏｇｎｎｎ：ｒｏｌｅｏｆｔｈｅＥＲｃｈａｐｅｒｄｎｅｄｅｐｌａ．ｒｅｔｉｃｕｌｕｍｓｔｒｅｓｓｔｏｔｈｅｃｅｌｌｄｅａｔｈＧＲＰ７８．ＦＥＬｅｔｔ．２００２．５１４（２．３）：１２２－－１２８．ｂｙｔｈｅｃａｌｃｉｕｍ－－ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｃａｌｐａｉｎＩｃａｄｔｏ４３．ＣｈｕａＢＴ，ＧｕｏＫ，ＬｉＰ．Ｄｉｒｅｃｔｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎｃｌｅａｖａｇｅｏｆｔ｛ＩｓＩｓｅｓ．ＪＢｉｏｅｈｅｍ，２００ｌ，２７５（７）：５１３１ｍ５１３５．ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎｏｆｅｅｌｌｄｅａｔｈｐａｔｈｗａｙｓ．Ｎａｔｅｅｌｌ４４．ＦｅｎｉＫＦ，ｋｒｏｍｅｍｅｒＢｉｏｌ，２００１，３４５．ｌ（１１）：Ｅ２５Ｈ６３．ＧＯｒｇａｎｅｌｅ．ｓｐｅｃｉａｌＫａｔａｙａｍａＴ’Ｉｍａｉｚｕｍｉｌ（，ＭａｎａｂｅＴ，ＨｉｔｏｍｉＪ，ＫｕｄｏＴ，ＴｏｈｙａｍａＭ．２００４．ＩｎｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｏｆｎｅｕｒｏｎａｌｄｅａｔｈｂｙＥＲｓｔｒｅｓｓｉｎＡｌｚｈｅｉｍｅｒ’Ｓｄｉｓｅａｓｅ．ＪＣｈｅｍ４６．Ｎｅｕｒｏａｎａｔ２８：６７—７８．ＡｙａｋｏＹａｍａｍｏｔｏ，ＡｍｏＦｒｉｅｄｌｅｉｎ，Ｙｕｚｕｒｕｌｍａｌ，ａｔｅ１．ＰａｒｋｉｎＰｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎＭｏｄｕｌａｔｉｏｎ４７．ｏｆＩｔｓＥ３ＵｂｉｑｕｉｔｉｎＬｉｇａｓｅＡｃｔｉｖｉｔｙ．（２００５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３９０—３３９５．但美霞Ｎｉｅｂｕ．Ａ．猫叫综合征关键区域定位于５ｐ１５．２的Ｄ５Ｓ７１３－—Ｄ５ｓ１８区域【Ｊ】．中华医学遗传学杂志，１９９７，１４（５）：２６３．２６７ＭａｉｎａｒｄｉＥＰｅｒｆｕｍｏ，Ｃ，Ｃａｌｉ，Ａ，ＣｏｕｅｏｕｒｄｅｑＰａｓｔｏｒｅＧＣａｖａｎｉＳ，Ｚａｒａ，Ｆ．Ｏｖｅｒｈａｕｓｅｒ’Ｊ，Ｐｉｅｒｌｕｉｇｉ，Ｍ，Ｂｒｉｃａｒｅｌｌｉ，ＦＤ２００１．Ｃｌｉｎｉｃａｌａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆ８０ｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈ５ｐ４８．ｄｅｌｅｔｉｏｎ：Ｇｅｎｏｔｙｐｅ－ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．３８：１５１一ｌ５８．Ｎｉｅｂｕｈｒ，Ｈｕａｎｍｉｎｇ４９．Ｑｉｎｇｆａｗｕ，ＥｒｉｋＹａｎｇ，ｅｔａ１．Ｊ．ＨｕｍａｎＧｅｎｅｔｉｃｓ（２００５）１３，４７５＿４８５．附录附录１载体信息１．ｐＣＭｖ一姒载体信息棚■聪●雹●嘲Ｗ鲍ｅＡＴＢ僦ｃｃＡ硼雹盯Ｇ丌ｅｃＡ器盯ＴＡｃＧ口ｍ峨翻曩Ｔ８蠡宅ｅＡＴ．ＧＢ叠塔ＧＯＣ———历两广一１面汗可可１丽，矿—丽万一●槲曩●翻●曩●嬲－ｅ鑫矗矗ｍ。￡ＧＧＴＣＧ磊ＤＣ￡囊６置汀ｅｎ习ＣＢ履鑫甜—鱼Ｃ￡ＢｅＧＥ∞蟊￡５５附录２．ｐＥＧＦＰ—Ｎ２载体信息Ｅｃ００１０９，．３８６０１（２，５＆３ｊ署必｜：’镪篮ｇ￡绺搬鹏Ｓ耗鲫Ｉ丘Ａ船－？！！哩．３．ｐＳｕｐｅｒ－ＥＧＦＰ载体信息Ｍｄ２３５Ｎｄｃ（２６７３）Ｓ／抽（２５８６）Ｓｐ／ｌ（２５１４㈣＿｜妻篙。嚣黝猫鼬渤。附录附录２测序结果ＡＴＰｓｙｎｔｈａｓｅＦ０ｓｕｂｕｎｉｔ６ｍＲＮＡａｔｇａａｃｇａａａａｔｃｃｇｃｃｇｃａｇｔａｃｔｇａｔｃａｔｔｃＣａａＣａａＣＣｇａｃｔａａｔｃａｃｃａａｇＣＣａｔａＣａＣａａｃａｃｔａａａｇｔａｔｔｇｃｃａｃａａｃｔａａｃｃｔｃｃａｔＣｔａｔａａａＣｃｔａｇｃｃａｔｇｇｃｔｃｔａａｇａｔｔＣＣＣＣａｔａＣｔａａｃｇｃｃｔａａｃｃｃｃｔａｇｃａａｔａｔｇｔｔｃｇｃｔｔｃｔａｔｔｔｃｃｃｃｃａｔｔｃａｔｔｇｃｃｔｃｔａｔｔｇａｔｃｃｃｃａｃａａｔｃｃｔａｇｇｃｃｔａｃｃｃｃｃａｃｃｔｃｃａａａｔａｔｃｔｃａｔｃｔａａｃｃｔｃａａａａｃａａａｔｇａｔｃｔａｇｔａｔｃｃｔｔｔｔａｃａｃｃａａｔａａｔｃａｔｔｔｔｃｃａｃｃｃａａｃｔｃｃｃａａｃａａｔｇａｃｔａａｔｃａａａｇａｃｇａａｃｃｔｇｔｃｇｇａｃｔｃｃｔＣＣａｔｃｃｃｃｔｔｔａｇｃｃｃａｃｔｔａｔｃｔｃｔｔａｔａｇｃｃｔｃａｃｔｃａａｔｇａｇｃｇｇｇｃｃｔｔａｃｃａｃａａｃｃｔａｃｔｃａｔｔｇＣａｇｔｇａｔｔａｔａｇｇｃｔｔｔｃｇｇｇｃａｃａｃｃｔａｃａａｃｃａａｔａｇｃａｃｃｔａａｔｔｇｃａｃｃｃｃｔｔａｔｃｃｃｔｇｇｃｃｇｔｇａａｇｃｇｃｃａｃｔｔｃｔａａｔｔｃｔｃａｃｔｔｃｔａｇｔａａａａａｔｇｃｃｃｇｔｔａｔｔａｔｃｇａａａｃｃａｔｃａｇｇｃｔａａｃａｔｔａｃｔｇｃａｇｇｃｃａｃｃｔａｃｔｃａｔｇｔｃａａｃｃａｔｔａａＣＣｔｔＣＣＣｔＣｃｔａｇａａａｔｃｇｃｔｇｔｃｇｃｃｔｔｔａｃａｃｔｔａｔｃａｔｃｔｔｃａｃａａａａｔｃｃａａｇｃｃｔａｃｇｔｔｔｔｃａａｃｔｇａｃｔａｔｃａａｇｃｃｔｃｔａｃｃｔｇｃａｃｇａｃａａＣａｃａｔａａＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓＴＥＢ４ｐｒｏｔｅｉｎｍＲＮＡｃｔｇｃｃｔａａｔｔｔｔｃｔｔｃｃａｔａｃａａｔｇｔｔｇｃｔｔｃａｇｇｔｃａｔｇｃｔｃｔａｃａｇｔｇａｔｇｃｔｃｃａｇｔｇａｇｔｇａａａｃａｇｇｇａｃａｇａｔａｃｔｔｇｃｔｃａａａｔｃａａｃａｇａｇａａｇｇｃｃｔａｇｃｔｔｔａｃｃｇｇｔａｔａａｃａｔｔｇｇｔｔａａｔｇｔｃｇｔｃｔｃｔａｔｇｔａｇｇｇａＣｇＣａｇｔｇａｔａｇｔｔｇｃｔｇｇｔｃａｔｔｇｔａｇｇａｃｔｇｇｇｃｃｔｃａｇｔｇｇｔｇａＣＣｔｔＣａＣｔａｔｇｔｇｔｇｔａｃｃｔｇｃａａａａｃｔｔｃａａｔｔｔｔｇｔｃａｃｔｇｔｃｃｃｔｃｇａｇｃｔｇｃｔｔｃＣａＣｇａａｇＣａｇｇｇａｔｃｔｔｃａｔｔｇｔｃｔｔｇｃｃａｇｃａｔｔａｃｔｃｇａｇｃｇｔｇｇａｃｔｇｇａａｇａａａａｔｃａａｃｇｃｔａｔｔｇｇｇａｇｇｇｃｃｔｔｃｔｇｔｔｇａｔｔａｃｃａｇｔａｔｔｔｇｔｇａｃｃｇｃｃｇｇａａａａｃａｇｔｇｃｃｔｇｔｇｇｔｇｇｇｔｔｇｇｔｔｔｔｃｇｔｃｔｔｃａｔｇｔｇｃｔｇｇｃｃｇｔｔｔｇｇｃｔｇａａｇｇｇｇｃｔｇｇｔｇｃｇｔｃｔｔａｔｔｔａｔｔｇｇｇａｇａｃｃａｃｔｃｇａａａｔａａｔａｃｔｃｃａｇｃａｔｃａｇｇａｔａｔｔｇｃｃｔｔａｃｔｔｔａａａｔｃｃａｔｇａｃｔｇｔｇａｃｇｇｔａａｇａｇｔｇｇｔｃｔｃｃｃｔｃｔｃｃｔｔｇｇａｔｃａｇａｃａａａｔｃａｔｔｇｃａｇｇｔｔｔａｃｇｃｃｔｃｃｃｇｔｇａｔｔｔｇｔｔｃｃｔｔｔｃａｔｔｔｔｔａｃｔａｇｃｇｃｃｔｔｔａａｇｔｔａａｃａａｔａａｔｃａｇｃａｔｇｔｃａｔｇｃａｇｃｃｃａｃｃａａｇｃｃａｃｃｇａｃｃｔｔｔａａａｔｔｔｔｃｃａｃａｃｔｇａｔｔｇｃｃａｇｃｃｔｃａｔｃｔｇｔｔｔｔｇｇａｃｇｇｇｇａｃｔｇｃｃａｔｔｇｃｔｇｇｃｔａａｃｃａｔａａｇｇｇａｇｔｇａｔｃｔｔｃｃａｇａａｇｇｔｔａｇｇｔｇｃｔｇｔｔｇｇｃｔｇｇａｇｔｔｇｇｇｃｔｃｃｃｃｔｇａｇｇｇｔｔｃｃｃｔａｃｔｔｇｇａｇｔｃｇｔｔｇａａａａｃｔｔａｔｔｇｔｔｃｇｔｃｔｇｃａｔｇｃｃａｇｔａａｔｔｇａａｃａａａｃｔｇｇｃａｇｇｃｔｃｔａｃａｃａｇｃｔｇｃｔｔｇｔｇｇａｔｇｇｔｇｇＣａｔｇｇａｔｇｃｃｔｃｔｃｔｃａｔｇａｔｃｔｃｔｇｇｇｇｃｔｃｔｃｃｔｃｔｔｔｔｔａｇｃｔａｔａａｃａａａａｔｇｇｃａｔｃｃｔｃｔｇｔｇｃｔｇａｃｔａｇｇｔｇｔｔｇａｔｇｇｔｃｇｔｇｔｇａａｃａｔａｔｔａｔｇａａｇａｃｔｔｃｔｇｔｔｔｇａｇｃｔａｔｃｃａｔｇｇｃｔｔｇａｔｇｇｇｔｃｃｇｇａａｃａｔｔｇｔｔｇｃｔｔｔｃｃｃａｃｔｇｃｇｇａｏａｇｔａｔｔｇａｔｇｇｔｔａｔｇｔｃａｔａｇｃｔｔｃｔｇｇｔｇａｇｔｃｃａｔｃｇｇｃｇｇａｔｔｔａｔｃｃｔｔｃｃａａｇｔｃｃｇｃｃａｇｔｔｔａｇｇｇｔｃａａｃｇａｃｔｃｇｔｇａａｃｔｔｃｃａｃａｇｔｃａｔｃｃｃａａｇａａｔａａａａａｔｇａｃａａｇｔａｃｃｔｔｇｔｃａａｇｇｃｔｃａｔｃｔＣＣａＣＣａＣＣａｃｇａａｃｇｇａａａｔｃｔｇｇｃａａａａａ５８ＡＴＰｓｙｎｔｈａｓｅＦ０ｓｕｂｕｎｉｔ６ｍＲＮＡＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓＴＥＢ４ｐｒｏｔｅｉｎｍＲＮＡ：！！！：５ｉ＝ｍ—ｍ椭｛蝻㈣澎渤㈣叭川４｝附录附录３研究生期间的论文酵母Ｅ３连接酶ＤｏａｌＯ的拓扑学结构及其作用底物姜璎慈综述李学礼审校（同济大学医学院生化教研室，上海２０００９２）［中图分类号］Ｑ７５３［文献标识码］Ａ［文章编号］在真核细胞中，许多跨膜蛋白都是从胞质进入内质网（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍ，ＥＲ）经加工或包装或分拣后再进入相关细胞器的。内质网主要通过泛素蛋白酶体途径（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ—ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅｐａｔｈｗａｙ，ＵＰＰ）来清除异常折叠或者错误折叠的蛋白ｎ‘３１，这就是所谓的ＥＲ相关降解（ＥＲ．ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ，ＥＲＡＤ）。除此之外，该途径也参与内质网中正常蛋白的生理性降解，例如固醇生物合成中的限速酶；羟甲基谷胱甘肽辅酶Ａ还原酶Ｈ１。有时也发挥毒性效应，例如：囊肿纤维化。该病主要是由基因突变引发的，囊肿纤维化调节蛋白的单个氨基酸丢失，引起ＥＲ相关蛋白急速降解喵１。泛素蛋白酶体（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ—ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ，ＵＰＳ）与底物结合，在２６Ｓ蛋白酶体作用下从ＥＲ膜／腔进入到胞液呻１。底物的泛素化通常需要蛋白酶高效的运输和降解。泛素化包括泛素与底物蛋白的结合，这要通过一系列的酶促级联反应完成：泛素激活酶（Ｅ１）——由ＡＴＰ提供能量使泛素活化、泛素结合酶（Ｅ２ｓ）——结合并携带被活化的泛素、泛素连接酶（Ｅ３ｓ）——将活化的泛素从Ｅ２转移到需降解的特异底物蛋白上，以便送入２６Ｓ蛋白酶体。Ｅ３分为三种类型，即含ＨＥＣＴ结构域的Ｅ３ｓ、含环指结构域的Ｅ３ｓ和含Ｕ－ｂｏｘ结构域的Ｅ３ｓ，它们对底物的特异识别，呈现蛋白酶体降解的高度选择性。Ｄｏａｌ０是新发现的啤酒酵母中定位于内质网上的重要的Ｅ３连接酶，具有１４个跨膜结构域和一个环指结构（属于上文提到的含环指结构域的Ｅ３ｓ），在许多真核生物ＥＲ应激和ＥＲＡＤ中发挥作用ｎ引。本文就ＤｏａｌＯ的环指结构、在内质网膜上的拓扑布局以及ＤｏａｌＯ酶作用底物作一简短综述。１．酵母ＤｏａｌＯ的拓扑学结构１．１ＯｏａｌＯ的拓扑布局研究者利用标准跨膜结构预测工具和ＤｏａｌＯ密切相关种属蛋白的氨基酸序列，对ＤｏａｌＯＥ３连接酶的复杂拓扑结构进行详细的预测。ＤｏａｌＯ蛋白，１５１ｋＤａ，含有１４个跨膜螺旋结构，其序列的大部分（约６３％）都朝向内质网膜的胞浆侧，包括Ｎ末端和Ｃ末端，只有约１４％朝向内质网腔ｎ３。胞浆侧的各个回路长度约２ｌ～２５０个残基，而内质网腔一侧的相对较短，大约３－－－４８个。由此推测ＤｏａｌＯ蛋白与其他蛋白发生关联的部位很可能是内质网膜的胞质体侧。这些大面积的跨膜域可能是ＤｏａｌＯＥ３酶底物从内质网转移到细胞浆中的通道。１．２ＤｏａｌＯ的ｗｗ－ｍｏｔｉｆ结构ＤｏａｌＯ蛋白的第７７５至第８０７残基序列与“删～ｍｏｔｉｆ＂结构基本一致。经典收稿日期：２００８—１２—１２作者简介：姜璎慈（１９８１－），女，硕士研究生．Ｅ－ｍａｉｌ：ｊｉａｎｇｙｉｎｇｃｉ６６６９０ｙａｈｏｏ．ｃｎ附录的ｗｗ咖ｏｔｉｆ具有三个标准的Ｂ一折叠，可与含有“ＰＰｘＹ＂结构的蛋白识别进而结合吲。与ＤｏａｌＯ协同作用的Ｅ２—Ｕｂｃ６，就含有“ＰＰｘＹ”片段。然而，ＤｏａｌＯ的拓扑图显示，其７７５－８０７处是跨膜螺旋的一部分，因此，除非ＤｏａｌＯ该片段具有高度能动性，可以从膜中移动出来，否则很难形成ＷＷ—Ｂ一折叠。１．３ＤｏａｌＯ与ＴＥＢ４编码ＤｏａｌＯ的同源序列在几乎所有的真核基因组中都有表达，这些同源序列包括人膜蛋白ＴＥＢ４（也叫做ＭＡＲＣＨ－ＶＩ）ｎ５ｌ。ＤｏａｌＯ与ＴＥＢ４的Ｎ末端，都有一个环指结构域称为ＲＩＮＧ—ＣＨｎ７１，由两个锌离子与八个氨基酸螯合而成，其第四位是半胱氨酸，第五位是组氨酸。这个保守的ＲＩＮＧ－ＣＨ是ＲＩＮＧ－型Ｅ３的一个亚型，许多病毒蛋白和至少１１种人蛋白属于这一亚型。ＤｏａｌＯ蛋白的第６２８至７５７氨基酸残基处的序列和ＴＥＢ４极其相似，这一区域称为ＴＥＢ４一ＤｏａｌＯ（ＴＤ）域ｕ射。高度同源的ＴＤ域包含三个跨膜域，其中同源性最高的区域在朝向胞浆侧。ＴＤ域只存在于ＤｏａｌＯ同源的蛋白中。除了序列上的不同，ＤｏａｌＯ与ＴＥＢ４的拓扑结构非常相似，这说明酵母和人蛋白有作用上的保守性。２．ＤｏａｌＯ的膜和可溶性底物２．１ＤｏａｌＯ的Ｅ３连接酶活性泛素聚合体与底物结合，在２６Ｓ蛋白酶体的作用下使底物降解。底物中的降解信号／降解决定子可被Ｅ３或Ｅ３一Ｅ２复合物识别，这些降解信号／决定子在底物间的变化很大，仅仅一部分被标识。啤酒酵母转录因子Ｍａｔ２是一种核蛋白，Ｑ可以被泛素蛋白酶体系统降解。ＭａｔＱ２的降解有两条途径：一条依赖于Ｅ２ｓ中的Ｕｂｃ４和Ｕｂｃ５，另一途径利用内质网上的Ｅ２ｓ，即Ｕｂｃ６和Ｕｂｃ７以及内质网／核膜的ＤｏａｌＯ哺１。后一途径可识别现已明确的降解决定子：Ｄｅｇｌ。ＤｏａｌＯ的Ｅ３连接酶作用就是在可溶性Ｍａｔ２转录因子的降解过程中首先被发现的ｎ¨。Ｑ到目前为止，已知的啤酒酵母中定位于ＥＲ上的两个Ｅ３连接酶是Ｈｒｄｌ／Ｄｅｒ３瞪’１０１和ＤｏａｌＯ。它们都是跨膜蛋白，并且都具有ＲＩＮＧ－ＣＨ型环指结构，属于Ｅ３ｓ环指家族成员ｎ２ｌ。ＤｏａｌＯ的ＥＲ相关底物，比如ＡＴＰ结合盒子转运体Ｓｔｅ６（ＡＴＰ－ｂｉｎｄｉｎｇｃａｓｓｅｔｔｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒＳｔｅ６）的突变形式，膜｝ｒ—ＡＴＰａｓｅ的Ｐｍａｌ突变体，直接证明了ＤｏａｌＯ与ＥＲＡＤ途径的关系。ＤｏａｌＯ的缺失导致内质网未折叠蛋白堆积引起轻微的应激反应，若同时缺失ＯｏａｌＯ和Ｈｒｄｌ，应激反应将会进一步恶化。这些都提示，ＤｏａｌＯ是酵母ＥＲ应激和降解途径中的重要成分。２．２ＤｏａｌＯ途径见于膜蛋白和可溶性蛋白一直以来，ＤｏａｌＯ都被看做是ＥＲ胞质一侧的降解决定性物质，Ｈｒｄｌ则是对腔内一些特有结构的蛋白起识别作用。随着研究深入，对Ｈｒｄｌ和ＤｏａｌＯ的认识也得到提升，它们的作用底物有些在膜的同一侧，有的在膜的不同区域。现已证实ＤｏａｌＯ催化膜蛋白及可溶性蛋白的泛素化，只是在泛素化后，进入蛋白酶体的靶向机制不尽相同。并且ＤｏａｌＯ与底物识别结合需要泛素结合酶ＵＢＣ６，ＵＢＣ７，以及ＵＢＣ７的辅助因子Ｃｕｅｌ，表现ＥＲ－Ｅ３酶活性。２．３新发现的Ｄｏａｌ０膜和可溶性底物ＮｄｃｌＯ－２肌动蛋白是ＤｏａｌＯ途径的一个可溶性底物ＮｄｃｌＯ是着丝粒ＤＮＡ—ＣＢＦ３复合物的一个亚基，与核内有丝分裂纺锤体微管相关联ｕ叭。ＮｄｃｌＯ－２突变体对温度极其敏感，但是在缺少Ｕｂｃ６／Ｕｂｃ７时敏感性受２．３．１．到抑制口１。这可能反映了Ｎｄｃｌ０－２蛋白的代谢稳定性。实验证明，ＤｏａｌＯ缺失时，ＮｄｃｌＯ一２突变体对温度的敏感性也受到抑制，并且与ＮｄｃｌＯ一２突变体的降解有关。６１附录在Ｄｏａｌ０缺失时，Ｎｄｃｌ０－２突变体的降解大大减弱。Ｄｏａｌ０参与Ｎｄｃｌ０—２突变体的降解过程。２．３．２Ｎｄｃｌ０－２抑制因子的突变产物Ｋｏｐｓｋｉ和Ｈｕｆｆａｋｅｚ．【７１在１９９７年发现四种Ｎｄｃｌ０－２抑制因子复合物。其中的两种Ｋｉｓｌ和Ｋｉｓ２，它们的突变产物分别被Ｕｂｃ７和Ｕｂｃ６结合，另外两种Ｋｉｓ３和Ｋｉｓ４，还不明确它们的突变体可被哪种泛素蛋白酶体识别。已知Ｄｅｇｌ是Ｄｏａｌ０途径中的降解决定子，在转入Ｋｉｓ３突变体Ｋｉｓ一６６的细胞中，Ｄｅｇｌ迅速降解，并且Ｄｏａｌ０途径相关蛋白在Ｄｅｇｌ降解过程中大量消耗…１。由此推测Ｋｉｓ３—６６突变体通过Ｄｏａｌ０途径进行降解。２．３．３Ｍｐｓ２—１突变体与Ｄｏａｌ０ｐｏｌｅＤｏａｌ０的一个膜底物是Ｍｐｓ２—１突变体，Ｍｐｓ２是一个单通道膜蛋白，它协助纺锤体（ｓｐｉｎｄｌｅｂｏｄｙ，ＳＰＢ）链接到核膜。对热敏感的Ｍｐｓ２－１突变体是个短暂性蛋白，当处于高温状态，Ｍｐｓ２－１就从ＳＰＢ上消失了¨刳。实验数据显示，３７‘Ｃ条件下，过表达Ｍｐｓ２－１的细胞在缺失Ｃｕｅｌ、Ｕｂｃ６、Ｕｂｃ７的状态下生长受到抑制，并且Ｍｐｓ２－１从ＳＰＢ上消失的速度以及降解速度也大大减弱。这些现象在缺失ＤｏａｌＯ的Ｍｐｓ２一ｌ过表达细胞中同样得到证实。由此提示，Ｍｐｓ２—１同样通过Ｄｏａｌ０途径进行降解。２．４Ｃｄｃ４８参与Ｄｏａｌ０膜底物降解Ｄｏａｌ０可催化膜蛋白及可溶性蛋白的泛素化，Ｃｄｃ４８ＡＴＰａｓｅ促进Ｄｏａｌ０膜底物蛋白的降解，比如Ｄｏａｌ０膜底物Ｄｅｇｌ的降解。在Ｄｏａｌ０途径中，Ｃｄｃ４８并不是作为一个常规的蛋白酶接头来衔接底物和蛋白酶体或者将底物带进蛋白酶体，而很可能是协助底物从膜中转移。３．总结Ｅ３连接酶是泛素化过程中最重要的酶，它通过调控蛋白的泛素化过程参与细胞内的多种生理过程。Ｅ３连接酶对靶蛋白的特异性识别决定了泛素化的特异性。酵母一直是研究Ｅ３连接酶的重要载体，酵母Ｄｏａｌ０是广泛的看家基因，可与多种蛋白特异性识别作用，Ｄｏａｌ０泛素Ｅ３连接酶在绝大多数真核生物ＥＲ应激和降解途径中都发挥重要的作用。Ｄｏａｌ０对底物识别结合的具体作用机制有待进一步研究。［参考文献］［１］ＳｔｅｆａｎＧＫｒｅｆｔ，ＬｉｎＷａｎｇ，ｅｔａ１．ＭｅｍｂｒａｎｅｔｏｐｏｌｏｇｙＢｉｏｅｈｅｍ，２００６，２８ｏｆｔｈｅＤｏａｌＯｕｂｉｑｕｉｔｉｎｌｉｇａｓｅ．阴１（８）：４６４６－４６５３．ＳＫ，ＧｏｒａｄｉａＡ，ｅｌ：ａ１．ＨＲＤ４／ＮＰＬ４ｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｔｈｅｐｒｏｔｅａｓｏｍａｌ【２】ＢａｙｓＮＷ，Ｗｉｌｈｏｖｓｋｙ【３】ＢｏｒｄａｌｌｏＪ，ＰｌｅｍｐｅｒｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇｏｆｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｅｄＥＲｐｒｏｔｅｉｎｓ．［Ｊ］ＭｏｌＢｉｏｌＣｅｌｌ，２００１，１２：４１１“１２８．ＲＫ，ＦｉｎｇｅｒＡ，ｅｔａ１．Ｄｅｒ３ｐ／Ｈｒｄｌｐｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍ—ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆｍｉｓｆｏｌｄｅｄｌｕｍｅｎａｌａｎｄｉｎｔｅｇｒａｌｍｅｍｂｒａｎｅＣｅｌｌ，１９９８，９：２０９－２２２．ｐｒｏｔｅｉｎｓ．【Ｊ】ＭｏｌＢｉｏｉ【４】ＷｈｉｍｅｙＡ，ＮｅｗＨａｖｅｎ．ＭｅｍｂｒａｎｅａｎｄｓｏｌｕｂｌｅｓｕｂｓｔｒａｔｅｓｏｆｔｈｅＤｏａｌ０ｕｂｉｑｕｉｔｉｎｄｅｇｒａｄｅｄｂｙｄｉｓｔｉｎｃｔｐａｔｈｗａｙｓ．【Ｊ】ＴｈｅＥＭＢＯＪｏｕｍａｌ，２００６，２５：５３３－５４３．ｌｉｇａｓｅ眦【５】ＢｏｔｅｒｏＤ，ＧｅｒｅｂｅｎＢ，ＧｏｎｅａｌｖｅｓＣ，ｅｔａ１．Ｕｂｃ６ｐａｎｄＵｂｅ７ｐａｒｅｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｎｏｒｍａｌａｎｄｓｕｂｓｔｒａｔｅ··ｉｎｄｕｃｅｄｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍ··ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｈｕｍａｎｓｅｌｅｎｏｐｒｏｔｅｉｎｔｙｐｅ２ｉｏｄｏｔｈｙｒｏｎｉｎｅｍｏｎｏｄｅｉｏｄｉｎａｓｅ．【Ｊ】ＭｏｌＭ．ＡＥｎｄｏｅｒｉｎｏｌ，２００２，１６：１９９９－２００７．【６】ＳｗａｎｓｏｎＫＬｏｃｈｃｒＭ，Ｈｏｅｈｓｔｒａｓｓｅｒｃｏｎｓｅｒｖｅｄｕｂｉｑｕｉｔｉｎｌｉｇａｓｅｏｆｔｈｅｎｕｃｌｅａｒｅｎｖｅｌｏｐ－ｅ／ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｅｕｌｕｍｔｈａｔｆｕｎｃｔｉｏｎｓｉｎｂｏｔｈＥＲ··ａｓｓｏｃｉａｔｅｄａｎｄＭａｔａｌｐｈ·．ａ２ｒｅｐｒｅｓｓｏｒｄｅｇｒａｄｅ附录·ａｔｉｏｎ．【Ｊ］ＧｅｎｅｓＤｅｖ，２００１，１５：２６６０’２６７４．ＴＣ．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓｏｆｔｈｅｎｄｃｌ０—２ｍｕｔａｔｉｏｎ：ａｒｏｌｅｆｏｒｔｈｅｕｂｉｑｕｉｔｉｎｓｙｓｔｅｍ【７】ＫｏｐｓｋｉＫＭ，Ｈｕｆｆａｋｅｒ【８】ＨｕｙｅｒｉｎＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅｋｉｎｅｔｏｅｈｏｒｅＧ，Ｐｉｌｕｅｋｆｕｎｃｔｉｏｎ．【Ｊ］Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９７，１４７：４０９－－４２０．ＷＦ，ＦａｎｓｌｅｒＺ，ｅｔａ１．ＤｉｓｔｉｎｃｔｍａｃｈｉｎｅｒｙｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄｉｎＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅｆｏｒｔｈｅｅｎｄｏｐ－ｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍ—ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆａｍｕｌｔｉｓｐａｎｎｉｎｇｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎａｎｄａｓｏｌｕｂｌｅｌｕｍｉｎａｌｐｒｏｔｅｉｎ．【Ｊ】ＢｉｏＩＣｈｅｍ，２００４，２７９：３８３６％８３７８．ａｌｌ【９】ＤｅｎｇＭ，ＨｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒＭ．Ｓｐａｔｉａｌｌｙｌｉｇａｓｅ．【Ｊ】ＪＮａｔｕｒｅ．２００６Ｏｃｔ１ｒｅｇｕｌａｔｅｄｕｂｉｑｕｉｔｉｎｌｉｇａｔｉｏｎｂｙＥＲ／ｎｕｃｌｅａｒｍｅｍｂｒａｎｅ９；４４３（７１１３）：８２７－３１．ａｎｄｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｓｔｅｒｏｌｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎｔｈｅｙｅａｓｔＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ【１０】ＬｏｅｒｔｓｃｈｅｒＪ，ＬａｒｓｏｎＬＬ，ＭａｔｓｏｎＣｌ（，ｅｔａ１．Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍ．ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｃｏｌｄａｄａｐｔａｔｉｏｎｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．【Ｊ】ＥｕｋａｒｙｏｔＣｅｌｌ，２００６Ａｐｒ；５（４）：７１２－７２２．ｃｈａｐｅｒｏｎｅＳｈｒ３ａｓｓｉｓｔｓｉｎｆｏｌｄｉｎｇａｍｉｎｏａｃｉｄ【１１】ＫｏｔａＪ，ＧｉｌｓｔｒｉｎｇＣＦ，ＬｊｕｎｇｄａｈｌＰＯ．ＭｅｍｂｒａｎｅｐｅｒｍｅａｓｅｓｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇｐｒｅｃｏｃｉｏｕｓＥＲＡＤ．【Ｊ】ＣｅｌｌＢｉｏｉ．２００７Ｆｅｂ２６；１７６（５）：６１７．６２８．【１２］ＭｃＢｒａｍｅｙＳ，ＷｉｎｅｙＭ．Ｍｕｔａｎｔｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎｏｆｔｈｅｂｕｄｄｉｎｇｙｅａｓｔｓｐｉｎｄｌｅｐｏｌｅｂｏｄｙｔａｒｇｅｔｅｄｔｏｔｈｅｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｉｓｐａｔｈｗａｙ．【Ｊ］Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００２，１６２：５６７－５７８．２０：７３—８４．［１３］ＲｉｃｈｌｙｔｏＨ，ＲａｐｅＭ，ＢｒａｕｎＳ，ｅｔａ１．ＡｓｅｒｉｅｓｏｆｕｂｉｑｕｉｔｉｎｂｉｎｄｉｎｇｆａｃｔｏｒｓｃｏｎｎｅｃｔｓＣＤＣ４８／ｐ９７ｓｕｂｓｔｒａｔｅｍｕｌｔｉｕｂｉｑｕｉｔｙｌａｔｉｏｎａｎｄｐｒｏｔｅａｓｏｍａｌｔａｒｇｅｔｉｎｇ．【Ｊ】Ｃｅｌｌ，２００５，１【１４］ＳｃｈｕｂｅｒｔｈＣ，ＢｕｃｈｂｅｒｇｅｒＡ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ—ｂｏｕｎｄＵｂｘ２ｒｅｃｒｕｉｔｓＣｄｅ４８ｔｏｕｂｉｑｕｉｔｉｎｉｉｇａｓｅｓａｎｄｅｎｓｕｒｅｔｈｅｉｒｓｕｂｓｔｒａｔｅｓｔｏｌ７：９９参一１００６．ｅｆｆｉｃｉｅｎｔＥＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．【Ｊ】ＮａｔＣｅｌｌＢｉｏ，２００５，［１５］ＳｃｏｔｔＤＣ，ＳｃｈｅｋｍａｎＲ．ＲｏｌｅｏｆＳｅｃ６１ｐｉｎｔｈｅＢｉ０１．２００８；１８ＥＲ—ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ１０５．ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆｓｈｏｒｔ－ｌｉｖｅｄｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎｓ．［Ｊ】Ｃｅｌｌｐｒｏｔｅｉｎ１（７）：１０９５－ｌ【１６］ＶａｒｓｈａｖｓｋｙＡ．Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ【１７］ＶａｓｈｉｓｔＥＲｑｕａｌｉｔｙｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．【Ｊ】ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｅｈｅｍＳｃｉ，２００５，３０：２８３－２８６．ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＳ，ＮｇＴ’ｅｔａ１．Ｍｉｓｆｏｉｄｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓ玳ｓｏｒｔｅｄｂｙａｃｏｎｔｒ０１．【Ｊ】ＣｅｌｌＢｉｏｌ，２００４，１６５：４１－５２．Ｋ３ｆａｍｉｌｙ【１８］ＬｅｈｎｅｒＰＪ，ＨｏｅｒＳ，ＤｏｄｄＲｅｔａ１．ＤｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌｓｕｒｆａｃｅｒｅｃｅｐｔｏｒｓｂｙｔｈｅｏｆｖｉｒａｌａｎｄｃｅｌｌｕｌａｒｕｂｉｑｕｉｔｉｎＥ３ｌｉｇａｓｅｓ．【Ｊ】ＩｍｍｕｎｏｌＲｅｖｉｅｗ，２００５，２０７：１１２．１２５．附录实时荧光定量ＰＣＲ检测大鼠各组织中ＴＥＢ４基因及其截短体的表达张红娟，李学礼，姜璎慈（同济大学基础医学院生物化学与分子生物学实验室．上海２０００９２）【摘要】目的通过实时荧光定量ＰＣＲ技术检测ＴＥＢ４基因及其截短体在内脏组织和脑组织中的表达差异。方法提取ＳＤ火鼠内脏组织（，心、肝）和脑组织（火脑、小脑、海马）中的ＲＮＡ．在ＴＥＢ４基因内，分别设计不包含截短体和包含截短体序列的两对引物，Ｒｌ和Ｒ２。采用相对定量法进行实时荧光定量ＰＣＲ，检测大鼠各组织中ＴＥＢ４基因及其截短体的表达。结果ＴＥＢ４及其截短体的ｍＲＮＡ丰度在肝脏组织中最高，在其他组织中表达量均较低。截短体的表达量在这些组织中均远高于ＴＥＢ４。讨论证实了ＴＥＢ４的截短体独立于ＴＥＢ４而单独存在，ＴＥＢ４与其截短体在脑组织中并朱特异表达，它们都具有，“泛的看家功能。【关键词】ＴＥＢ４基因；截短体；实时荧光定量ＰＥＲＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＴＥＢ４ａｎｄｉｔｓｃｌｉｐｐｉｎｇｉｎｒａｔｅｓｔｉｓｓｕｅｓＢｙｕｓｉｎｇＲｅａｌ—ｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲｍｅｔｈｏｄＺＨＡＮＧＨｏｎｇ－ＪｎａｎＬＩＸｕｅ－ｌｉＪＩＡＮＧＹｉｎｇ－ｅｉｏｆｍｅｄｉｃｉｎｅ，ＴｏｎｇＪｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，（ＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＳｈａｎｇｈａｉ，２０００９２，Ｃｈｉｎａ）ａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｌｅｇｅ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏａｎａｌｙｚｅｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＴＥＢ４ａｎｄｉｔｓｃｌｉｐｐｉｎｇｉｎｒａｔｔｅｒ’Ｓｏｒｇａｎｓａｎｄｂｒａｉｎｔｉｓｓｕｅｓ．ＭｅｔｈｏｄｓＴｈｅＲＮＡｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍＳＤＲａｔｔｅｒ’Ｓｏｒｇａｎｓｔｉｓｓｕｅｓ（１ｉｖｅｒ、ｈｅａｒｔ）ａｎｄｗｈｉｃｈｉｓｔｉｓｓｕｅｓ（ｃｅｒｅｂｅｌｌａ、ｃｅｒｅｂｒａ、ｈｉｐｐｏｃａｍｐｉ）．ＴｏｄｅｓｉｇｎｔｗｏｇｒｏｕｐｓｏｆｐｒｉｍｅｒｓｉｎｃｌｕｄｅｄＴＥＢ４ａｎｄｅｘｃｌｕｄｅｄｉｔｓｃｌｉｐｐｉｎｇａｎｄＲ２ｗｈｉｃｈｉｓｂｏｔｈｉｎｃｌｕｄｅｄＴＥＢ４ａｎｄａｎａｌｙｚｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＴＥＢ４ｂｒａｉｎＲ１ｉｔｓｃｌｉｐｐｉｎｇ．Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲＷａｓｕｓｅｄｔｏｔｉｓｓｕｅｓ．ＲｅｓｕｌｔｓＴｈｅａｎｄｉｔｓｃｌｉｐｐｉｎｇｉｎｔｈｅｓｅｈｉｇｈｅｓｔｍＲＮＡｌｅｖｅｌｓｏｆＴＥＢ４ａｎｄｉｔｓｃｈｉｐｐｉｎｇｗｅｒｅｐｒｅｓｅｎｔｉｎｌｉｖｅｒ．ｎｅｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｅｘｐｒｅｓｓｅｄｔｈｅｓａｍｅｌｏｗｌｅｖｅｒｓｉｎｏｔｈｅｒｔｉｓｓｕｅｓｗｈｉｌｅｔｈｅｃｈｉｐｐｉｎｇｅｘｐｒｅｓｓｅｄｍｕｃｈＴＥＢ４ｉｎａｌｌｔｈｅｓｅｔｉｓｓｕｅｓ．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＴｈｅｃｈｉｐｐｉｎｇｈａｓｂｅｅｎｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄＴＥＢ４ｇｅｎｅｓ·ｂｅｓｉｄｅｓＴＥＢ４ｉｔｓｅｌｆ．Ｂｏｔｈａｎｄｉｔｓｃｌｉｐｐｉｎｇｈａｖｅｎｏｓｐｅｃｉａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｂｒａｉｎｔｉｓｓｕｅｓ．Ａｎｄｔｈｅｙｂｏｔｈａｃｔａｓｆａｍｉｌｙ［ＫｅｙＷｏｒｄｓ］ＴＥＢ４ｇｅｎｅ；ｃｌｉｐｐｉｎｇ；Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ人类ＴＥＢ４基因定位于染色体５ｐ１５．２处，编码９１０个氨基酸，是～个新的定位于内质网的含有Ｃ４ＨＣ３环指的泛素Ｅ３连接酶。ＴＥＢ４在许多器官表达，如心、脑、胎盘、肺、骨骼肌、肾、胰、脾、胸腺、前列腺、睾丸、卵巢和小肠…，在细胞中参与广泛的看家功能。本实验室老师利用指纹图谱技术，对帕金森病患者的黑质区Ｌｅｗｙ小体特异表达基因进行筛选，发现了ＴＥＢ４的截短体旧１。许多具有环指结构的Ｅ３连接酶也都是控制着神经退行性疾病和大脑发育的相关蛋白¨１。大鼠的ＴＥＢ４基因与人类的ＴＥＢ４基因具有高度的同源性（８８％），且存在相似附录的截短体。本研究分别提取大鼠的内脏组织（肝、心）和脑组织（大脑、小脑、海马），通过实时荧光定量ＰＣＲ技术检测ＴＥＢ４基因及其截短体在这些组织中的表达差异，从而推断它们功能上的差异。１材料与方法１．１大鼠组织的提取及ＲＮＡ的分离清洁型成年ＳＤ（Ｓｐｒａｇｕｅ．Ｄａｗｌｅｙ）大鼠３只，３月龄，体重２５０克左右，购自复旦大学实验动物中心。采用３％戊巴比妥钠腹腔注射（Ｏ．１ｍＦｌＯＯｇ）麻醉，无菌条件下行上腹部正中切口，分别取其心、肝、大脑、小脑和脑皮质海马组织。用Ｔｒｉｚｏｌ提取其总ＲＮＡ，紫外分光光度法测定ＲＮＡ含量与纯度，琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。不同组织的５管ＲＮＡ分别定量３１．ｔｇ，并进行无ＲＮＡ酶的ＤＮａｓｅＩ处理，作为逆转录的模板。１．２ｃＤＮＡ的获得和引物设计逆转录采用２５１上１的反应体系，反应管中加入３１ｘｇＲＮＡ，５ｘｆｉｒｓｔ－ｓｔｒａｎｄＢｕｆｆｅｒ５此，终浓度为ｌｍｍｏｌ／Ｌ的ｄＮＴＰ４１１Ｌ，Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）０．５ｕｇ／ｕｌｌｌｘＬ，Ｍ．ＭＬＶ逆转录酶ｌｌｘＬ（１２０Ｕ）（Ｐｒｏｍｅｇａ公司）。按以下步骤操作：６５℃５ｍｉｎ，４０℃６０ｍｉｎ．７０℃１５ｍｉｎ。如上述，根据ＴＥＢ４基因及其截短体的分布，分别设计引物Ｒ１（包含在ＴＥＢ４以内而在截短体以外的基因段），Ｒ２（同时包含在ＴＥＢ４和截短体内的基因段）。Ｒ１上游引物为５’ＣＴＣＴＴＧＡＴＣＡＧＡＣＴＣＣＣＣ册ＣＴＡＣ３’，下游引物为３’，下游引物为５’ＧＣＣＡＣＴＧＣＣＧＣＡＴＣＣＴＣＴＴ３’，ＡＧＡＴＧＣＧＧＣＡＴＧＣＴＧＴ从ＧＡ３’，扩增片段１３５ｂｐ。内参１３一ａｃｔｉｎ上游引物为５’ＧＧＣＡＴＣＧＧＡＡＣＣＧＣＴＣＡ５’ＧＧＴＣＧＡＴＧＴＴＡＣＧＡＡＴＧＣＣ甜ｒＴ３’，扩增片段１５５ｂｐ。Ｒ２上游引物为５’ＣＣＴＴＣＡＣＧＧＣＴＡＣＣ丸盯ＣＣＡ下游引为５’３’，物扩增片段９１ｂｐ。所有引物由上海生工公司合成。１．３实时荧光定量ＰＣＲ１．３．１制作标准曲线和结果计算５此，行１０倍梯度稀释４次（１，１：ｌ，１：１００，ｌ：１０００和ｌ：ｌＯ０００），每个浓度各取２此ＤＮＡ作实时荧光定量ＰＣＲ分别扩增ＴＥＢ４和１３－ａｅｔｉｎ取心脏组织的ｅＤＮＡ基因，每个浓度作２个复孔。在扩增过程中，ＦＴＣ２０００荧光定量分析仪自动读出Ｃｔ值，并以模板浓度的对数为横坐标，Ｃｔ值为纵坐标，绘制出标准曲线。利用待测样本的Ｃｔ值（两个复管的平均值）求出相应的基因拷贝数，以待测基因的拷贝数与内参ＧＡＰＤＨ的拷贝数的比值作为检测结果。１．３．２大鼠各组织的实时荧光定量ＰｃＲ３只大鼠的５个组织（心、肝、大脑、小脑、海马），分别由３种引物（Ｒ１、Ｒ２、１３－Ａｃｔｉｎ）进行ＰＣＲ，每个浓度作２个复孔。ＰＣＲ反应为两步法，试剂采用大连宝生物工程有限公司的ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑｌ’。其中ｅＤＮＡ２１．ｔＬ（１０倍稀释样），引物ｌＩ．ｔＬ（终浓度０．２州），２×ＳＹＢＲＨＳ，ｄＮＴＰｓ，Ｍ９２＋，ＳＹＢＲＴａｑ瑾１０此（内含ＴａＫａＲａＥｘＴａｑＧｒｅｅｎＩ等），反应体系共２０此。按下列条件扩增：９５＂１２１０ＰｒｅｍｉｘＥｘ秒预变性，然后９５℃５秒，６０℃３０秒，共４０个循环。２结果２．１大鼠引物和１３－ａｃｔｉｎ的扩增效率以起始拷贝数的自然对数为横坐标，以循环阈值为纵坐标，每次实验均可得到一条严格的直线型标准曲线，这证实了用Ｃｔ值进行定量的准确性。由标准曲线的斜率确定Ｒ１、Ｒ２和Ｄ．ａｃｔｉｎ的扩增效率基本一致。６５附录２．２ＴＥＢ４及其截短体在各组织中表达量比较分析ＴＥＢ４及其截短体在内脏组织（心、肝）和脑组织（大脑、小脑、海马）中的表达，结果显示在肝脏中高表达，差异极显著（Ｐ＜ｏ．０１），在心、大脑、小脑和海马组织中的表达量均较低，无显著差异（图２）。３５∞２５譬ｚｏ磐１５塘１０５ＯＯＲＩ：ｙ＝－３．３４１２ｘ＋３５．２２５Ｒ２：０．９９４７－Ｒ２：ｙ＝－３．２８０６ｘ＋３０．１３３Ｒｈ０．９９２８Ａｌ昏－Ａｃｔｉｎ：ｙ＝－３．２３０４ｘ＋２４．８１２Ｒｈ０．９８０４图１Ｒ１、Ｒ２和Ｂ－Ａｃｔｉｆｌ的标准曲线ＦｉｇｌｔｈｅｓｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅｏｆＲ１、Ｒ２ａｎｄｐＡｃｔｉｎｆ·翻葫而●●心图２Ｒ１与Ｒ２表达量的比值图３Ｆｉ９２ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｒａｔｉｏＡｎｄ工■●嫡工●■憎●鸫ＴＥＢ４截短体与ＴＥＭ表达量的比值ｃｌｉｐｐｉｎｇａｎｄＴＥＢ４ｏｆＲｌ恤ＡｃｔｉｎＦｉ９３ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｒａｔｉｏｏｆＴＥＢ４’ＳＲ２／ｐ－Ａｃｔｉｎ２．３同组织中ＴＥＢ４和截短体的表达量比较结果显示，在肝组织中截短体的表达量高于ＴＥＢ４约４倍，而在其他组织中都在截短体的表达量略高于ＴＥＢ４（图３），差异极显著（Ｐ＜ｏ．０１）。３讨论ＴＥＢ４是一个新近发现的基因，其序列在人、鼠、线虫等许多物种中高度保守Ⅲ。本实验证实了ＴＥＢ４及其截短体在大鼠体内的存在。大鼠ＴＥＢ４表达１０１５个氨基酸，其截短体表达４９０个氨基酸，位于ＴＥＢ４蛋白的Ｎ端（图３）。图２显示，ＴＥＢ４的截短体独立于ＴＥＢ４表达，分别行使不同的功能。ＴＥＢ４ｊ１■●■■■■■■■■■■■—■—■ｌ截短体■■■—■—Ｉ１０１５从４９０从附录图４ＴＥＢ４与其截短体的氨基酸序列关系Ｆｉ酣ｔｈｅｒｅｌｍｉｏｎｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓｂｅｔｗｅｅｎＴＥＢ４ａｎｄｉｔｓｃｈｉｐｐｉｎｇＴＥＢ４定位于内质网上，包含一个环指结构和多个跨膜域。这个环指结构位于蛋白的Ｎ端，具有特殊的Ｃ４ＨＣ３结构，在Ｃ端包含１３个跨膜域Ⅲ。ＴＥＢ４的截短体位于Ｃ端，编码其广阔的跨膜域。在泛素结合酶参与的赖氨酸第４８特异位点泛素反应中Ｈ１，分离的ＲＩＮＧ域在体外能催化泛素的连接。ＴＥＢ４作为Ｅ３连接酶参与内质网相关蛋白的降解。肝脏在人体蛋白质的新陈代谢上占有重要位置，ＴＥＢ４及其截短体在肝脏中的高表达可能与肝脏强大的解毒功能有关。ＴＥＢ４的截短体是在筛选帕金森病患者的黑质区Ｌｅｗｙ小体特异表达基因时发现的盟１。本实验结果表明在正常脑组织中，ＴＥＢ４的截短体无特意表达，和ＴＥＢ４一起行使广泛的看家功能。作为Ｅ３连接酶，ＴＥＢ４与Ｐａｒｋｉｎ基因一样，属于一个保守的泛素样和环指结构的蛋白质家族，与Ｅ２偶联酶Ｕｂｅ６和Ｕｂｃ７作用口］，来抑制由于内质网上异常未折叠蛋白引起的细胞死亡。一些神经退行性疾病与泛素蛋白酶体相关蛋白的水解有关，包括内质网相关蛋白的降解口剖。本实验室利用酵母双杂交技术，找到一种与ＴＥＢ４截短体作用的蛋白——＾ＴＰ合酶Ｆ０部分的６亚基。有文献报道ＡＴＰ合酶上的６亚基变异可引起神经紊乱口］。是否在大脑的神经病体组织，ＴＥＢ４特异表达，表现出Ｅ３连接酶活性降解异常未折叠蛋白，还有待进一步的研究。【参考文献】【１］ＨＡＳＳＩＮＫＧＫＩＫＫＥＲＴＭ，ＶＡＮＶＯＯＲＤＥＮＳ，ｅｔｕｂｉｑｕｉｔｉｎｌｉｇａｓｅｏｆｔｈｅａ１．ＴＥＢ４ｉｓａＣ４ＨＣ３砌ＮＧｆｉｎｇｅｒ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００５，ｏｆ３８８（Ｐｔ２）：６４７－６５５．【２］ＬＵＬ，ＮＥＦＦＦ＇ＡＬＶＡＲＥＺ－ＦＩＳＣＨＥＲＤ，ｅｔｉｎＰａｒｋｉｎｓｏｎ’Ｓａ１．ＧｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｆｉｌｉｎｇＬｅｗｙｂｏｄｙ－ｂｅａｒｉｎｇｎｅｕｒｏｎｓｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．ＥｘｐＳＡＴＯＳ，ｅｔＮｅｕｒｏｌ，２００５，１９５（１）：２７－３９．【３］似ｙｒｏｒｕＮ，ＭＡＣＨＩＤＡＹａ１．ＭｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｎｉｇｒａｌｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｉｎＰａｒｋａｎｄｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｐａｒｋｉｎｐｒｏｔｅｉｎｂｙｏｔｈｅｒｐｒｏｔｅｉｎｓ．【门ＮｅｕｒａｌＴｒａｎｓｍ．ＬｉｆｅＳｃｉ，２００４，Ｓｕｐｐｌ，２００６，（７０）：２０５－２０８．【４］ＦＡＮＧＳ，ＷＥＩＳＳＭＡＮ６１（１３）：１５４６－１５６１．【５］ＢｅｎｃｅＮＦ’ＳａｍｐａｔＲＡＭ．Ａｆｉｅｌｄｇｕｉｄｅｔｏｕｂｉｑｕｉｔｙｌａｔｉｏｎ．【Ｊ】．ＣｅｌｌＭｏｌＭ，ＫｏｐｉｔｏＲ．Ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔｏｆｔｈｅｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅｓｙｓｔｅｍｂｙｐｒｏｔｅｉｎａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，２９２：１５５２－１５５５．【６］ＫＩＳＨＩＮＯＴ＇ＬＡＬＡＮＤＥＭ，ＷＡＧＳＴＡＦＦＪ．ＵＢＥ３Ａ／Ｅ６－ＡＰｓｙｎｄｒｏｍｅ【Ｊ】．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ，１９９７，１５（１）：７０－７３．【７］Ｃｏｒｔｅｓ—ＨｅｍａｎｄｅｚＰ，Ｖａｚｑｕｅｚ－ＭｅｍｉｊｅＭＥ，ＧａｒｃｉａＪＪ，ｅｔａ１．ＡＴＰ６ｈｏｍｏｐｌａｓｍｉｃｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎｈｉｂｉｔａｎｄｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｅｔｈｅｈｕｍａｎＦＩＦ０－ＡＴＰｓｙｎｔｈａｓｅｗｉｔｈｏｕｔｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇｅｎｚｙｍｅａｓｓｅｍｂｌｙａｎｄｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ．［Ｊ］ＢｉｏｌＣｈｅｍ．２００７，２８２：１０５１·８．ｍｕｔａｔｉｏｎｓｃａｕｓｅＡｎｇｅｌｍａｎ６７个人简历个人简历及在读期问发表的学术论文与研究成果个人简历：姜璎慈，女，１９８１年６月生。２００５年６月毕业于齐齐哈尔医学院。２００６年９月一至今，于同济大学攻读营养与食品卫生学硕士学位。已发表、定稿文章：１．姜璎慈，李学礼。酵母Ｅ３连接酶ＤｏａｌＯ的拓扑学结构及其作用底物。同济大学学报。２００９３０（６）：５－８（见附录３）２．李姣，姜璎慈＃，李学礼：Ｉ：，李静琪，吕立夏，徐磊。脑源性神经营养因子在体外诱导ＳＨ—ＳＹ５Ｙ细胞分化过程中的作用。中国神经丙生研究（英文版）杂志。３．张红娟，李学礼，姜璎慈。实时荧光定量ＰＣＲ检测大鼠各组织中ＴＥＢ４基因及其截短体的表达。同济大学学报（见附录３）。6WnsK28XmkxMfhGj477Rl2qY0jqOHEp3gbqa5dh2zKF7oewQ4qexPpQ9jn2RzXXtTtP7POyaR5Ph6bKYC4Exl22xCBGwq8vfgIvY5BDTdU3qjff0NEzu7yzbfQ3foeqDh15sOk1LyxfDHU8vpbWTzCOPMewA9RX0iD4wj4DgXfTilIGDsST4f2CAXaETEiNRhWkhx7c1xMUhT8uNvfbpwjcDrU4fknry8nnJkkn3VWIPdUwANZFJoVQGl7FQTswU89iO2zbnk7izlufhRR1Dnnf1jEpdK8CxiB2kC6M8UZsuVAbykInVy7r9gQu8VsbMmRs5yHVEMpGiHMAzSbm0xy7ZQ3Gziw5mQtdNRinKvO2AVAwj6QBqaupohh9x2YSeGleAqOvrwWflIrG2i6fibWyLzLtwyeovRRZxBhSLDSDUiOIOMbFJMlQXz8JgC4fSzFFne2PLdoNCwXbGO35VT5Js7k0X37UgH7XJ9V4tsSqsEQ5k5gJB1oILHBH4Ovt0kFI4dh9m3R1R6dqXYMYMZU74AkfNawtUTQAI4LXEdiK8X3U2ba8H5DSMxWJYsB0pE989F19HNGuEE8ekJEgLXKebBsOp6gKzP1zi7hhaxoDBIqrWMIVzlyFOKJmXWRsPms86BpEwMCSKvHKydsjRoYcA391vnRwCf9yyQ36RwNzwzFtXOuXzK6cgFDfmJqgdEEd0wpW6BfAertRJkZaxlAKwYk1J4OpRAJOIGDml002aCSgqyJIyOdzrRJKgSyH2G8s6rYJNUXYuJt2JxnRkU8b1Zb2WdVgXsNgdkvo2GSKVLnUFMgY1IFY04ZblxD1RFWMvi8He56wyOXOMexE0kil9qB7V0LEqGEeOr42uT4rYqGa3rBfPxG8Hh5Z7qpdo8yVuF3kHFCb8KF7nDjjhzD0QJuIFD0vc7JHlzr4X70wja6MgE1WMhCI565N0qZ0NX3xnxGwvHYTNVwR1n2zdMDEegIty4hj86QJwPSuM4JUHBOWnICoeJYC5iXyyzs0V3ySk7ijdr8MLJUMjSCHysSaisqMcOhWuDQMfaxo2H5DaNHWKstdqRjtYymgo2WkMRI8cbNJ2PqdmwINEhqSx3oY84uREhxKRTlEi6JiOSm10aBcB52KNFDQwWGSLLlDupS4GVIJvRwa56eYTBGxE34Ttyix0B1CffNL7b9I5DemsnvtquYaQPp66AkkQrAj9WcGToHZp5gd9KDbceF1DwfybozVdEuSrwvaMriEetZykZgLeetCnvhwkUc5JLYies9zfAi2aj124yoFf9TEQCaRKOyblCHvpAEXfACa9Z3aNHVcNU3WpAYDNz08yNAqLSrsDCWLMZywhoj8G1ex7EyV4oy5Dt9FO2XHQWLBBlJ38U6PIm6ssJGYtFEIW8BWuvSZY9sgTOvg8jNqc4tsLivpKmMbhRWxBzBzmR5eWMYVVwSXqLAzvSLCOKaLUQx74m8XE4nzWsKP1ht85Xgji5V04x7zxBWt2QuDrop5vcbpMO6rNY3rM54yu9RvqObqqFbsBm53LDLWUbyZCAYxFBK6mEQbQP42bmjT5JRndZbVJLwHkW7FkXOjsGzIl02VTUREKDFCYSdOkojN4tz1glfPqnpQeB89TG5wg05uI1vWurXEo49zAD0sVkLU6DnkcDa3JmryVk9K0O5gstWLfD9ioXBfxzMZ4tM7h5aImFzMXo43VMLTcqp4W5pM9bCM2ev4gFWF1jexT38FQg0vqxgWItD9ibIwex8GKdGHoYzDryqwdWI80VOFg3QsdXyu9Z6WP1wx6PGQoeIwG69nDVaerhbeu5baGbMkuSFBPX7vBBaYoo3qbYh7niTjLUwQsZq8uBF9sNPnyjteiYrTMqp9sd0h5XZhdLi1sNdHQvTzbMP8C9MknZzDyjMvS5wBV6n2Wml4fJ1s6I2fCbBbkDng4S3kSuIQwFXCvmKIVKIDQzTjjkYe2lNjFxR8KNsWalgRJeYfd5OtCCFBxmYi7vfcy4yxAxuUvhP2Sf2YlA3Zy3wtxPHGGOkNvZm34Hrgkiehohq7i3CaKb5FbIwVWHQKxwraz3BAOzu5ZabVurmSylHNJWO4QIHGpmPZRCDwSAZ2JUH1hQwMGLxB25mtLCMW5FFPviqFTezVhaDcReKrrzpE6wnpG4KvEnAhDJfIryVWV8XvoU6EVfXavopLkb8s7lGgwhIfv89A6jnz3intD6gjDNxjaQqgsgYTIRMc1e8vnHymg7QopGfK0RHLoOPSs7umKARa5rha6PRPDdQdwEvYvbWIwoZkFZUBwnwCP4hcnpXwTYEvAcQDd3aOXstGIka3OzlAbH2Tu8j8GEYuP7WCHQvYuG2z1ssWlLOX6YzRxEHKcgnqcs6PpZzrNGsJ5w9ANKw4P5kbxCh3J1qUHC1n3geMtbtOygLx2yh64YV3huw9HrslAWE9tYAqAEELDAd0i0lLLPYpAjmIKXN7HcPO85bPwvpJyRWlE0VzouIyRstx00nHvnUaUtle0ThBjFu12zEqnERIfGkYSkIqmOiTRJq26ls96KiTrrqWj026sFik19LZV5lYfCqMv9pna1IpH1ujUDbO33iNfioubfYOzfLj1evuoomEktRSHo1T9ETz5tHYh8gN6IorIYjeB4ktmhHbBP0hevWpd00FDrEXpHi32uSsdXYthW9qWi9SNbUiBe3kqRYAzv9bC9FIKSTeENDTelrsecmN8kqxeTXt02MxR4SbYbHQxYpAt4XaDFq0ax1IPNPrKTqeaMffLWwEiW1VRn23gld7mSD3IiVakKGtXQeHXtQsyCsaJuRu0lF2IQEULxk0MnwL8Z5gnovWesHLKujj48zpAQXD0wooPdmlPpY72IEM2JGVy8CRYDh6WC2H0uMsAKMvlHKrTCCw4lX8TUobzirj8ysIc0yTpXOTEoKIWjpVEQwYXAcELbuFpAtJ6uDAc1WtGUsgQjnzvZscue5Wc2R0Z8skcChRtpnTgp6pG 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