盐酸氯苯胍原料药主成分含量及有关物质的测定

佘如凤;张敏;夏溯寒;张丽芳;王霄暘;费陈忠;张洁;薛飞群

【摘 要】为建立测定盐酸氯苯胍原料药中主成分含量及有关物质的超高效液相色谱法,采用ACQU-ITY UPLC BEH C18柱(1.7μm,2.1 mm×100 mm),以乙腈-2 mL/L磷酸水(V:V=40:60)为流动相,检测波长为313 nm,进样量10μL.在优化的色谱条件下,主成分与各杂质峰分离度良好,盐酸氯苯胍在15μg/mL～35μg/mL范围内线性关系良好(R 2=0.999),低、中、高浓度样品的平均回收率分别为100.85％、100.61％、100.40％,相对标准偏差(RSD)分别为1.50％、0.07％、0.64％.盐酸氯苯胍的主要杂质为保留时间1.612的R1和5.416的R2,以主成分自身对照法计算,暂定单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.16倍(0.16％),各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的0.26倍(0.26％).该方法分离时间短,检出限低,分离度好,结果准确、可靠,可作为盐酸氯苯胍及其有关物质的检测方法. 【期刊名称】《动物医学进展》 【年(卷),期】2019(040)003 【总页数】6页(P76-81)

【关键词】盐酸氯苯胍;有关物质;超高效液相色谱法

【作 者】佘如凤;张敏;夏溯寒;张丽芳;王霄暘;费陈忠;张洁;薛飞群

【作者单位】中国农业科学院上海兽医研究所/农业农村部兽用化学药物及制剂学重点实验室,上海 200241;中国农业科学院上海兽医研究所/农业农村部兽用化学药物及制剂学重点实验室,上海 200241;中国农业科学院上海兽医研究所/农业农村部兽用化学药物及制剂学重点实验室,上海 200241;中国农业科学院上海兽医研究所/

农业农村部兽用化学药物及制剂学重点实验室,上海 200241;中国农业科学院上海兽医研究所/农业农村部兽用化学药物及制剂学重点实验室,上海 200241;中国农业科学院上海兽医研究所/农业农村部兽用化学药物及制剂学重点实验室,上海 200241;上海市浦东新区中医医院,上海 201200;中国农业科学院上海兽医研究所/农业农村部兽用化学药物及制剂学重点实验室,上海 200241 【正文语种】中 文 【中图分类】S859.795

盐酸氯苯胍(robenidine hydrochloride)的化学名为1，3-双[(对氯亚苄基)氨基]胍盐酸盐，分子式为C15H13Cl2N5·HCl，分子量为370.66，遇光色渐变深。盐酸氯苯胍是一种在结构上属于胍基衍生物的化学合成类抗球虫药[1-2]，主要作用于球虫胞浆体内质网，使内质网和高尔基复合体发生肿胀，影响蛋白质代谢，抑制球虫生长发育，对球虫裂殖体及几乎所有发育成熟的球虫具有双重抑制作用[3-4]。其抗虫谱广，对柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、布氏艾美耳球虫、变位艾美耳球虫和斯氏艾美耳球虫等均有效果，该药于20世纪70年代初在美国上市，主要作为饲料添加剂被广泛用于预防和治疗畜禽的球虫感染[5-6]。目前，国内批准上市的制剂只有盐酸氯苯胍预混剂一种，用于预防和治疗畜禽的球虫病等，药典收载该药物的含量测定方法是非水滴定方法，其有关物质控制在各国的药典均未收录[7-8]。因此，为了完善盐酸氯苯胍的质量控制，建立盐酸氯苯胍含量及有关物质测定的反相超高效液相色谱法，为进一步的制剂研究提供参考。 1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 仪器 超高效液相色谱仪(ACQUITY UPLC，PDA检测器)，美国Waters公司；

双量程分析天平(AE240)，梅特勒-托利多仪器上海公司；超纯水系统，美国Millipore公司；涡旋混合器(XW-OA)，上海医科大学仪器厂；超声仪(SCQ-250)，上海声谱科学仪器厂；水浴锅(HH-4数显恒温水浴锅)，上海特成机械设备有限公司；光照仪(LS-4000UV)，北京天星科仪科技有限公司。

1.1.2 药品与试剂 盐酸氯苯胍对照品，含量100%，批号SLBN6495V，Sigma公司产品；3批盐酸氯苯胍原料药，批号分别为318022601、318022702和318022802，浙江汇能生物股份有限公司产品；色谱纯乙腈，美国Fisher Chemical公司产品；磷酸、甲醇、盐酸、过氧化氢均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。 1.2 方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱(1.7 μm,2.1 mm×100 mm)；流动相：乙腈-2 mL/L磷酸水(V∶V=40∶60)；柱温：30℃；记录3D色谱图，提取波长313 nm；流速：0.2 mL/min；进样量：10 μL；盐酸氯苯胍与相邻杂质色谱峰的分离度大于2。

1.2.2 溶液的制备 盐酸氯苯胍储备液的制备：分别取盐酸氯苯胍对照品和原料药10 mg，精密称量，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成浓度为1 000 μg/mL的盐酸氯苯胍对照品和原料药的储备溶液。

盐酸氯苯胍对照品的供试液制备：精密量取盐酸氯苯胍对照品储备液，用流动相稀释并定容，制成质量浓度为15、20、25、30、35 μg/mL的供试溶液。 盐酸氯苯胍原料药的供试液制备：精密量取盐酸氯苯胍原料药储备液，用流动相稀释并定容，制成质量浓度为20、25、30 μg/mL的供试溶液。

1.2.3 溶剂效应 精密量取1.2.2的对照品储备液，分别用水、甲醇、400 mL/L甲醇和流动相稀释，制成质量浓度为10 μg/mL的4种标准供试溶液。按“1.2.1色谱条件”测定，记录色谱图和峰面积。

1.2.4 方法学验证

1.2.4.1 专属性和有关物质 分别精密称取5份盐酸氯苯胍原料药50 mg，置10 mL具塞试管中，进行不同条件的降解试验：①高温破坏：100℃加热8 h；②光照破坏：于4 500±500 lx光照10 d；③酸破坏：加入10 mol/L的盐酸溶液3 mL，60℃水浴48 h；④碱破坏：加入10 mol/L的氢氧化钠溶液3 mL，60℃水浴48 h；⑤氧化破坏：加入质量分数300 mL/L过氧化氢溶液3 mL，60℃水浴12 h。将破坏后的样品以及未经破坏的原料药样品加适量甲醇溶解完全并转移到50 mL容量瓶中，加甲醇稀释并定容(酸碱破坏样品分别先中和)，分别取1 mL置于100 mL容量瓶中，加流动相稀释并定容，分别过0.22 μm滤膜，按“1.2.1 色谱条件”进样，记录3D色谱图，提取响应值高的色谱图。

1.2.4.2 线性关系 将“1.2.2”对照品的供试液，质量浓度分别为15、20、25、30、35 μg/mL，按“1.2.1色谱条件”测定，记录峰面积，以质量浓度(C，μg/mL)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标，进行线性回归，得回归方程和相关系数。 1.2.4.3 精密度和稳定性 按“1.2.2”配制盐酸氯苯胍原料药的供试液，质量浓度25 μg/mL，按“1.2.1色谱条件”连续进样6次，测定主药峰面积和关物质R1和R2的峰面积，分别计算其RSD。用上述同样的溶液和色谱条件，分别在0、4、8、12 h进样，记录色谱图，计算盐酸氯苯胍和有关物质R1和R2的峰面积RSD。按“1.2.2盐酸氯苯胍原料药供试液”的制备方法，每天制备一个质量浓度为25 μg/mL的供试溶液，按“1.2.1 色谱条件”测试，分别记录主药和有关物质R1和R2的峰面积，连续3 d，计算其RSD。

1.2.4.4 回收率 取适量盐酸氯苯胍标准品，按“1.2.2”的方法，配制成质量浓度为20、25、30 μg/mL的溶液，每个质量浓度3份，按“1.2.1色谱条件”测试，外标法计算盐酸氯苯胍的含量，计算平均回收率及RSD。

1.2.5 盐酸氯苯胍原料药的含量和有关物质测定 取盐酸氯苯胍原料药，按“1.2.2”

的方法配制质量浓度为20 μg/mL的供试品和对照品溶液。精密量取供试品溶液1 mL置100 mL量瓶中，用流动相稀释并定容，摇匀，作为有关物质测定用对照溶液。按照“1.2.1色谱条件”进样分析，以外标法计算盐酸氯苯胍的含量，以自身对照法计算有关物质的限量。 2 结果 2.1 溶剂效应

溶剂效应的结果如图1所示。结果显示，以水作为稀释液得到的色谱峰响应值较低，以甲醇作为稀释液得到的色谱图出现裂解峰的现象，以400 mL/L甲醇和流动相作为稀释液得到的色谱图响应值较高，但以流动相作为稀释液得到的色谱图响应值最高，故盐酸氯苯胍的测试溶液最后一步应以流动相作为稀释液。 2.2 方法学验证

2.2.1 专属性和有关物质 专属性和有关物质的结果间见表1和图2。从表1可见，未经破坏的盐酸氯苯胍原料药中主要存在有保留时间为1.612(R1)和5.416(R2)的2种杂质，酸、碱和氧化破坏主要生成了相对保留时间为4.976的降解产物，氧化破坏产生的降解产物较多，还包括相对保留时间为1.234、2.576、2.843、3.724、4.976的另外5种降解产物。

从图2可见，盐酸氯苯胍在高温、光照、酸、碱和氧化破坏条件下所产生的降解产物与主峰的分离度均大于2以上，各降解产物间的分离度符合要求，说明该方法专属性良好。根据PDA扫描光谱图，可知盐酸氯苯胍主峰和主要降解产物为单一纯度峰，且主成分和各降解产物在313 nm处均有较高的响应值，说明选定色谱条件可检出样品中可能存在的杂质。

2.2.2 线性关系 得到的线性回归方程为y=3.279×105C-1.224×105，R2=0.999。该方法在盐酸氯苯胍质量浓度15 μg/mL～35 μg/mL范围内，线性关系良好。 2.2.3 精密度和稳定性 连续进样6次，主药峰面积的RSD为0.09%(n=6)，有关

物质R1和R2的峰面积的RSD分别为0.10%和0.08%(n=6)，本法的日内精密度良好。稳定性结果显示盐酸氯苯胍和有关物质R1和R2的峰面积RSD分别为1.01%、0.42%、1.37%(n=4)，表明供试溶液室温放置12 h内稳定。主药和有关物质R1和R2的峰面积，连续3 d，计算其RSD分别为0.15%、0.12%、0.13%(n=3)，本法的日间精密度良好。

2.2.4 回收率 回收率结果见表2，低、中、高浓度的平均回收率分别为100.85%、100.61%、100.40%，RSD分别为1.50%、0.07%、0.64%。

2.2.5 盐酸氯苯胍原料药的含量和有关物质测定 含量和有关物质的测定结果如表3所示。3个不同批次原料药的主成分含量均大于98%，符合药典规定。以主成分自身对照法计算有关物质的量，3批次不同原料药中单个杂质最大峰面积低于0.2%的鉴定限，杂峰面积的总和均低于0.5%的鉴定限。

A.流动相溶解；B.400 mL/L甲醇溶解；C.纯甲醇溶解；D.超纯水溶解；1.盐酸氯苯胍A.Diluted by mobile phase; B.Diluted by 400 mL/L methanol; C.Diluted by methanol; D.Diluted by water; 1.Robenidine hydrochloride图1 不同溶剂稀释盐酸氯苯胍溶液的高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of robenidine hydrochloride diluted by different solvent

表1 专属性试验的有关物质Table 1 The related substances of specificity test破坏试验Destruction test面积归一化法%含量Area normalization

method%Purity杂质的相对保留时间/min RRT of impurities新产生杂质的相对保留时间/minRRT of new impurities与主药分离度The resolution factor between impurities and robenidine所有峰%面积之和The % total area of all peaks原料 Raw material drug99.651.612,5.416———25.4,3.4100高温破坏 Destroyed by heat96.911.612,5.416———25.4,3.4100光照破坏 Destroyed by light96.811.612,5.416———24.8,3.599.99酸破坏 Destroyed by

acid96.731.612,4.976,5.4164.97623.4,2.28,3.58100.01碱破坏 Destroyed by al-kali95.531.612,4.976,5.4164.97622.68,2.17,3.63100氧化破坏 Destroyed by

oxidization87.011.234,1.612,2.576,2.843,3.724,4.976,5.4161.234,2.576,2.843,3.724,4.9763.57,8.48,2.08,5.96,7.74,2.28,3.699.8

A.高温破坏；B.光照破坏；C.酸破坏；D.碱破坏；E.氧化破坏；F.未经破坏的原料药(盐酸氯苯胍)A.Destroyed by heat；B.Destroyed by light；C.Destroyed by acid；D.Destroyed by alkali；E.Destroyed by oxidization；F.Untreated raw material drug(robenidine hydrochloride)图2 专属性试验的高效液相色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of specificity test 3 讨论

氯苯胍是弱碱性化合物，稳定性较差，碱性化合物在pH趋于碱性时会因状态趋于中性而增加保留，低pH时碱性物质保留会降低[9]。本试验根据文献[10-14]，流动相分别考察了甲醇-三乙醇胺、甲醇-三氟乙酸和乙腈-磷酸3种流动相系统，结果显示，盐酸氯苯胍在乙腈-磷酸条件下的保留和峰形较好，有一定特殊性。进一步的乙腈加入比例(65%、50%、45%、40%，V/V)对各色谱峰的分离度、灵敏度以及保留时间的影响结果表明，随着乙腈加入比例的减少，各色谱峰的分离度有所提高。当乙腈的加入比例为40%时，盐酸氯苯胍与各有关物质可达到基线分离，其分离度均大于2以上，因此，选择流动相为乙腈-2 mL/L磷酸水(V∶V=40∶60)。 表2 盐酸氯苯胍回收率试验结果Table 2 Recovery results of robenidine hydrochloride添加药物/μgAdditive amount实测值/μgMeasured value回收率/%Recovery平均回收率/%Average recoveryRSDRelative standard deviation2020.45102.27100.851.5019.8599.2620.20101.022525.14100.58100.610.0725.14100.5725.17100.703030.34101.13100.400.6429.9899.9430.041

00.15

表3 盐酸氯苯胍原料药中主成分含量和有关物质限量Table 3 Principle components and related substances of raw material drug of robenidine hydrochloride批号Batch number主成分含量/%Content of robenidine杂质R1/%Impurity R1杂质R2/%Impurity R2总杂限度/%Limit of total impurities318022601

99.650.080.160.2431802270299.320.100.140.2531802280298.990.110.150.26

溶剂效应是液相测试的主要影响因素之一[15]，本试验结果显示，样品采用1 000 mL/L甲醇时，进样体积增大，分离度变差，会出现“伸舌峰”。采用400 mL/L甲醇水和流动相作为溶剂时，同一浓度样品的峰面积有明显的差异，可能与不同溶剂的离子化程度有关[16]。有报道盐酸环丙沙星以水和流动相为溶剂时，虽然峰形正常，但以水为溶剂时，回收率差异大，峰面积的重现性差[17]。钟庆元等[18]研究发现，以乙醇作为溶剂时，色谱峰出现肩峰，但在第2步稀释时采用流动相后，样品的峰形明显改善。在液相分析过程中，样品溶剂会成为流动相的一部分，尤其在进样体积增加时，甲醇相对洗脱能力强，目标组分随甲醇移动加快，会出现峰变宽的现象。因此，推荐选用流动相作为溶剂，可以得到较好的效果[19]。 药物的有关物质是其质量标准的重要组成部分[20-23]，但盐酸氯苯胍在药典中未收载有关物质的控制标准。本研究在建立液相含量测定方法的同时，对其有关物质进行了相关的研究，通过破坏性试验发现了盐酸氯苯胍的多种降解产物，同时发现了其原料药中本身存在的2种主要杂质，并用不加校正因子自身对照的方法初步建立了两种主要杂质的质量控制方法，可为其进一步的质量控制提供依据。根据《兽用化学药物杂质研究技术指导原则》，兽医专用原料药的杂质报告限度为0.1%，鉴定限度为0.2%，质控限度为0.5%，本研究发现3批次的盐酸氯苯胍原

料药中单个最大杂质限度为0.16%，总杂最大限度为0.26%，低于鉴定限度和质控限度。因此，综合考虑现行工艺水平可暂定单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.2倍(0.2%)，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的0.3倍(0.3%)。有关物质具体结构和生成途径等有待进一步解析。

本研究建立了同时测定盐酸氯苯胍原料药主成分含量及有关物质的超高效液相色谱法，使盐酸氯苯胍及有关物质在同一色谱条件下取得良好的分离，与中国兽药典收载的盐酸氯苯胍含量测定的滴定法相比，该方法检测时间短，专属性好，结果准确、可靠，可作为盐酸氯苯胍含量的替代检测方法，用作盐酸氯苯胍原料药主成分含量及有关物质的检测与分析，从而提升其原料药和制剂的质量控制水平，对盐酸氯苯胍质量标准的修订具有一定的参考价值。 参考文献:

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