TB培养基与LB培养基培养大肠杆菌后提取质粒对比

TB培养基与LB培养基培养大肠杆菌后提取质粒对比

摘要： LB培养基中的酵母粉可以为微生物提供丰富的维生素、微量元素和生长因子。nacl的作用是提供微生物生长的渗透压和提供无机盐离子。TB培养基是一种通用培养基，用于各种微生物的培养，其中甘油主要是为大肠杆菌的生长提供碳源。两种培养基各有优缺。本实验以碱裂解法为例，探究TB培养基与LB培养基的培养大肠杆菌提取质粒的区别。在试验过程中两种培养基同步对比实验条件下，TB培养基提取效果没有LB培养基的效果理想。 关键词：大肠杆菌；碱裂解法；TB培养基 ；LB培养基；质粒

TB medium LB medium e. coli extraction train after plasmid

contrast

Abstract：LB medium yeast powder for microbes can provide rich vitamin, trace elements and growth factors. Nacl role is to provide microbial growth of osmotic pressure and provide inorganic salt ions. TB culture medium is a kind of common culture medium, used for the training of all kinds of microbes, which is mainly for e. coli glycerin provide carbon source of growth. Two kinds of culture media and each has advantages and disadvantages. This experiment with alkali cracking method for example, explore TB medium medium of e. coli LB training extraction plasmid difference. In the course of the experiments, two kinds of culture media synchronization contrast experiment condition, the TB medium effect no LB medium of extraction results.

Keywords：escherichia coli alkali cracking method TB medium LB medium plasmid

碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性[1]。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通

过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去[2]。

两种培养基1L的试剂用量对比

成分 蛋白胨 酵母提取物

甘油 NaCl KH2PO4 K2HPO4

LB培养基 10g 5g 无 10g 无 无

TB培养基 12g 24g 4ml 无 2.31g 12.54g

注：TB培养基中各组分溶解后高压灭菌。冷却到60℃，再加100ml灭菌的170mmol/L KH2PO4/0.72 mol/L K2HPO4的溶液（2.31g的KH2PO4和12.54gK2HPO4溶在足量的水中，使终体积为100ml[3]。高压灭菌或用0.22um的滤膜过滤除菌），使其最终定容为1L。

LB培养基中如果需要用1N NaOH（～1ml）调整pH至7.0，再补足水至1L。注：琼脂平板需添加琼脂粉12g/L,上层琼脂平板添加琼脂粉7g/L。

1. 实验部分

1.1实验器材

恒温摇床、试管、培养基、培养皿、无菌牙签（灭过菌的牙签）、板式超低温高速离心机、恒温培养箱、紫外成像仪、300 µl排枪、10 µl排枪、1ml单枪、不同规格的枪头、涡旋振荡器、冰箱、浅孔板、过滤板、封板膜、胶垫

1.2实验材料

含有质粒pUC18载体的大肠杆菌菌液、蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、甘油、抗生素、灭菌双蒸水、无水葡萄糖、RNase A、氢氧化钠、SDS、Tirs base、EDTA、硼酸、乙酸甲、冰醋酸、浓盐酸、无水乙醇、异丙醇、20μg/μl 、λDNA、溴

酚蓝、蔗糖、琼脂糖、EB

实验试剂配制：

1) EDTA：EDTA粉末37.2g ddH2O定容至200ml ，NaOH 4～5g调节pH值

至8.0

2) 葡萄糖：36g 葡萄糖加ddH2O定容至200ml ，

3) Tris-HCl：Tris Base 24g Tris 加ddH2O定容至200ml加浓盐酸调节

pH值至8.0

4) Rnase：Rnase粉末500mg 加ddH2O定容至2.5ml 5) 70%乙醇：无水乙醇350ml 加ddH2O定容至500ml 6) SDS：SDS粉末4g 加ddH2O定容至40ml 7) NaOH：片状NaOH 16g加ddH2O定容至40ml 8) 乙酸钾：196g KAc ddH2O定容至400ml

9) 母液Ⅰ：1mol/L葡萄糖 40ml ，1mol/L Tris-HCl 20ml ，0.5 mol/L EDTA

16ml加ddH2O定容至800ml

10) 溶液Ⅰ： 200ml母液加200 µl RNase A

11) 溶液Ⅱ：10mol/L NaOH 1ml ，10% SDS 5ml 加ddH2O定容至50ml （现

配）

12) 溶液Ⅲ：5 mol/L 乙酸钾30ml ，冰醋酸5.75 ml加ddH2O定容至50ml 13) 0.25％溴酚蓝：0.25g溴酚蓝，40g蔗糖，加ddH2O定容至200ml

注：需要低温保存的试剂：甘油、乙酸钾、母液Ⅰ、溶液Ⅰ、溶液Ⅲ 以上试剂灭菌待冷却后保存于4℃冰箱备用；Rnase 需要保存于-20℃冰箱备用[4]。 易挥发试剂：无水乙醇、70%乙醇、异丙醇 均需要用完立即密封防止其挥发。

2.反应流程：

1 分别取含有pUC18质粒的大肠杆菌菌液于LB培养基、TB培养基上37℃过夜培养；

2 分别用无菌牙签挑取单菌落，接种于含有Amp抗生素的LB培养基和TB培养基中，在37℃恒温摇床中以250 r/min过夜培养；

3沉菌：1900 rpm ，6min 收集菌体。弃上清，用吸水纸吸干残留菌液在对应表格标出（沉菌较少或未摇出等）；给96孔板编号1、2对照实验.

.4悬浮菌体：加入150 µl溶液 I振荡打匀，重新悬浮细胞，封板膜封紧于涡旋振荡器上充分振荡混匀。（注意：应彻底打匀沉淀或碎块）； （剧烈） 5 裂解菌体：加入150 µl溶液II，封板膜封紧，轻柔颠倒（3~5次）混匀，放置至清亮，一般不超过5分钟；

6 中和复性：加入150 µl溶液III，胶垫封盖压紧轻柔颠倒（3~5次）混匀，放置于-20℃冰箱5min，使杂质充分沉淀；（温和）（溶液Ⅱ和溶液Ⅲ要缓慢加入，并将其时间间隔控制在5min内，时间太久强碱环境导致质粒DNA结构破坏，对实验结果产生极大影响。）

7 3500 rpm离心8min；准备浅孔板与过滤板（注意方向及对应编号的一致）。 8移液：每孔转移300 µl（160 µl×2）上清液于过滤板，3600 rpm离心1 min。 9.沉淀质粒：加0.6倍体积（1800 µl）的异丙醇，胶垫封紧压实，快速反转8～10次使溶液充分混匀，离心至3000 rpm停下来。 静置5min。

10. 3500 rpm离心21min；按所需检测样品量，配制质量分数为1%的琼脂糖凝胶。

11. 倒尽上清，加75％乙醇浸洗除盐（放置片刻或离心3分钟后倒去上清）； 12. 室温放置或置于37℃恒温培养箱中5min（使乙醇挥发完全，避免影响鉴定结果）；

13. 加30 µl灭菌超纯水或TE溶解；离心，震荡，再离心。 14.点样：取2 µl样品加2 µl溴酚蓝点样跑胶。

鉴定：待溴酚蓝条带跑出孔大于5毫米时再紫外成像仪上拍照保存 15. 对比结果

实验过程中LB与TB的显现对比

实验进度 沉菌量 I液 II液 III液 移液

LB 大量 非常浑浊 不完全裂解（浑浊）

大量沉淀 大量沉淀，上清较少

40ng Mark TB 适中 浑浊

完全裂解（澄清）

沉淀量适中 沉淀与上清分层明显

80ng Mark

图一LB培养基

40ng Mark 80ng Mark RNA条带

图二TB培养基

3 结果与讨论

3.1在本次试验两种培养基同步对比实验条件下， TB培养基裂解不理想，造成分层不明显对移液工作增加了难度，且鉴定结果含有大量RNA条带，增加反应时间（TB培养基本身含有高浓度盐离子对后续反应造成的影响，本实验不予讨论），提取效果没有LB培养基的效果理想。

附注：质粒检测电泳检测：质粒电泳一般有三条带，分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型吸光值检测：采用分光光度计检测260nm、280nm波长吸光值，若吸光值260nm/280nm的比值介于1.7－1.9之间，说明质粒质量较好，1.8为最佳，低于1.8说明有蛋白质污染，大于1.8说明有RNA污染[5]。

3.2、实验中可能遇到的问题及分析 1. 菌体中无质粒

有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。 例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时 应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。 2. 碱裂解不充分

使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液I、 II和III的用量。对低拷贝数质粒，提取时，可加倍使用溶液I、II和III，可能

有助于增加质粒提取量和质粒质量。 3. 溶液使用不当

溶液II和III在温度较低时可能出现浑浊，应置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的

溶液，才能使用。

4.质粒未全部溶解（尤其质粒较大时）

洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。 5. 乙醇残留

漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，树脂型试剂盒漂洗后应晾干树脂，再加 入洗脱缓冲液。 6. 混有蛋白

不要使用过多菌体。溶液I、II和III处理并离心后溶液应为澄清的，如果还混有

微小蛋白悬浮物，可再次离心去除后再进行下一步骤[6]。 7.混有RNA

RNase A处理不彻底，请减少菌体用量或加入溶液III之后室温放置一段时间。

如

果溶液I已保存6个月以上，请在溶液P1中添加RNase A。 8. 混有基因组DNA

加入溶液II和III后应温和混匀，如果剧烈振荡，可能把基因组DNA剪切成碎片从

而混杂在质粒中。如果加入溶液II后过于粘稠，无法温和混匀，请减少菌体用 量。细菌培养时间过长会导致细胞和DNA的降解，不要超过16 小时[7]。 9. III溶液加入时间过长

III溶液加入后，放置时间不要太长，否则有可能会产生小片段DNA污染。 10. 含大量核酸酶的宿主菌

宿主菌含大量核酸酶，在质粒提取过程中降解质粒DNA，影响提取质粒DNA的完 整性，最好选用不含核酸酶的大肠杆菌宿主菌，如DH5α和Top10[8]。 11. 裂解时间过长

加入溶液II后裂解时间不应超过5分钟。 12. 质粒的二聚体和多聚体形式

质粒复制过程中形成的，与宿主菌相关，电泳可检测出。

参考文献:

[1]李立家，基因工程，科学出版社，2010.8

[2]魏春红，李毅，现代分子生物学实验技术，高等教育出版社，2006.7 [3]陈德富，现代分子生物学实验原理，科学出版社，2006.02 [4]赵永芳，生物化学技术与原理，科学出版社，2008 [5]萧浪涛，生物信息学，中国农业出版社，2006.9 [6]吕建新，分子诊断学，中医药科技出版社，2004.8

[7]黄培堂译，分子克隆实验指南（第三版），科学出版社，2002.8 [8]王廷华等，基因克隆理论与技术（第二版），科学出版社，2009

致 辞

这篇论文是在我的导师XX老师的多次指导下完成的。从论文的选题到结构安排，从内容到文字润饰，都凝聚了他大量的心血。在这篇论文的写作过程中，XX老师老师不辞辛劳，多次与我就论文中许多核心问题作深入细致地探讨，给我提出切实可行的指导性建议，并细心全面地修改了我的论文。XX老师这种一丝不苟的负责精神，使我深受感动。更重要的是XX老师在指导我的论文的过程中，始终践行着“授人以鱼，不如授之以渔”的原则。他常教导我要志存高远，严格遵守学术道德和学术规范，为以后的继续深造打好坚实的基础。在此，请允许我向尊敬的XX老师表示真挚的谢意！

这次毕业论文能够得以顺利完成，并非我一人之功劳，是所有指导过我的老师，帮助过我的同学和一直关心支持着我的家人对我的教诲、帮助和鼓励的结果。我要在这里对他们表示深深的谢意！

感谢身边所有的朋友与同学，谢谢你们三年来的关照与宽容，与你们一起走过的缤纷时代，将会是我一生最珍贵的回忆。