(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 110981959 A(43)申请公布日 2020.04.10
(21)申请号 201911140013.8(22)申请日 2019.11.19
(71)申请人 深圳普瑞金生物药业有限公司
地址 518000 广东省深圳市坪山区坑梓街
道金辉路14号深圳生物医药创新产业园1号楼402(72)发明人 张继帅 李莹莹 包朝乐萌
栗红建 蔡清华 丁怡瑾 蔡志波 (74)专利代理机构 深圳市世纪恒程知识产权代
理事务所 44287
代理人 陈文斌(51)Int.Cl.
C07K 16/28(2006.01)C12N 15/13(2006.01)
权利要求书1页 说明书9页序列表9页 附图22页
(54)发明名称
CD47单域抗体、核苷酸序列、表达载体及试剂盒
(57)摘要
本发明公开一种CD47单域抗体、核苷酸序列、表达载体及试剂盒，所述氨基酸序列如SEQ ID NO：1～10所示。本发明技术方案通过结合基因工程的方法得到一种特异性结合CD47蛋白的单域抗体，该抗体特异性结合CD47蛋白的特异性结合能力高，且亲和力高。
CN 110981959 ACN 110981959 A
权 利 要 求 书
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1.一种CD47单域抗体，其特征在于，所述氨基酸序列如SEQ ID NO：1～10所示：SEQ ID NO：1：DVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSSYSMRWYRQVPGKERELIARITSTGQPIEYGESVKGRFTISRDNAKNTLYLEMNALKPEDTAVYYCWGAGYWGQGTQVTVSS；
SEQ ID NO：2：QVKLEESGGGLVQPGESLRLSCVASGFAFSSALMRWYRQAPGKERELVASITTAGGITGYADSVKGRFTISRDNAENTLYLQMNSLKPEDTAVYYCRAYGFQLDNWGQGTQVTVSS；
SEQ ID NO：3：HVQLEESGGGLVQPGGSLRLSCKASGLTFASYSMRWYRQAPGQERELVARLSSSGVPIEYVDSVKGRFTASRDDAKSTLYLQMNSLKPEDTAMYYCWIANYWGQGTQVTVSS；
SEQ ID NO：4：DVQLVESGGGSVQPGGSLTLSCAASGFTVSNYSMRWYRQAPGKERELIARITSTGVPIEYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLEMNGLKPEDTAVYYCWGAAYWGQGTQVTVSS；
SEQ ID NO：5：GVQLVESGGGLVQPGESLRLSCVASGFAFSSALMRWYRQAPGKERELVASVTTTGGITGYADSVKGRFTISRDNAENTLYLRMNSLKPEDTAVYYCRAYGFGLDSWGQGTQVTVSS；
SEQ ID NO：6：QVKLEESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLTFSSYSMRWYRQAPGQERELVARLTSSGEPIEYADSVKGRFTASRDNAKSTVYLQMNSLKPEDTAMYYCWIANYWGQGTQVTVSS；
SEQ ID NO：7：QVKLEESGGGLVQPGESLRLSCVASGFTFSDAHMRWYRQAPGKEREMVASISTTGSITIYADSVKGRFTISRDNDEKTVYLRMNSLKPEDTAAYYCRAYGFQIDSWGQGTQVTVSS；
SEQ ID NO：8：DVQLEESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSSYSMRWYRQAPGKERELVARITSTGEPIEYVESVKGRFTISRDNALNTLNLEMNDLKPEDTAVYYCWGAGYWGQGTQVTVSS；
SEQ ID NO：9：AVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSNNNLRWYRQAPGKERELVAMITSAGNTNYADAVKGRSTISRDNAKNTLYLEMYRLKPEDTAVYYCWGAAHWGRGTQVTVSS；
SEQ ID NO：10：GVKLVESGGGLVQPGGSLTLSCVASGFDFNSAHMRWYRQGPGKEREMVASISTTGGVTIYEDSVKGRFTISRDNADNTAYLRMNSLKPEDTAVYYCRAYGFGIDYWGQGTQVTVSS。
2.一种核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列编码如权利要求1所述的CD47单域抗体。
3.如权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如表2所示。4.一种表达载体，其特征在于，包括如权利要求2或3所述的核苷酸。5.一种试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的CD47单域抗体，或者如权利要求2或3所述的核苷酸序列。
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说 明 书
CD47单域抗体、核苷酸序列、表达载体及试剂盒
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技术领域
[0001]本发明涉及基因工程和抗体药物技术领域，特别涉及一种CD47单域抗体、核苷酸酸序列、表达载体及试剂盒。背景技术
[0002]CD47抗原，又叫整合素相关蛋白，为免疫球蛋白超家族的一员，几乎在所有的细胞上表达，但在肿瘤细胞上表达明显增强。CD47在1986年就被认为是卵巢癌的一种肿瘤抗原，随后发现CD47在多种肿瘤中都有表达，包括各种白血病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤，平滑肌肉瘤、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、脑癌、肝癌、前列腺肿瘤等几乎所有实体瘤，CD47在这些肿瘤细胞上的表达量高于正常细胞通常水平3倍多。[0003]SIRPα(Signal regulatory protein alpha)是一种糖基化的跨膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族成员，严格限制性地表达再巨噬细胞、树突状细胞、神经元、中性白细胞表面，在细胞间的信号转导中发挥重要作用。SIRPα的胞质区包括两个免疫受体酪氨酸抑制基序，通过募集并结合SHP-1、SHP-2调节细胞的不同功能。SIRPα的胞外区包括三个免疫球蛋白区，主要与CD47结合，调节特定的生物功能。[0004]肿瘤细胞上的CD47与巨噬细胞上的SIRPα作用，抑制巨噬细胞对肿瘤细胞的清除，促进肿瘤在体内的生长和转移，高表达CD47是肿瘤细胞逃避免疫监视的普遍机制，研究表明，使用抗体阻断CD47-SIRPα通路可以使肿瘤细胞被巨噬细胞所吞噬，提高治疗CD47表达水平相关的各种疾病。[0005]相关技术中，能实现CD47抗原结合的选择范围狭窄，结合能力不高，亲和力偏低，不易改造且稳定性差。
发明内容
[0006]本发明的主要目的是提供一种多肽序列，旨在至少解决上述CD47抗体中存在的至少一个技术问题。
[0007]为实现上述目的，本发明提出一种CD47单域抗体，其氨基酸序列包括依次组成的FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4区，所述氨基酸序列如SEQ ID NO：1～10所示：[0008]SEQ ID NO：1：DVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSSYSMRWYRQVPGKERELIARITSTGQPIEYGESVKGRFTISRDNAKNTLYLEMNALKPEDTAVYYCWGAGYWGQGTQVTVSS；[0009]SEQ ID NO：2：QVKLEESGGGLVQPGESLRLSCVASGFAFSSALMRWYRQAPGKERELVASITTAGGITGYADSVKGRFTISRDNAENTLYLQMNSLKPEDTAVYYCRAYGFQLDNWGQGTQVTVSS；[0010]SEQ ID NO：3：HVQLEESGGGLVQPGGSLRLSCKASGLTFASYSMRWYRQAPGQERELVARLSSSGVPIEYVDSVKGRFTASRDDAKSTLYLQMNSLKPEDTAMYYCWIANYWGQGTQVTVSS；[0011]SEQ ID NO：4：DVQLVESGGGSVQPGGSLTLSCAASGFTVSNYSMRWYRQAPGKERELIARITSTGVPIEYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLEMNGLKPEDTAVYYCWGAAYWGQGTQVTVSS；[0012]SEQ ID NO：5：GVQLVESGGGLVQPGESLRLSCVASGFAFSSALMRWYRQAPGKERELVASVTTTGG
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说 明 书
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ITGYADSVKGRFTISRDNAENTLYLRMNSLKPEDTAVYYCRAYGFGLDSWGQGTQVTVSS；[0013]SEQ ID NO：6：QVKLEESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLTFSSYSMRWYRQAPGQERELVARLTSSGEPIEYADSVKGRFTASRDNAKSTVYLQMNSLKPEDTAMYYCWIANYWGQGTQVTVSS；[0014]SEQ ID NO：7：QVKLEESGGGLVQPGESLRLSCVASGFTFSDAHMRWYRQAPGKEREMVASISTTGSITIYADSVKGRFTISRDNDEKTVYLRMNSLKPEDTAAYYCRAYGFQIDSWGQGTQVTVSS；[0015]SEQ ID NO：8：DVQLEESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSSYSMRWYRQAPGKERELVARITSTGEPIEYVESVKGRFTISRDNALNTLNLEMNDLKPEDTAVYYCWGAGYWGQGTQVTVSS；[0016]SEQ ID NO：9：AVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSNNNLRWYRQAPGKERELVAMITSAGNTNYADAVKGRSTISRDNAKNTLYLEMYRLKPEDTAVYYCWGAAHWGRGTQVTVSS；[0017]SEQ ID NO：10：GVKLVESGGGLVQPGGSLTLSCVASGFDFNSAHMRWYRQGPGKEREMVASISTTGGVTIYEDSVKGRFTISRDNADNTAYLRMNSLKPEDTAVYYCRAYGFGIDYWGQGTQVTVSS。[0018]进一步地，所述氨基酸序列对应的FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4区具体如表1所示。[0019]表1：
[0020]
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[0021]
[0022]
本发明还提供一种核苷酸序列，所述核苷酸序列编码如上所述的CD47单域抗体。
具体核苷酸序列如表2所示。[0023]表2
[0024]
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[0025]
本发明还提供一种表达载体，包括如上所述的核苷酸。
[0027]本发明还提供一种试剂盒，包括如上所述的CD47单域抗体，或者如上所述的核苷酸序列。
[0028]本发明技术方案通过结合基因工程的方法得到一种特异性结合CD47蛋白的单域抗体，该抗体特异性结合CD47蛋白的活性高，表达量高，生产成本低，易于改造。
[0026]
附图说明
[0029]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0030]图1为本发明第一轮PCR单域抗体基因电泳图；
[0031]图2为图1中750bp-500bp基因片段以及500bp基因片段进行第二轮PCR单域抗体基因电泳图；
[0032]图3至图9为本发明实施例中CD47蛋白表达纯化图；
[0033]图10至图19为本发明实施例中CD47单域抗体与CD47抗原结合活性图；[0034]图20至图29为本发明实施例中CD47单域抗体的亲和性图；
[0035]图30至图34为本发明实施例中CD47单域抗体与HL-60细胞结合图。[0036]本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。具体实施方式
[0037]下面将结合本发明实施例及其附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。且下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法等。
[0038]本发明提出了一种CD47单域抗体、核苷酸酸序列、表达载体及试剂盒。下述内容将
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针对所述CD47单域抗体及其筛选过程作详细介绍。[0039]实施例1抗CD47抗原特异性的抗体库构建[0040]需要说明的是，本实施例中选用的CD47抗原采购自北京义翘神州，货号12283-H08H。QIAGEN试剂盒为北京雅安达生物技术有限公司的QIAamp RNA Blood Mini Kit(50)，货号52304。cDNA合成试剂盒为TAKARA公司的MiniBESTAgarose Gel DNAExtraction Kit Ver.4.0。[0041]1、免疫实验。
[0042]1)选择健康的羊驼为免疫对象；
[0043]2)采用2mgCD47抗原与等体积福氏佐剂混合，对一只健康羊驼进行免疫，总共进行6次免疫实验；
[0044]3)在第4次免疫实验后，对羊驼血清进行采样，并测定其抗原免疫效价；[0045]4)继续免疫实验，直至测得的羊驼血清的免疫效价达到1万倍以上时，取100ml羊驼全血，并分离淋巴细胞；
[0046]5)裂解步骤4)中的淋巴细胞，用QIAGEN试剂盒提取裂解后淋巴细胞中的RNA，并进行RNA纯化；其中，QIAGEN试剂盒中采用的抗凝剂包括柠檬酸盐、肝素和EDTA中的一种。[0047]2、构建噬菌体抗体库并进行特异性抗原CD47单域抗体的筛选。[0048]1)用免疫实验中对CD47抗原免疫的羊驼的外周血为起始材料，利用cDNA合成试剂盒将免疫实验中提纯的RNA反转录为cDNA，构建cDNA文库。[0049]2)采用巢式PCR克隆目的基因。[0050]a、根据CD47抗原中缺失轻链的抗体重链可变区VHH基因片段设计引物，本实施例中通过设计两套引物来对缺失轻链的抗体重链可变区VHH基因片段进行扩增。[0051]b、第一轮PCR。[0052]PCRFd5’引物：[0053]引物1(SEQ ID NO:199)：CGC CAT CAA GGT ACC AGT TGA[0054]引物2(SEQ ID NO:200)：CGG GAT CCC AGG TAC AGC TGG TGG AGT CTG GGG GAG[0055]PCR Bd3’引物：[0056]引物1(SEQ ID NO:201)：CCG CTC GAG TAC TTC ATT CGT TCC TGA GGA GAC GGT[0057]第一轮PCR扩增，可得到大于800bp的普通重链抗体基因片段，750bp～500bp之间的为缺失轻链的重链抗体基因片段，以及500bp的VHH目的基因片段。通过凝胶电泳，筛选出750bp～500bp的基因片段和500bp的基因片段。[0058]电泳结果如图1所示。其中，普通抗体扩增得到图1中凝胶电泳1跑道所示的两条亮条带，其碱基量主要分布在500bp～750bp；SEQ ID NO:199和SEQ ID NO:200配对使用，扩增得到图1中凝胶电泳2跑道所示的一条亮条带，其碱基量主要分布在500bp左右；SEQ ID NO:200和SEQ ID NO:201配对使用，扩增得到图1中凝胶电泳3跑道所示的一条亮条带，其碱基量主要分布在500bp左右。[0059]c、切胶回收含目的基因的片段。将上述电泳中碱基量在500bp～750bp之间的1号条带，切胶回收，其中，1号条带包含普通抗体基因、缺失轻链的重链抗体基因以及即目的基因；将上述电泳中碱基量在500bp的2号条带以及3号条带，切胶回收，其中，2号条带以及3号条带为带目的基因的条带。
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d、第二轮PCR。
[0061]引物构建：[0062]引物1(SEQ ID NO:202)：CCG CTC GAG TGA GGA GAC GGT GAC CTG G[0063]引物2(SEQ ID NO:203)：CGG GAT CCG AGG TAC AGC TGG TGG AGT CTG GGG GAG[0064]第二轮PCR扩增，经凝胶电泳，可筛选出含重链抗体可变区VHH目的基因(也即500bp的基因片段)。
[0065]电泳结果如图2所示。其中，左侧的亮条带为标记DNA分子，右侧亮条带为SEQ ID NO:202和SEQ ID NO:203配对使用扩增得到的，其基因碱基量在500bp(也即目的基因)。[0066]3)构建目的基因文库。
[0067]将上述获得的VHH目的基因片段和pHEN6噬菌体展示载体质粒采用BamHI内切酶和XhoI内切酶双酶酶切，酶切完成后用连接酶将VHH目的基因片段连接至pHEN6载体，构建重组质粒。将构建好的重组质粒电转化至感受态细胞中，以使VHH目的基因片段与pHEN6载体能融合表达。
[0068]取电转化菌液涂布LB/Amp平板，32℃过夜培养。次日用菌落PCR的方法验证抗体的连接效率。若抗体的连接效率小于等于90％则需重复上述实验，直至抗体连接效率大于90％；若抗体连接效率高于90％，则说明目的基因与载体连接良好，重组质粒的表达良好，可继续进行菌落扩大培养实验。[0069]4)扩大培养。[0070]a、将电转化菌液涂布LB/Amp平板，32℃过夜培养；[0071]b、然后用2YT培养基洗，以洗掉原培养环境中的其他成分，以菌液：培养基液＝1:1000的比例在2YT培养基上进行表达目的基因的噬菌体的扩大培养；[0072]c、加入辅助噬菌体M13K07(Invitrogen)进行感染，过夜培养；[0073]d、离心，收集感染辅助噬菌体M13K07的上清液；[0074]e、在上清液中加入20％PEG-2.5M NaCl混匀，再次离心，收集沉淀，并加入PBS和甘油进行重悬，于-80℃保藏备用。
[0075]实施例2特异性噬菌体的筛选[0076]1)前期准备。分别准备CD47阴性对照细胞系和经改造的CD47阳性细胞系各5*106，使用CPBSH或2％BSA-PBS在转鼓上室温孵育2小时，离心备用。[0077]2)筛选。将噬菌体(5*1011～1*1012)加入阴性细胞中，CPBS或2％BSA-PBS定量，至0.5ml，在转鼓上室温孵育2小时；取上清液，加入阳性细胞中，CPBS或2％BSA-PBS定量，至0.5ml，在转鼓上室温孵育2小时；以使该噬菌体的外壳能特异性分泌CD47抗体，与CD47抗原结合；用PBST洗涤5次，PBS洗涤3次，离心、弃上清液，以将没有结合的噬菌体洗掉。[0078]3)滴度测定。将上述细胞结合的噬菌体重悬，取2ml对数生长期的TG1，感染，37℃，静置30min，进行滴度测定。[0079]4)扩增、纯化。扩增并纯化扩增后的噬菌体。[0080]重复上述实验三次，并以步骤4)中的噬菌体作为下一次步骤2)中加入的噬菌体。[0081]筛选结果如下：
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[0082]
本实施例对噬菌体进行了3次筛选，并检测每次筛选试验洗脱下来的噬菌体滴度，
根据上表可以知道：随着筛选轮数的增加，包被液浓度逐级递减，但是洗脱下来的噬菌体增加，也即CD47特异性噬菌体得到富集。
[0084]实施例3特异性阳性单克隆抗体的筛选[0085]1)筛选高效表达的重组质粒。
[0086]PCR扩增实施例2中获得的特异性CD47抗体基因片段，以获取带有限制性内切酶BbsI和BamHI位点的PCR产物；用限制性内切酶BbsI和BamHI分别处理上述PCR产物和pSJF2载体；利用T4连接酶连接上述酶切后的基因片段，对其进行重组，以获得能在大肠杆菌中高效表达的重组质粒sdAb-pSJF2。[0087]2)筛选CD47阳性克隆抗体。
[0088]从生长菌落的琼脂平板上随即挑取单菌落，接种在含有Amp的2YT液体培养基的96孔深孔培养板中，培养4小时；将单克隆一一对应接种在带编号的以小格分隔的含Amp的LB固体平板上；向深孔培养板加入IPTG至终浓度0.5mM诱导，过夜培养；收获表达蛋白的上清液，并以CD47抗原进行ELISA测定，选择OD值大于阴性对照5倍的菌落为挑选出的CD47阳性克隆；将阳性克隆小量培养保种并进行DNA测序，鉴定抗CD47单域抗体的基因序列，得到如上述表2所示的基因序列。
[0089]实施例4CD47单域抗体在宿主大肠杆菌中的表达、纯化[0090]1)表达、纯化。
[0091]取实施例3)中的阳性克隆菌液接种于5ml的含氨基苄青霉素的LB培养液中，37℃，摇床培养过夜；转种2ml过夜培养物于200mL含氨基苄青霉素的LB培养液中，37℃摇床培养，240转/分，培养至OD值达0.4～0.6；加入0.5～1.0mM IPTG，继续培养过夜，然后离心，收菌；高渗法裂解细菌，离心，收上清中可溶性单域抗体蛋白；经Ni+离子亲和层析获得纯度达95％以上的蛋白。
[0092]纯化结果如图3至图9所示。在图3至图5中，Marker为蛋白分子标准，CD47-117、CD47-118、CD47-127、CD47-160、(CD47-)169、CD47-172、CD47-175、(CD47-)229、(CD47-)236及(CD47-)271为CD47基因序列为SEQ ID NO：100～109裂解菌后总蛋白粗提样品，说明实施例3)中筛选出来的阳性克隆细菌均能诱导表达出CD47抗体。[0093]在图6至图9中，为经镍柱纯化后的洗脱样品。[0094]条带160(100)、条带127(100)、条带118(100)、条带117(100)、条带169(100)、条带172(100)、条带175(100)、条带229(100)、条带236(100)以及条带271(100)为用含有100毫摩咪唑的洗脱液过脱镍柱后剩余的样品，说明经过一次洗脱后：(CD47-)117、(CD47-)118和(CD47-)127样品中蛋白基本被洗脱下来；(CD47-)160、(CD47-)169样品中没有被洗脱下来的蛋白极少；(CD47-)172、(CD47-)175、(CD47-)229、(CD47-)236和(CD47-)271样品中大部
[0083]
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分蛋白都被洗脱下来。[0095]条带160(200)、条带169(200)、条带172(200)、条带175(200)、条带229(200)、条带236(200)以及条带271(200)为用含有200毫摩咪唑的洗脱液过脱镍柱后剩余的样品，经过两次洗脱后：(CD47-)160、(CD47-)169样品中蛋白基本都被洗脱下来，洗脱下来的目标蛋白纯度较高；(CD47-)172、(CD47-)175、(CD47-)229、(CD47-)236和(CD47-)271样品中没有被洗脱下来的蛋白极少。[0096]条带172(400)、条带175(400)、条带229(400)、条带236(400)以及条带271(400)为用含有400毫摩咪唑的洗脱液过脱镍柱后剩余的样品，经过三次洗脱后：(CD47-)172、(CD47-)175、(CD47-)229、(CD47-)236和(CD47-)271样品中镍柱的蛋白基本被洗脱下来，洗脱下来的目标蛋白纯度较高。
[0097]实施例5CD47单域抗体与CD47抗原结合活性测定[0098]1)包被。以0.05M的Na2CO3·NaHCO3(PH9.5)稀释CD47抗原至2μg/ml；在每个96孔板的反应微孔中加入100μl稀释后的CD47抗原蛋白，4℃过夜孵育；次日，弃反应微孔内包被液，并用PBS洗板三次；加入300μl2％BSA(或1％CPBS)于封闭96孔板中，37℃，孵育2小时。[0099]2)抗原-抗体结合。在每个96孔板的反应微孔中加入100μl不同稀释浓度的纯化的CD47单域抗体，37℃，孵育1小时，用0.05％PBST洗板三次；在每个反应微孔中加入100μl5000倍稀释的anti-His antibody(HRP)，37℃，孵育1小时，用0.05％PBST洗板三次；在每个反应微孔中加入100μlTMB，避光室温静置10min。[0100]3)终止反应。在每个反应微孔中加入50μl 2M H2SO4终止反应。[0101]4)结果判定。用酶标仪测定450nm波长下的样品OD值，并得到如图10至图19所示的结果，图为不同基因片段纯化的CD47单域抗体与CD47蛋白结合的浓度梯度(ELISA)。从图中以看出，即便CD47单域抗体与CD47抗原结合后的浓度在32ng/ml时，依然具有较好的结合活性，说明抗体结合活性极佳，优于目前已有技术。[0102]实施例6CD47单域抗体亲和力检测[0103]1)亲和力测定。在PBST溶液中用SA探针捕获Human CD47/Biotinylated，并与样品充分反应；在PBST缓冲液中解离分析上述反应得到的固相结合物，并用数据分析软件对结果进行分析，获得结合速率、解离速率以及亲和力常数，具体结果如图20至图29所示。[0104]2)结果分析。图中四条曲线分别为不同浓度梯度抗体测得的结果(1号线对应浓度为73.5nM的抗体，2号线对应浓度为147.1nM的抗体，3号线对应浓度为294.1nM的抗体，4号线对应浓度为588.2nM的抗体)，横坐标为时间轴(0～900秒)，纵坐标为实验过程中机器读取的反应数值(Response)。根据实验设计，1200秒前为抗原抗体结合过程，1200秒-2400秒为解离过程，参照图中的分割线。根据结合过程中机读数值随时间的变化，可得结合常数Kon(1/Ms)。根据解离过程中机读数值随时间的变化，可得解离常数Kdis(1/s)。根据公式：亲和力常数KD＝解离常数Kdis/结合常数Kon，可得使用不同浓度测得的CD47抗体亲和力常数KD。各浓度梯度下检测结果一致，实验结果可靠(参照图中拟合曲线及下表，R2>0.95)。结果表明：各个抗体亲和力常数均小于1x10-9(nM级别)，优于现有大部分抗体的1x10-8及以上亲和力常数，亲和力优于现有技术。
[0105]实施例7CD47单域抗体与HL-60细胞的结合[0106]1)流式细胞结合。采用20μg/ml CD47纳米抗体蛋白与HL-60细胞结合；抗HIS抗体
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染色，并利用BD FACSCalibur流式细胞仪进行流式细胞术分析，得到如图30至图34所示的结果。
[0107]2)结果分析。由图30至图34可知，CD47纳米抗体能与阳性细胞(即HL-60细胞系)发生结合，且其结合率＞99％，说明本发明实施例组中申请保护的纳米抗体对细胞膜表面表达的CD47抗原具有非常良好的结合能力，优于现有技术。[0108]应当理解的是，本发明实施例筛选CD47单域抗体采用细胞筛选法代替传统的固相筛选法，使得靶抗原能保持天然的构象，更利于对膜抗原或细胞表面的抗原表位的抗体的筛选。本发明实施例中筛选得到了针对膜抗原的内化型抗体，对于治疗肿瘤有非常积极的效果。
[0109]最后，本发明实施例组中申请保护的CD47特异性单克隆纳米抗体可用于对CD47阳性细胞的鉴定、阳性细胞筛选、检测阳性率、开发靶向CD47阳性细胞的抗体药物、ADC复合药物、CAR-T细胞药物等多种与CD47蛋白表达相关的生物药物等。[0110]以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。
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序 列 表
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SEQUENCE LISTING<110> 深圳普瑞金生物药业有限公司<120> CD47单域抗体、核苷酸序列、表达载体及试剂盒<130> 1<160> 10<170> PatentIn version 3.5<210> 1<211> 112<212> PRT<213> 人工合成<400> 1Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Tyr 20 25 30Ser Met Arg Trp Tyr Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Ile 35 40 45Ala Arg Ile Thr Ser Thr Gly Gln Pro Ile Glu Tyr Gly Glu Ser Val 50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Glu Met Asn Ala Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95Trp Gly Ala Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 100 105 110<210> 2<211> 116<212> PRT<213> 人工合成<400> 2Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Ala 20 25 30Leu Met Arg Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val 35 40 45Ala Ser Ile Thr Thr Ala Gly Gly Ile Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
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序 列 表
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95Arg Ala Tyr Gly Phe Gln Leu Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val 100 105 110Thr Val Ser Ser 115<210> 3<211> 112<212> PRT<213> 人工合成<400> 3His Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ala Ser Tyr 20 25 30Ser Met Arg Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Gln Glu Arg Glu Leu Val 35 40 45Ala Arg Leu Ser Ser Ser Gly Val Pro Ile Glu Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ala Ser Arg Asp Asp Ala Lys Ser Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95Trp Ile Ala Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 100 105 110<210> 4<211> 112<212> PRT<213> 人工合成<400> 4Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Asn Tyr 20 25 30Ser Met Arg Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Ile 35 40 45Ala Arg Ile Thr Ser Thr Gly Val Pro Ile Glu Tyr Ala Asp Ser Val
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序 列 表
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50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Glu Met Asn Gly Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95Trp Gly Ala Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 100 105 110<210> 5<211> 116<212> PRT<213> 人工合成<400> 5Gly Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Ala 20 25 30Leu Met Arg Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val 35 40 45Ala Ser Val Thr Thr Thr Gly Gly Ile Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Arg Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95Arg Ala Tyr Gly Phe Gly Leu Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val 100 105 110Thr Val Ser Ser 115<210> 6<211> 112<212> PRT<213> 人工合成<400> 6Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30Ser Met Arg Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Gln Glu Arg Glu Leu Val 35 40 45
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序 列 表
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Ala Arg Leu Thr Ser Ser Gly Glu Pro Ile Glu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ala Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Val Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95Trp Ile Ala Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 100 105 110<210> 7<211> 116<212> PRT<213> 人工合成<400> 7Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala 20 25 30His Met Arg Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Met Val 35 40 45Ala Ser Ile Ser Thr Thr Gly Ser Ile Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Asp Glu Lys Thr Val Tyr65 70 75 80Leu Arg Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ala Tyr Tyr Cys 85 90 95Arg Ala Tyr Gly Phe Gln Ile Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val 100 105 110Thr Val Ser Ser 115<210> 8<211> 112<212> PRT<213> 人工合成<400> 8Asp Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Tyr 20 25 30Ser Met Arg Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val
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序 列 表
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35 40 45Ala Arg Ile Thr Ser Thr Gly Glu Pro Ile Glu Tyr Val Glu Ser Val 50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Leu Asn Thr Leu Asn65 70 75 80Leu Glu Met Asn Asp Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95Trp Gly Ala Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 100 105 110<210> 9<211> 111<212> PRT<213> 人工合成<400> 9Ala Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Asn Asn 20 25 30Asn Leu Arg Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val 35 40 45Ala Met Ile Thr Ser Ala Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Asp Ala Val Lys 50 55 60Gly Arg Ser Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu65 70 75 80Glu Met Tyr Arg Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Trp 85 90 95Gly Ala Ala His Trp Gly Arg Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 100 105 110<210> 10<211> 116<212> PRT<213> 人工合成<400> 10Gly Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Thr Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Asp Phe Asn Ser Ala 20 25 30His Met Arg Trp Tyr Arg Gln Gly Pro Gly Lys Glu Arg Glu Met Val 35 40 45
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序 列 表
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Ala Ser Ile Ser Thr Thr Gly Gly Val Thr Ile Tyr Glu Asp Ser Val 50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Asp Asn Thr Ala Tyr65 70 75 80Leu Arg Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95Arg Ala Tyr Gly Phe Gly Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val 100 105 110Thr Val Ser Ser 115<210> 11<211> 336<212> DNA<213> 人工合成<400> 11gatgtgaagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60tcctgtgcag cctctggatt caccgtcagt agctactcca tgagatggta ccgccaggtt 120ccaggaaagg agcgcgagtt gatcgcaaga attactagta ctggtcaacc tatagaatat 180ggcgagtccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa cacgctgtat 240ctggaaatga acgcactgaa acctgaggac acggccgtgt attactgttg gggcgctggg 300tactggggcc aggggaccca ggtcaccgtc tcctca 336<210> 12<211> 348<212> DNA<213> 人工合成<400> 12caggtgaagc tggaggagtc tgggggaggc ttggtgcagc caggggagtc tctgagactc 60tcctgcgtag cctctggatt cgccttcagt agcgcactca tgaggtggta ccgccaggct 120ccagggaagg agcgcgagtt ggtcgcatct attactaccg ctggtggtat cacaggttat 180gcagacagcg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccgagaa cacgctgtat 240ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggac acggccgtat attactgtag ggcttacggg 300tttcaacttg acaactgggg ccaggggacc caggtcaccg tctcctca 348<210> 13<211> 336<212> DNA<213> 人工合成<400> 13catgtgcagc tggaggagtc tgggggaggc ctggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60tcctgtaaag cctctggatt gaccttcgct agttattcta tgagatggta ccgccaggct 120
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ccagggcagg agcgcgaact tgtcgcacga ttgtctagta gcggtgttcc tatagagtat 180gtggactccg tgaagggccg attcaccgcc tccagagacg atgccaagag cacgctatat 240ttgcaaatga acagcctgaa acctgaggac acggccatgt attactgctg gattgcgaat 300tactggggcc aggggaccca ggtcaccgtc tcctca 336<210> 14<211> 336<212> DNA<213> 人工合成<400> 14gatgtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tcggtgcagc ctggggggtc tctgacactc 60tcctgtgcag cctctggatt caccgtcagt aactactcca tgagatggta ccgccaggct 120ccagggaagg agcgcgagtt gatcgcaaga attactagta ctggtgtacc tatagaatat 180gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaaaaa cacgctgtat 240ctggaaatga acggcctgaa acctgaggac acggccgtct attactgttg gggcgctgcg 300tactggggcc aggggaccca ggtcaccgtc tcctca 336<210> 15<211> 348<212> DNA<213> 人工合成<400> 15ggggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggagtc tctgagactc 60tcctgcgtag cctctggatt cgccttcagt agcgcactca tgaggtggta ccgccaggct 120ccagggaagg agcgcgagtt ggtcgcatct gttactacta ctggtggtat cacaggttat 180gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccgagaa cacgctgtat 240ctgcgaatga acagcctgaa acctgaggac acggccgtgt attactgtag ggcttacggg 300tttggacttg actcctgggg ccaggggacc caggtcaccg tctcctca 348<210> 16<211> 336<212> DNA<213> 人工合成<400> 16caggtgaagc tggaggagtc tgggggaggc ctggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60tcctgtgcag cctctggatt gaccttcagt agttattcta tgagatggta ccgccaggct 120ccagggcagg agcgcgaact tgtcgcacgt cttactagta gcggtgagcc tatagagtat 180gcagactccg tgaagggccg attcaccgcc tccagagaca atgccaagag cacggtatat 240ttgcaaatga acagcctgaa acctgaggac acggccatgt attactgctg gattgcgaac 300tactggggcc aggggaccca ggtcaccgtc tcctca 336<210> 17<211> 348
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<212> DNA<213> 人工合成<400> 17caggtgaagc tggaggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggaatc tctgagactc 60tcctgcgtag cctctggatt caccttcagt gacgcacaca tgaggtggta ccgccaggct 120ccagggaagg agcgcgagat ggtcgcatct atttctacta ctggtagtat cacaatttat 180gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgacgagaa aacggtgtat 240ctgcgaatga atagtctgaa acctgaggac acggccgcgt attactgtag ggcttacggg 300tttcaaattg actcctgggg ccaggggacc caggtcaccg tctcctca 348<210> 18<211> 336<212> DNA<213> 人工合成<400> 18gatgtgcagc tggaggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60tcctgtgcag cctctggatt caccgtcagt agctactcca tgagatggta ccgccaggct 120ccagggaagg agcgcgagtt ggtcgcaaga atcactagta ctggtgaacc tatagagtat 180gtagaatccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccttgaa cacgctgaat 240ctggaaatga acgacctgaa acctgaggac acggccgtgt attactgttg gggcgctggg 300tactggggcc aggggaccca ggtcaccgtc tcctca 336<210> 19<211> 333<212> DNA<213> 人工合成<400> 19gctgtgaagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60tcctgtgcag cctctggatt caccgtcagt aataacaact tgaggtggta ccgacaggct 120ccaggaaaag agcgcgagtt ggttgcgatg atcactagcg ctggtaacac aaactatgca 180gacgccgtga agggccgatc caccatctcc agagacaatg ccaagaacac gttgtatctg 240gaaatgtata ggctgaaacc tgaggacacg gccgtgtatt actgttgggg tgcggcccac 300tggggccggg ggacccaggt caccgtctcc tca 333<210> 20<211> 348<212> DNA<213> 人工合成<400> 20ggtgtgaagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgacgctc 60tcctgcgtag cctctggatt cgacttcaat agcgcacaca tgaggtggta ccgccagggt 120ccagggaagg agcgcgagat ggtcgcatct atttctacta ctggtggagt cacaatttat 180
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gaagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccgacaa tacggcgtat 240ctgcgaatga acagcctgaa acctgaggac acggccgtgt attactgtag ggcttacggg 300tttggaattg actattgggg ccaggggacc caggtcaccg tctcctca 348
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