・生物技术・ 北方园艺２０１０（２３）：１２０～１２２ 青蒿组织培养中克服玻璃化现象研究 张丽珍 ，杨冬业 ，靳振江。，刘贤贤 （１．桂林师范高等专科学校化学与工程技术系，广西桂林５４１００１；２．桂林医学院，厂 西桂林５４１００１；３．桂林理工大学，广西桂林５４１００４） 摘要：玻璃化现象是青蒿组织培养过程中的首要障碍。用青蒿顶芽为外植体，以ＭＳ为基 本培养基，采用不同浓度的６ ＢＡ、琼脂、蔗糖和活性炭正交实验对解决青蒿组织培养过程中的玻 璃化问题进行了研究。结果表明：在ＭＳ培养基添加４．０ 的蔗糖、０．７５ 琼脂和０．０８ 的活性 碳，附加０．１０ ｒａｇ／Ｉ 的细胞分裂素６－ＢＡ，可得到健壮的青蒿组培苗。 关键词：青蒿；组织培养；玻璃化 中图分类号：Ｓ ６３６．９文献标识码：Ａ文章编号：１００１－－０００９（２０１０）２３—０１２０一Ｏ３ 黄花蒿即中药青蒿（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ａｎｎｕａ Ｉ ．）为菊科ｌ ａ 用青蒿顶芽为外植体，对再生频率高的青蒿玻璃苗的发 生及克服途径进行了初步研究，建立了良好的再生体 生药用植物。从青蒿中提取的青蒿素（Ａｒｔｅｍｉｓｉｎｉｎ）是 低毒高效的抗疟疾药，青蒿素的生物合成成为人们研究 的热点口 ］。随着青蒿素应用研究的开展，人工种植青 蒿在近几年中逐渐形成规模。在种植过程中，青蒿素含 量差别很大 ］，采用组培技术选育青蒿素含量高的株 系是解决青蒿素含量参差不齐的有效手段之一。 系，为选育优良的品系和大规模工厂化生产作好准备。 ｌ材料与方法 １．１试验材料 试验用青蒿苗采集于桂林师范高等专科学校药用 植物园内。 １．２试验方法 然而，在对青蒿进行组培繁育的过程中玻璃化现象 非常严重，频率高达６０ ～８０ 。目前有关青蒿玻璃化 苗的研究未见报道。针对这个问题，现采用正交实验， 采集青蒿顶芽，冲洗干净后在无菌操作台上用７５ 的酒精消毒３０ Ｓ，再用０．１ ＨｇＣ１ｚ消毒１０ ｒｎｉｎ，无菌水 冲洗３～５次，接种于ＭＳ基本培养基上培养。１０ ｄ后取 第一作者简介：张丽珍（１９７９一），女，广西责港人，硕士，讲师，现主 要从事生物学教学与植物细胞工程研究工作。 Ｅ－ｍａｉｌ：￣ａｏｚｈａｎｇ４４６＠１６３．ｃｏｒｎ。 其幼叶接种在ＭＳ＋６一ＢＡ ０．５ ｍｇ／Ｌ＋ＩＢＡ ０．５ ｒａｇ／Ｌ（单 位下同略）的培养基中进行愈伤组织诱导及丛生芽分化 培养 ］。 基金项目：广西壮族自治区精品课程资助项目。 收稿日期：２Ｏ１Ｏ一１Ｏ一１１ ３０ ｄ后选取健康无菌的丛生芽（株高约１～２ ｃｍ）接 种在ＭＳ基本培养基中，以６－ＢＡ、蔗糖、琼脂浓度和活性 Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｇｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ Ｐｌａｎｔ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ－ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ Ｕｒｂａｎ Ｓｑｕａｒｅ ｏｆ Ｍｕｄａｎｊｉａｎｇ Ｃｉｔｙ ＸＵ Ｌｉ－ｙｉｎｇ （Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｕｄａ￣ｉａｎｇ Ｔｅａｃｈｅｒｓ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｍｕｄａｎｊｉａｎｇ，Ｈｅｉｌｏｎｇｉｉａｎｇ １５７０１２） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｇｒｅｅｎｉｎｇ ｓｉｔｕａｔｉｏｎ、ｇｒｅｅｎ ｃｏｖｅｒａｇｅ ｒａｔｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｌａｎｔ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ－ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ７ ｓｑｕａｒｅ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ａｎｄ ａｎａｌｙｚｅｄ ｉｎ Ｍｕｄａｎｊｉａｎｇ Ｃｉｔｙ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｌａｎｄｓｃａｐｅ ｏｆ ｐｅａｒｌ ｐｌａｚａ ｗａｓ ｂｅｓｔ，ｉｎ ｇｒｅｅｎ ｃｏｖｅｒａｇｅ ｒａｔｅ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｗａｓ ｕｎｄｅｒ Ｄｏｎｇｇｕａｎｇ ｏｖｅｒｐａｓｓ ｗａｓ ａｂｏｕｔ ８１．５ ，ｔｈｅ ｌｏｗｅｓｔ ｗａｓ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｑｕａｒｅ ｗａｓ ａｂｏｕｔ ２１．９ ．Ｐｉｃｅａ ｋｏｒａｉｅｎｓｉｓ ｗａｓ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｐｌａｎｔ ｆｏｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ａｎｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ－ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｇｒｅｅｎｉｎｇ ｓｑｕａｒｅ．Ｐｉｃｅａ ｇｒｅｅｎｉｎｇ ｋｏｒａｉｅｎｓｉ，Ｌｉｇｕｓｔｒｕｍ ｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉｕｍ ａｎｄ Ｓａｂｉｎａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ ｅｖ．Ｄａｎｄｏｎｇ ｗｅｒｅ ｔｈｅ ｋｅｙ ｌａｎｄｓｃａｐｅ ｔｒｅｅ ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ．ｓｑｕａｒｅ・ Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｓｑｕａｒｅ；ｇｒｅｅｎ ｃｏｖｅｒａｇｅ ｒａｔｅ；ｐｌａｎｔ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ－ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ １２Ｏ 北方园艺２０１ｏ（２３）：１２ｏ～１２２ 碳（ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃａｒｂｏｎ，ＡＣ）为单因子对比试验，每个处理分 化芽数为３Ｏ株，每瓶５株，３次重复。培养条件：温度（２５± １）℃，光照ｌ４ ｈ／ｄ，光照强度３０￣４０ ｍｍｏｌ・ｍ ・Ｓ。 １．３数据处理方法 培养２０ ｄ后，观察并统计组培苗出现玻璃化的情 况。用ＳＰＳＳ １０．０软件进行单因素的差异显著性分析， 并按下列公式计算增殖系数及玻璃化率：增殖系数一增 殖芽数／接种苗数；玻璃苗百分率（ ）＝＝＝玻璃苗数／总苗 数×１００％。 ２结果与分析 ２．１ ６－ＢＡ浓度对青蒿试管苗玻璃化现象的影响 在添加４．ｏＳ的蔗糖、０．７５％的琼脂和０．０８ 的活 性碳的ＭＳ基本培养基中，附加不同浓度的６－ＢＡ，接种 继代培养后的青蒿组培苗（图１、２），接种２０ ｄ后观察统 计的结果见表１。随着６－ＢＡ浓度的增加，增殖系数随之 增大，玻璃化率也随之增高，当６－ＢＡ为１．０时增殖系数 达到４．８３，玻璃化率为２４．１４ ，当６ ＢＡ为２．０时增殖 系数为５．０６，玻璃化率高达６３．７４ ，说明青蒿对低浓度 的６ ＢＡ敏感，对高浓度的６ ＢＡ不敏感，高浓度的６一ＢＡ 引起高频率的玻璃化（图３、４）。综合考虑，该试验确定 ６一ＢＡ为１．０。 表１ ６－ＢＡ浓度对青蒿试管苗玻璃化现象的影响 注：Ⅲ列数据后小Ｉ 早母表不差异显著（Ｐ＜ ），Ｆ Ｊ百Ｊ。 ２．２蔗糖浓度对青蒿试管苗玻璃化现象的影响 在添加１．０ ｍｇ／Ｉ 的６ ＢＡ、０．７５ 的琼脂和０．０８ 的活性碳的ＭＳ基本培养基中，附加不同浓度的蔗糖，接 种继代培养后的青蒿组培苗，接种２０ ｄ后观察统计的结 果见表２。在蔗糖浓度较低时，随着蔗糖浓度的增加，增 殖系数随之增大，玻璃化率变小，在蔗糖浓度较高时，随 着蔗糖浓度的增加，增殖系数反而变小，玻璃化率变小， 当蔗糖浓度为３．０ 时增殖系数达到４．７８，玻璃化率为 ３０．４７％，当蔗糖浓度为４．ｏ ＡＯ时增殖系数为４．５Ｏ，玻璃 化率为１９．２６ ，说明青蒿在蔗糖浓度适中的条件下，增 殖系数变化不大，但玻璃化率随着蔗糖浓度的升高而急 剧下降。综合考虑，该试验确定蔗糖浓度为４￣／ｏｏ。 ２．３琼脂浓度对青蒿试管苗玻璃化现象的影响 在添加４．０ 的蔗糖、１．０ ｒａｇ／Ｉ 的６－ＢＡ和０．０８ ・生物技术・ 的活性碳的ＭＳ基本培养基中，附加不同浓度的琼脂，接 种继代培养后的青蒿组培苗，接种２０ ｄ后观察统计的结 果见表３。随着琼脂浓度的增加，增殖系数变小，玻璃化 率也随之变小，当琼脂为０．７５ 时增殖系数达到３．８３， 玻璃化率为１６．８１ ，当琼脂为０．８０ 时增殖系数为 １．９４，玻璃化率为ｌ４．８６ ，说明青蒿在琼脂浓度适中的 条件下，玻璃化率变化不大，但增殖系数随着琼脂浓度 的升高而急剧下降。在培养过程中发现，当琼脂为 ０．８Ｏ％时，组培苗有变黄坏死现象。综合考虑，该试验确 定琼脂浓度为０．７５ 。 表２蔗糖浓度对青蒿试管苗玻璃化现象的影响 表３琼脂浓度对青蒿试管苗玻璃化现象的影响 ２．４活性碳浓度对青蒿试管苗玻璃化现象的影响 在添加４ 的蔗糖、０．７５ 的琼脂和１．０ ｍｇ／Ｉ 的 ６一ＢＡ的ＭＳ基本培养基中，附加不同浓度的活性碳，接 种继代培养后的青蒿组培苗，接种２０ ｄ后观察统计的结 果见表４。添加活性碳组培苗更健壮（图５、６）。从表４ 可看出，随着碳粉浓度的增加，增殖系数随之减小，玻璃 化率也随之变小，当碳粉浓度为０．０８ 时，增殖系数达 到３．７２，玻璃化率为８．９６ ，增殖系数与上一浓度 （０．Ｏ５ ）相比变化不大，但玻璃化率却显著降低。当碳 粉浓度大于０．０８ 时，增殖系数显著减小，而玻璃化率 变化不大。综合考虑，该试验确定碳粉浓度为０．０８ 。 表４活性碳浓度对青蒿试管苗玻璃化现象的影响 １２１ ・生物技术・ 北方园艺２ｏ１ｏ（２３）：１２ｏ～１２２ 图１ 愈伤组织诱导 图２丛生芽继代培养 图３玻璃化苗１ 图４玻璃化苗２ 图５健壮组培苗１ 图６健壮组培苗２ 图版 ３结论与讨论 在青蒿组织培养过程中，常常出现玻璃化苗，频率 高达６０ －－８０ ，单独采取任何一种处理方式都不能克 服青蒿组织培苗的玻璃化现象。该研究发现在ＭＳ基 本培养基中添加４ 的蔗糖、０．７５ 的琼脂、１．０ ｍｇ／Ｉ 的６－ＢＡ和０．０８％ｏｏ的碳粉能有效控制青蒿组织培苗的玻 参考文献 ［１］Ｎｉｃｈｏｌａｓ Ｓ，Ｈｕａｈｏｎｇ Ｗ，Ｗｅｒｎｅｒ Ｒ６ｍｉｓｃｈ－ＭａｒｇＩ，ｅｔ ａ１．Ａｒｔｅｍｉｓｉｎｉｎ ｂｉｏ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｇｒｏｗｉｎｇ ｐｌａｎｔｓ ｏｆ Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ａ＊ｚ￣＇ｌＵａ．Ａ”ｃ（）２ ｓｔｕｄｙ［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏ— ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１０，７ｌ：１７９—１８７． Ｅ２］Ｈｕａｈｏｎｇ Ｗ，Ｃｈｅｎｆｅｉ Ｍ，Ｚｈｅｎｑｉｕ Ｌ，ｅｔ ａ１．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｍｅｔｈｙｌ ｊａｓｍｏｎａｔｅ ｏｎ ａｒｔｅｍｉｓｉｎｉｎ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｉｎ Ａｒｔｅｍｉｓｉａ “”” Ｌ＿＿Ｊ］．Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｒｏｐｓ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，２０１０，３１：２１４ ２１８． ｒ３］Ｒｉｔａ Ｂ，Ｂｅｎｅｄｅｔｔａ Ｉ， ｅｆａｎｏ Ｐ，ｅｔ ａ１．Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｒｔｅｍｌｓｉｎｉｎ ａｎｄ ｂｉｏ 璃化现象，使增殖系数较高，玻璃化率相对较低，组培苗 也较健壮，移栽成活率高。试验通过调控组织培养条件 ａｃｔｉｖｅ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｆｒｏｍ Ａｒｔｅｍｉｓｉａ“ ”Ｍｎ ｌ ｄｕｒｉｎｇ ｐｌａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ ＥＪ］．Ｂｉｏｃｈｅｍ— ｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｅｃｏｌｏｇｙ，２００８，３６：３４０—３４８． 减少青蒿组培苗玻璃化现象的发生，从而提高组培苗的 产量和质量。为青蒿品种选育和工厂化育苗提供保障， 为植物组织培养过程中试管苗出现玻璃化现象的发生 ［４］杨水平，杨宪，黄建国，等．青蒿素生产研究进展ＥＪ］．热带亚热带植物 学报，２００４，１２（２）：１８９—１９４． ［５］张丽珍，徐淑庆，杨冬业，等．青蒿组织培养及其快速繁殖研究口］．生 物学通报，２０１０，４５（３）：４８—５０． 机理和防止措施的研究提供依据。 对植物组织培养中玻璃化的原因和防止措施的研 究受到广泛关注ｌ＿６ ｊ。如在培养基中添加 、聚乙烯 醇和ＡｇＮ 等物质，在培养过程中控制光质和温度等 ［６］张红，王万新．香石竹组培中的玻璃化现象及防止ＥＪ］．北方园艺， ２００８（８）：１９６—１９７． Ｅ７］潘仰星，黄敬浩，邓昌琳．花椰菜再生苗去玻璃化试验ＥＪ］．福建农业 科技，２００５，５０：５９—６０． 措施来防治玻璃化苗。但目前对试管苗玻璃化的原因 和机理尚无定论。 ［８］戴园园，孙永林，周晓阳．甜瓜试管苗继代培养玻璃化现象的研究 ＿Ｊ］．生物学杂志，２００８，２５（２）：４８—４９． Ｅｇ］王娜，刘孟军，秦子禹．聚乙烯醇在枣和酸枣组织培养中的作用口］． 果树学报，２００６，２３（２）：３０１ ３０３． Ｓｔｕｄｙ ｔｏ Ｏｖｅｒｃｏｍｅ Ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ａｎｎｕａ Ｌ． ＺＨＡＮＧ Ｌｉ－ｚｈｅｎ ，ＹＡＮＧ Ｄｏｎｇ－ｙｅ。，ＪＩＮ Ｚｈｅｎ－ｊｉａｎｇ。，ＬＩＵ Ｘｉａｎ－￣ａｎ （１．Ｇｕｉｌｉｎ Ｎｏｒｍａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｇｕｉｌｉｎ，Ｇｕａｎｇｘｉ ５４１００４；２．Ｇｕｉｌｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｌｉｎ，Ｇｕａｎｇｘｉ ５４１００４；３．Ｇｕｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏＩ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｇｕｉｌｉｎ，Ｇｕａｎｇ￣５４１００４） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗａｓ ａ ｆｉｒｓｔ ｂａｒｒｉｅｒ ｆｏｒ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｒｔｅｍｉｓｉａ口 ７２。￡ａ Ｌ Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｔｏ ｃｏｎｆｉｇｕｒｅ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ６－ＢＡ，ｓｕｃｒｏｓｅ，ａｇａｒ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃａｒｂｏｎ ｕｓｉｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｂｕｄｓ ｏｆ Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ａｎｎｕａ Ｉ ａｓ ｅｘｐｌａｎｔｓ ａｎｄⅣ【Ｓ ｍｅｄｉｕｍ ａｓ ｂａｓｉｃ ｍｅｄｉｕｍ ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｏｒ ｓｏｌｖｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｏｂｌｅｍ ｏｆ ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ａ ｈｅａｌｔｈｙ ｐｌａｎｔ ｃａｎ ｂｅ ｇｏｔ ｂｙ ａｄｄｉｎｇ ０．１０ ｍ Ｌ ６－ＢＡ，４．Ｏ ｓｕｃｒｏｓｅ，Ｏ．７５ ａｇａｒ ａｎｄ Ｏ．０８ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃａｒｂｏｎ ｉｎ ＭＳ ｍｅｄｉａ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ａｒｌｎｕａ Ｌ．；ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ；ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ １２２