β3GalT7基因的小干扰RNA筛选及其表达载体构建

第ｌ７卷第２期　江苏大学学报（医学版）　Ｖｏ１．１７　Ｎｏ．２　２００７年３月　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｊｉａｎｇｓｕ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ）　Ｍａｒ．２ｏｏ７　ＧａｌＴ７基因的小干扰ＲＮＡ筛选及其表达载体构建　朱蜊燕，仇灏，岳爱环，马珍妮，吴　艳，胡鹤娟，吴士良　（苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室、生化－Ｉ－＿程研究所。江苏苏州２１５１２３）　［摘要】　目的：以　Ｃａ／Ｔ７（人Ｂｌ，３－半乳糖基转移酶７）基因为研究对象，运用ＲＮＡ干扰技术平台，筛选出该基因　的有效小干扰ｓｉＲＮＡ并构建该基因的ＲＮＡ干扰表达载体，建立其下调表达模型。方法：通过ＰＣＲ方法筛选针对　Ｇａ／７Ｔ基因的有效小干扰ｓｉＲＮＡ，并合成带有荧光标记的ＲＮＡ　ｏｌｉｇｏ进一步验证其有效性，进而构建该基因的ＲＮＡ　干扰表达载体建立其下调表达模型。结果：成功筛选到　Ｃ．ａ／Ｔ７基因的有效小干扰ｓｉＲＮＡ，并进一步成功构建　Ｇａ／Ｔ７的ＲＮＡ干扰真核表达载体。结论：成功构建　Ｇａ／７Ｔ的真核干扰表达载体，继而可以获得　Ｇａ／Ｔ７表达受　抑制的人胃癌细胞ＳＧＣ７９０１克隆，为研究该基因在肿瘤发生发展中的作用提供实验模型。　［关键词】人１３１，３　乳糖基转移酶７基因；小干扰ＲＮＡ；ＲＮＡ干扰表达载体　［中图分类号】Ｑ５３　［文献标识码］Ａ　［文章编号】　１６７１—７７８３【２００７）０２—００９３一ｏ４　ｌｆ３　ＧａＺＴ７：Ｔｈｅ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｏｆ　ｓｉＲＮＡ　ａｎｄ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＲＮＡｉ－ｖｅｃｔｏｒ　ＺＨＵ　Ｌｉ—ｙａｈ，Ｑｉｕ　Ｈａｏ，ＹＵＥ　Ａｉ—ｈｕａｎ，ＭＡ　Ｚｈｅｎ—ｎｉ，删Ｙａｈ，ＨＵ　Ｈｅ－ｊｕａｎ，删Ｓｈｉ－ｌｉａｎｇ　（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆＳｕｚｈｏｕ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｕｇｈｏａ　Ｊｉａｎｇｓｕ　２１５１２３，Ｃｈｉｎａ）　［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ＲＮＡｉ（ＲＮＡ　ｉｎｔｅｆｒｅｒｉｎｇ）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｔｏ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ　ｔｈｅ　ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ￣Ｃ，ａＺｒ７　ｇｅｎｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｕｓｉｎｇ　ＰＣＲ　ｍｅｔｈｏｄ　ｔｏ　ｓｃｒｅｅｎ　ｔｈｅ　ｍｏｓｔ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ　ＲＮＡ　０ｆ　Ｇａｌ／７，ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｅｄ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｌｙ．１ａｂｅｌｅｄ　ＲＮＡ　ｏｌｉｇｏｓ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｉｔｓ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ　ａｎｄ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｔｈｅ　ＲＮＡｉ．ｖｅｃｔｏｒ　ｏｆ　Ｚ仃．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ　ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ￣Ｃ，ａｔｒ７　ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．　Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ＲＮＡｉ—ｖｅｃｔｏｒ　ｏｆ　Ｚ仃ｌａｙ　ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｔｏ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅ．　［Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ］　ＧａｌＴ７　ｇｅｎｅ；ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ　ＲＮＡ；ＲＮＡｉ－ｖｅｃｔｏｒ　在高等真核生物中，半乳糖普遍存在于各种类型　文旨在运用ＲＮＡｉ干扰技术平台建立该基因的下调　的聚糖中，它们广泛存在于Ｎ－连接或Ｏ一连接糖蛋白　表达模型，为以后此基因的功能研究奠定基础。　和糊旨中，行使着重要的生物学功能。ｐ１，３糖基转　移酶（１３１，３－Ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ￥，ＣＡＺｙ　ｆａｍｉｌｙ　３１，ＥＣ　１材料和方法　２．４．１．）是糖基转移酶中的一个家族。主要包括：　１．１材料　ｐｌ，３．半乳糖基转移酶（１３１，３－Ｇａｌａｃｔｏｓｙｈｒａｎｓｆｅｒａｓ—　１．１．１细胞来源人胃腺癌细胞株ＳＧＣ７９０１购自中　ｅｓ）¨。Ｊ，ｐｌ，３－Ｎ．乙酰氨基葡萄糖转移酶（Ｂ１，３一Ｎ．　国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物　Ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ）　一引，ｆｒｉｎｇｅ（ＬＦＮＧ，　学研究所。　ＭＦＮＧ，ＲＦＮＧ）　卜引，核心１１３１，３一半乳糖基转移酶　１．１．２主要试剂ＨｎｅＳｉｌｅｎｃｅ　ＲＮＡｉ　Ｋｉｔ和ＳｉｌｅｎＣｉｒ—　（ｃｏｒｅ　１　Ｂ１，３－Ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ）　等几个亚家族。　ｃｌｅ　ＲＮＡｉ　Ｋｉｔ购自美国Ａｌｌｅｌｅ公司；小牛血清购自上　ｐｌ，３．半乳糖基转移酶是催化半乳糖反应的一个代　海华美生物公司；ＲＰＭＩ１６４０完全培养基购自Ｇｉｂｃｏ　表性的酶，催化半乳糖（Ｇａｌａｃｔｏｓｅ，Ｇａ１）和氨基己糖　公司；胰蛋白酶购自Ｓｉｇｍａ公司；Ｈｐｏｆｃｅｔａｍｉｎｅ￣　Ｈｅｘ（ＮＡｃ）之间形成Ｂ１，３连接。以卢３Ｇａ／Ｔ１为信息　２０００转染试剂购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司。ＳｔｕＩ内切酶、Ｔ４　探针，通过同源筛选的策略，目前已经从该家族中克　ＤＮＡ连接酶购自ＭＢＩ公司；ＤＥＰＣ购自上海华舜生　隆得到６个成员（　Ｇａｌ—Ｔ１，　，７＇３，１＂４，／＇５，Ｔ６）。　物工程公司；ＲＴ—ＰＣＲ试剂盒购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司；琼　ＧａｉＴ＇／基因是本实验室克隆到的一个新基因，本　脂糖、ＤＮＡ标准参照物购自南京大治生物公司。　【基金项目】国家自然科学基金资助项目（３０６７０４６２）　【作者简介】朱刑燕（１９８２一），女，硕士研究生；吴士良（联系人），教授．博士生导师．Ｅ—ｍａｉｌ￣ｓｈｉｌｉａｎｇｗｕ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｌｎ　维普资讯 http://www.cqvip.com

江苏大学学报（医学版）　第１７卷　１．１．３引物设计设计引物采用Ｇｅｎｅｔｙｘ软件，并　经ＧｅｎＢａｎｋ　Ｂｌａｓｔ进行同源检索后合成。引物由上　海英骏公司合成。　Ｂ－ＭＧ（预期扩增产物长度３３０　ｂｐ）　Ｆ：５　．ＣＴＣＧＴＧＣＴＡＣＴＣＴＣＴＣ　Ｉ］　℃－３　Ｒ：５　－ＣＡＴＧＴＣＴＣＧＡＴＣＣＣＡＣ　ＩＴＡＡＣ－３　Ｃ，ａｌＴ７的ＲＴ－ＰＣＲ引物为：（预期扩增产物长　度３０２　ｂｐ）　Ｆ：５　．ＣＴＡＴＧＴＧＣＣＣＧＡＧＴＣＣＴｒＣＴｒＣＧ－３　（１３２４－１３４６　ｎｔ）　Ｒ：５　．ＧＣＡＧＴｒＧＴｒｌ＇ＣＣＡＧＡＧＣＣＧＡＡＴＧ－３　（１６０３－１６２５　ｎｔ）　１．２　方　法　１．２．１　ｓｉＲＮＡ的设计利用互联网资源和小干扰　ＲＮＡ设计原则选取四条可能的序列作为目标序列　（表１）。　表１　ａ３ｃ，ａｒｒ小干扰ＲＮＡ候选序列的设计　Ｔａｂ　１　Ｄｅｓｉｇｎ　ｏｆ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ　ＲＮＡ　１．２．２　ｓｉＲＮＡ内源表达系统的获得根据表１，按照　ＬｉｎｅＳｉｌｅｎｃｅ　ＲＮＡｉ　Ｋｉｔ试剂盒说明，每条ｓｉＲＮＡ分别合　成正义链、反义链的下游基因特异性引物，通过ＰＣＲ　方法得到　Ｃａ／Ｔ／基因的ｓｉＲＮＡ内源表达系统。　１．２．３　ＧａｌＴ７有效ＳｉＲＮＡ的筛选　按照ｌｉｐｏ－　ｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００要求将通过ＰＣＲ方法得到的ｓｉＲＮＡ　内源表达系统转染ＳＧＣ７９０１细胞，４８　ｈ后收集细　胞。ＲＴ．ＰＣＲ方法验证设计的ｓｉＲＮＡ的效率。　细胞的总ＲＮＡ的提取采用Ｔｒｉｚｏｌ一步法。以　所得到的细胞总ＲＮＡ为模板，使用Ｐｒｏｍｅｇａ公司的　试剂盒进行ＲＴ反应，得到　Ｃａ／Ｔ／基因的ｃＤＮＡ。　随后ＰＣＲ反应验证　Ｃａ／Ｔ／基因ｍＲＮＡ水平的表　达变化，重复实验筛选出最为有效的ｓｉＲＮＡ。　１．２．４有效ｓｉＲＮＡ对　ＧａｌＴ７抑制效率的鉴定　根据之前筛选得到的有效ｓｉＲＮＡ，合成正义链３　端　带有ＴＡＭＲＡ荧光标记的　ＧａｌＴ７的ＲＮＡ　Ｏｌｉｇｏ，序　列如下：正义链５　－ＧＣＣＵＣＡＡＡＧＵＧＵＡＣＡＵＣＧＡｔｔ－　３　，反义链５　．ＵＣＧＡＵＧＵＡＣＡＣＵＵＵＧＡＧＧＣｔｔ－３　，通　过脂质体方法将ＲＮＡ　ｏｌｉｇｏ转染ＳＧＣ７９０１细胞，荧　光成像系统观察细胞转染效果。　１．２．５　ｓｉＲＮＡ对　Ｇａ／Ｔ７抑制效率的鉴定将合　成的ｓｉＲＮＡ　Ｏｌｉｇｏ按照ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００说明书转　染ＳＧＣ７９０１细胞，转染４８　ｈ后收集细胞。ＲＴ．ＰＣＲ　半定量验证有效ｓｉＲＮＡ的抑制效率：方法同前。　１．２．６　ＧａｌＴ７基因ＲＮＡ干扰表达载体的构建　按照ＳｉｌｅｎＣｉｒｃｌｅ　ＲＮＡｉ　Ｋｉｔ说明合成　ＧａｌＴ７有效候　选序列的ＤＮＡ插入片段，序列如下：　有效ｓｉＲＮＡ（　Ｃａ／Ｔ／．Ｓｉ）：　Ａ链：５　ａｃａｃｃＧＣＣＴＣＡＡＡＧＴＧＴＡＣＡＴＣＧＡｔｔｇｃｔ－　ｔｇａａＴＣＧＡＴＧＴＡＣＡＣＴＩｑ＇ＧＡＧＧＣｔ　３　Ｂ链：３　ｇＣＧＧＡＧ　ｒＩＴＣＡＣＡＴＧＴＡＧＣＴａａｃｇａａｃｔ－　ｔＡＧＣＴＡＣＡＴＧＴＧＡＡＡＣＴＣＣＧａａａ姐５　：　阴性对照（　Ｃａ／Ｔ／－ＳＣＲ）：　Ａ链：５’ａｃａｃｃＡＣＧＡＧＴＧＡＣＴＧＣＣＡＴＡＣＡＴｔｔｇｃｔ－　ｔｇａａＡＴＧＴＡＴＧＧＣＡＧＴＣＡＣＴＣＧＴｔ　３　Ｂ链：３　ｇＴＧＣＴＣＡＣＴＧＡＣＧＧＴＡＴＧＴＡａａｃｇａａｃｔｔ－　ＴＡＣＡＴＡＣＣ（　ＣＡＧＴＧＡＧＣＡａａａａａ　５　按照ＳｉｌｅｎＣｉｒｃｌｅ　ＲＮＡｉ　Ｋｉｔ说明书，将合成的两　个插入片段退火形成双链，以Ｔ４ＤＮＡ连接酶定向连　接入带有酶切位点的ｐＳｉｌｅｎＣｉｒｃｌｅ空载体中，连接产　物转化入感受态细菌ＤＩ－ＩＳｏｔ，氨苄抗生素筛选培养。　随机挑选抗性菌落，摇菌抽提质粒进行酶切鉴定重　组子，在此基础上进行测序验证。　２结果　２．１　ｓｉＲＮＡ内源表达系统的获得　用ＰＣＲ方法分别扩增得到所设计的４条ｓｉＲＮＡ　正义链和反义链的内源表达系统，每条表达系统仅　含启动子、ｓｉＲＮＡ片段和终止位点，约３００　ｂｐ左右　（图１），可以在细胞内独立启动转录得到ｓｉＲＮＡ的　正义链和反义链，从而引起ＲＮＡ干扰效应。　１：标准ＤＮＡ分子质量参照物；２～５：４条候选干扰序列正义　ｓｉＲＮＡ转录本；６～９：４条候选干扰序列反义ｓｉＲＮＡ转录本　图１￣ｃ，ａｒ７的ｓｉＲＮＡ内源表达系统　Ｆｉｇ　１　Ｆｏｕｒ　０ｏｔｅｎｔｉ￣ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ　ＲＮＡ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　０ｆ　Ｇ吐ｆ丌　２．２　Ｃ，ａｌＴ７有效ｓｉＲＮＡ序列的筛选　将所设计的４条不同ｓｉＲＮＡ的正义链和反义链　转染人ＳＧＣ７９０１细胞株，４８　ｈ后分别测定每个细胞　株ｇ３ＧａｌＴ７　ｍＲＮＡ水平的表达。ＲＴ－ＰＣＲ结果显示，　以￣，－ＭＧ作为内参对照，转染第１和３条ｓｉＲＮＡ的　啪维普资讯 http://www.cqvip.com

第２期　朱刑燕，等．　Ｇａ／Ｔ７基因的小干扰ＲＮＡ筛选及其表达载体构建　细胞／３３ＧａｉＴ７抑制效率十分明显，其余两条抑制效　果不明显。重复实验后选择第１条ｓｉＲＮＡ作为　／３３ＧａｉＴ７的高效ｓｉＲＮＡ，结果见图２。　３００ｂｐ　４００ｂｐ　５００ｂｐ　ＳＧＣ７９０１细胞在激发波长为５４０　ｎｍ时发出玫瑰红　荧光（图３）。　２．４　ｓｉＲＮＡ对／３３Ｃａ／Ｔ？抑制效率的鉴定　ＲＴ－ＰＣＲ结果显示，化学合成的ｓｉＲＮＡ　ｏｌｉｇｏ对　／３３Ｇａ／Ｔ７基因的抑制作用非常显著，抑制效率达到　９０％以上（图４）。　６００ｂｐ　２．５／３３Ｇａ／Ｔ７基因ＲＮＡ干扰表达载体的构建　－ＭＧ　根据ＰＣＲ方法筛选得到的高效ｓｉＲＮＡ，分别合　成带有酶切位点的正义链和反义链，退火后与预切　好的载体ｐＳｉｌｅｎＣｉｒｃｌｅ连接，构成重组质粒ｐＳｉｌｅｎＣｉｒ－　ｃｌｅ－ｓｉａ３Ｃ．ａ２Ｔ７。同时将ｓｉＲＮＡ序列打乱次序并　ＢＬＡＳＴ同源检索后，构建ｐＳｉｌｅｎＣｉｒｃｌｅ－Ｓｃｒ／３３Ｇａ／Ｔ７作　为对照，Ｓｔｕｌ内切酶酶切鉴定重组质粒，若质粒发生　自连接则得到３．５　ｋｂ和１．１　ｋｂ的两条带，而质粒与　ＤＮＡ插入片段连接则得到４．６　ｋｂ的一条带（图５）。　Ｉ：标准ＤＮＡ参照物；２：ＳＣ，Ｃ￣９０１细胞；３～６：分别转染了４条候　选序列的ＳＣ，Ｃ￣９０１细胞　图２不同ｓｉＲＮＡ引起的ａ３ｃ，ｄ￣的ｍＲＮＡ表达变化　Ｆｉｇ２　ＲＴ－ＰＣＲ　ｐｒｏｆｉｌｅｓ　０ｆ　ｉｎ　ｆｉｖｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｅｌｌｓ　７７　ｍＲＮＡ　２．３　荧光成相系统观察转染后细胞　将细胞置于荧光显微镜下，可以看到转染后的　进一步测序结果表明序列已正确插入载体中。　图３荧光显微镜观察转染后细胞　Ｆｉｇ　３　ＳＧＣ７９０１　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｓｉＲＮＡ　ｂｙ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　架，将其转染入细胞，利用表达框架中的Ｕ６启动子　３００１￣　分别转录得到ｓｉＲＮＡ的正义链和反义链，进而观察　是否能引起目的基因的表达下调；再使用合成的立　，８－ＭＧ　即可用的ＲＮＡ双链体鉴定筛选所得的高效ｓｉＲＮＡ　的基因沉默效率。　１：标准ＤＮＡ参赠物；２：ＳＣ，Ｃ￣９０１；３：ＳＧＣ７９０１细胞转染化学合　成　ＧａｉＴ７的ｓｉＲＮＡ　图４化学合成ｓｉＲＮＡ对ｐ３ｃ，￣抑制效率的检测　Ｆｉｇ　４　ＲＴ－ＰＣＲ　ｐｒｏｆｉｌｅｓ邶３６；口ｆ７７　ｍＲＮＡ　ｉｎ　ｃｅｌｌｓ　ｔｒａｎｓｆｃ￣ｄ　ｗｉｔｈ　ｓｉＲＮＡ　ｂｙ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　２ｏｏｏｂｐ　３　５００ｂｐ　３讨论　５　４　３　２　ｌ　５０００ｂｐ　目前为止，制备ｓｉＲＮＡ的方法各有不同¨　Ｍ］，　较为常用的方法有通过化学合成、体外转录、长片段　ｄｓＲＮＡ经ＲＮａｓｅⅢ类降解体外制备，以及通过ｓｉＲ－　ＮＡ表达载体或者病毒载体、ＰＣＲ制备ｓｉＲＮＡ表达　框架在细胞中表达产生ｓｉＲＮＡ。在本实验进行的高　效ｓｉＲＮＡ筛选时，选用ＰＣＲ方法制备ｓｉＲＮＡ表达框　ｌ：ｌＫｂ　ＤＮＡ分子量参照物；２：ｐＳｉｌｅｎＣｉｒｃｌｅ—Ｓ　Ｇ　仃；３：经Ｓｔｕｌ　内切酶酶切ｐＳｉｌｅｎＣｉｒｃｌｅ—Ｓ￣Ｃ．ａＺＴ７；４：ｐＳｉｌｅｎＣｉｒｃｌｅ—ｓｃｑ∞　ｚ仃；５：经　Ｓｔｕｌ内切酶酶切ｐＳｉｌｅｎＣｉｒｃｌｅ—ｓｃｑＢ３　ｚ仃；　图５　ｐ３ｃ，￣－ＲＮＡｉ载体的构建及鉴定　Ｆ－嚷５　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　６　７７－ＲＮＡｉ　ｖｅｃｔｏｒ　维普资讯 http://www.cqvip.com

江苏大学学报（医学版）　第１７卷　ＳｉｌｅｎＣｉｒｅｌｅ　ＲＮＡ干扰试剂盒是带质粒的ＲＮＡ　２００ｌ，２７６（２５）：２２０３２—２２０４０．　干扰系统，它使用基于ＲＮＡ的ｕ６聚合酶Ⅲ启动子　和优化的终止子，从而在靶细胞内可以精确地形成　小分子干扰ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）。通过质粒上携带的筛选　标记，转染哺乳动物细胞，可建立ｓｉＲＮＡ表达的稳　定细胞系。通过Ｓｉｌｅｎｃｉｒｃｌｅ质粒与正义的ＤＮＡ插　［６］Ｋａｔａｏｋａ　Ｋ，Ｈｕｈ　Ｎ．Ａ　ｎｏｖｅｌ　ｂｅｔａ１．３－Ｎ．ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉ－　ｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｉｎｖａｓｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅＨｓ　ａｓ　ａｓ．　ｓａｙｅｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｒｅ．　ｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉ０ｎｓ，２００２，２９４（４）：８４３—８４８．　［７］Ｃｏｌｅ　ＳＥ，Ｌｅｖｏｒｓｅ　ＪＭ，Ｔｉｌｇｈｍａｎ　ＳＭ，ｅｔ　ａ１．Ｃｌｃｋｒｏｅｇｕｌａ－　ｔｏｒｙ　ｅｌｅｍｅｎｔｓ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｃｙｃｌｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｌｕｎａｔｉｃ　ｆｒｉｎｇｅ　入片段或反义的ＤＮＡ插入片段相连接，便可介导　ｓｉＲＮＡ的产生，或者单个质粒与一个具有发夹结构　的ＤＮＡ插入片段相连接，也可介导ｓｉＲＮＡ的产生。　本实验通过成功构建了　ＧａｌＴ＇／的ＲＮＡ干扰真核　表达载体，继而可以获得　Ｇａ／Ｔ７基因表达受抑制　的人胃癌细胞ＳＧＣ７９０１克隆，为研究该基因在肿瘤　发生发展中的作用提供了实验模型。　ｄｕｒｉｎｇ　ｓｏｍｉｔｏｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　Ｃｅｕ，２００２，３　（１）：７５—８４．　［８］　Ｍｏｒａｎ　ＪＬ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ　ＳＨ，Ｒａｕｓｋｏｌｂ　Ｃ，ｅｔ　ａ１．Ｇｅｎｏｍｉｃ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｍａｐｐｉｎｇ，ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍ砌一　ｍａｌｉｎ　ａＬｕｎａｔｉｃ，Ｍａｎｉｃ，ａｎｄ　Ｒａｄｉｃａｌ　ｆｉｒｎｇｅ　ｇｅｎｅｓ［Ｊ］．　Ｍａｍｍ　Ｇｅｎｏｍｅ，ｌ９９９，１０（６）：５３５—５４１．　［９］Ｔｏｎｇｚｈｏｎｇ　Ｊｕ，Ｒｉｃｈａｒｄ　Ｄ．Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ａ　ｕｎｉｑｕｅ　ｍｏｌｅｃ－　ｕｌａｒ　ｃｈａｐｅｒｏｎｅ　Ｃｏｓｍｃ　ｒｅｑｕｉｒｅｄ　ｆｏｒ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍ肿－　［参考文献］　［１］Ｋｏｌｂｉｎｇｅｒ　Ｆ，Ｓｔｒｅｉｆ　ＭＢ，Ｋａｔｏｐｏｄｉｓ　ＡＧ．Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ａ　ｈｕ－　ｍａｉｌ　ＵＤＰ－ｇａｌａｃｔｓｅ：２－ａｃｅｔｅａｍｉｄｏ－２－ｄｅｏｘｙ－Ｄ－　ｕｃ０ｓｅ　３－　ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒｅｓｅ　ｃａｔａｌｙｚｉｎｇ　ｔｈｅ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｙｐｅ　１　ｍａｌｉｎ　ｃｏｒａｅ　ｌ　Ｂ３・ｇａｌａｃｔｏｓｙｈｒａｎｓｆｅｒｓｅ［Ｊ］．ＰＮＡＳ，ｅ　２０ｏ２，９９：ｌ６６ｌ３一ｌ６６ｌ８．　［１０］Ｅｌｂａｓｈｉｒ　ＳＭ，Ｈａｒｂｏｒｔｈ　Ｊ，Ｌｅｎｄｅｃｋｅｌ　Ｗ，ｅｔ　ａ１．Ｄｕｐｌｅ－　ｘｅｓ　ｏｆ　２１．ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ＲＮＡｓ　ｍｅｄｉａｔｅ　ＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ　ｉｎ　ｃｈａｉｎｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，１９９８，２７３（１）：４３３—４４０．　［２］Ａｍａｄｏ　Ｋ，Ａｌｍｅｉｄａ　Ｒ，Ｃａｍｅｉｒｏ　Ｆ，ｅｔ　ａ１．Ａ　ｆａｍｉｌｙ　ｏｆ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｍａｍｍａｌｉｎ　ｃｅｉａｌｓ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２００１，４１ｌ　（６８３６）：４９４—４９８．　ｈｕｍａｎ　Ｂ３－Ｇａｌａｃｔｓｏｙｈｒａｎｓｆｅｒｓｅｅｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，　１９９８，２７３（２１）：１２７７０—１２７７８．　［１１］Ｈｏｌｅｎ　Ｔ，Ａｍａ￣ｇｕｉｏｕｉ　Ｍ，Ｗｉｉｇｅｒ　ＭＴ，ｅｔ　ａ１．Ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｓｈｏｒｔ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡｓ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ｃｏ－　［３］　Ｉｓｓｈｉｋｉ　Ｓ，Ｔｏｇａｙａｃｈｉ　Ａ，Ｋｕｄｏ　Ｔ，ｅｔ　ａ１．Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｅｘ－　ｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｎｏｖｅｌ　ＵＤＰ－ｇａｌａｅｔｏｓｅ：　ａｇｕｌａｔｉｏｎ　ｔｒｉｇｇｅｒ　Ｔｉｓｕｅ　Ｆａｃｔｏｒ［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ，　２００２，３０（８）：１７５７—１７６６．　Ｂ－Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ　８１，　３－ｇｌａｃｔａｓｙｌｏｔｒａｎｓｆｅｒｓｅ　ｅ（Ｂ３Ｇａ１－１＂５）ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ　ｆｏｒ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ｔｙｐｅ　１　ｃｈａｉｎ　ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ　ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　ｅｐｉｈｅｌｔｉａ　ａｎｄ　ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌｌｓ　ｄｅｒｉｖｅｄ　［１２］Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ　ＴＲ，Ｂｅｍａｒｄｓ　Ｒ，ＡｇａＩＩｌｉ　Ｒ．Ａ　ｓｙｓｔｅｍ　ｏｆｒ　ｓｔａｂｌｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｓｈｏｒｔ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡｓ　ｉｎ　ｍａｍｍａｌｉ－　ｎ　ｃｅａｌｌｓ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２，２９６（５５６７）：５５０－５５３．　［１３］Ｐａｄｄｉｓｏｎ　ＰＪ，Ｃａｕｄｙ　ＡＡ，Ｂｅｍｓｔｅｉｎ　Ｅ，ｅｔ　ａ１．Ｓｈｏｒｔ　ｈａｉｒ－　ｐｉｎ　ＲＮＡｓ（ｓｈＲＮＡｓ）ｉｎｄｕｃｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｓｐｅｃｉｉｆｃ　ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ　ｔｈｅｒｅｆｏｒｍ［Ｊ］．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，１９９９，２７４（１８）：１２４９９—　１２５０７．　［４］ＳｈｉｒａｉｓｈｉＮ，ＮａｔｓｕｍｅＡ，ＴｏｇａｙａｃｈｉＡ，ｅｔ　ａ１．Ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａ－　ｉｔｏｎ　ｎｄ　ｃｈａｒａａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｒｅｅ　ｎｏｖｅｌ　８１，３－Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－　ｇｌｕｃｓａｍｉｅｎｙ　ｈｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ　ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ　ｅｌｒａｔｄ　ｅｔｏ　ｈｅｔ　１３１，３－　ｉｎ　ｍａｍｍａｌｉｎ　ｃｅＨｓ［Ｊ］．Ｇｅｎｅｓａ　Ｄｅｖ，２００２，１６（８）：４８　９—９５８．　［１４］Ｂｉｌｌｙ　Ｅ，Ｂｒｏｎｄａｎｉ　Ｖ，Ｚｈａｎｇ　Ｈ，ｅｔ　ａ１．Ｓｐｅｃｉｉｆｃ　ｉｎｔｅｒｆｅｒ－　ｅｎｃｅ　ｗｉｔｈ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｌｏｎｇ，ｄｏｕｂｌｅ－　ｓｔｒｎｄｅｄ　ＲＮＡ　ｉｎ　ｍｏｕｓｅ　ｅｍｂｒａｙｏｎａｌ　ｔｅｒａｔｏｃａｒｅｉｎｏｍａ　ｃｅｌｌ　ｇａｌａｃｔｓｙｌｏｔｒａｎｓｆｅｒｓｅ　ｆｅａｍｉｌｙ［Ｊ］．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，２００１，２７６　（５）：３４９８—３５０７．　［５］Ｔｏｇａｙａｃｈｉ　Ａ，ＡｋａｓｈｉｍａＴ，Ｏｏｋｕｂｏ　Ｒ，ｅｔ　ａ１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＵＤＰＧＩｃＮＡｃ：ｌａｃｔｏｓｙｌｃｅ－　ｌｉｎｅｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ　Ｎａｄ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，２００１，９８（２５）：　１４４２８—１４４３３　ｒａｍｉｄｅ　ｂｌ，３－Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇＩｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ｂ３Ｇｎ－　Ｔ５），ａｎ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｅｎｚｙｍｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＨＮＫ－１　【收稿日期】２００７一Ｏｌ一２２　【本文编辑】何承志　ｎｄ　Ｌｅｗｉａｓ　Ｘ　ｅｐｉｔｏｐｅｓ　ｏｎ　ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，