枸杞多糖的超声法提取法

1、枸杞多糖的含量测定

1）、标准曲线的绘制 精密称取于105％干燥至恒重的无水葡萄糖对照品100 mg，加入100 ml容量瓶中，用纯化水溶解至刻度。分别精密移取对照品储备液0．5，1．0，2．0，3．0，4．0，5．0 ml于100 ml量瓶中，加水稀释至刻度，然后各取1．0 ml于10 ml比色管中，分别加入5％ 的苯酚溶液1．0 ml，摇匀后加入5．0 ml浓硫酸，立即摇匀，在沸水浴中加热15 min，冷却至室温。以纯化为空白对照，在487 nm处测吸光度值A。以吸光度值为横坐标，浓度为纵坐标，绘制标准曲线。

2）、样品含量的测定 取干燥的枸杞多糖供试品，按实际实验结果将其稀释至合适浓度。精密吸取待测液1．0 ml，置于10 ml比色管中，按“2．1．1”方法显色，测定A值，按公式计算多糖含量。按下式计算多糖含量(% ) = 3. 17C × D /W×100％,式中C为样品溶液的葡萄糖质量浓度(mg／m1)，D为样品溶液的稀释倍数，f为换算因子(f=3．17) ，w为样品质量(mg)

2、正交试验考察提取工艺（单因素试验）

1）、料液比的影响 称取枸杞样品4份，均为5g，分别加入lO、20、30、40倍水量，在50℃，pH=7，超声提取30 min，浓缩至20 ml左右，加5倍95％乙醇沉淀，沉淀再溶解，测定吸光度，从而比较多糖含量的提取率。

2）、时间的影响 称取枸杞样品4份，均为5 g，加入10倍水量，在50~C，pH=7，分别超声提取10 min、20 min、30 min、40min，浓缩至20 ml左右，加5倍95％ 乙

醇沉淀，沉淀再溶解，测定吸光度，从而比较多糖含量的提取率。

3）、温度的影响 称取枸杞样品4份，均为5 g，加入10倍水量，分别在40℃、50℃ 、60℃ 、70℃ ，pH=7，超声提取从而比较多糖含量的提取率。

4)、pH值的影响 称取枸杞样品4份，均为5 g，分别加入10倍水量，分别在pH=7、8、9、10，50℃ ，超声提取30 min，浓缩至20 ml左右，加5倍95％乙醇沉淀，沉淀再溶解，测定吸光度，从而比较多糖含量的提取率。

3、正交试验设计

根据影响多糖提取的单因素试验结果，考察多因素对多糖得率及含量的影响，按正交设计表L9(3 )进行试验，每次取干燥枸杞子5．0 g，按2中单因素试验的因素和水平设计正交实验设计进行提取，提取完后过滤，浓缩滤液至20ml左右，置于100 ml的带塞锥形瓶中，加入95％ 乙醇100 ml，静置16 h。将醇沉液离心分离(3000 r／min，10 min)，固形物分别用95％乙醇、无水乙醇、丙酮洗涤，水浴加热干燥得枸杞粗多糖，称重。

表3 枸杞多糖超声波提取法的正交因素水平表

水平 因素

料液比 A 温度/℃ B PH C 时间/h D

1 1：10 40 7 10

2 1：20 50 8 20

3 1：30 60 9 30

4 1：40 70 10 40

4、工艺改进

我对于超声波提取法进行进一步的改进，前面我们对于超声波提取法的提取时间、pH值、温度和料液比的最佳工艺条件已经确定，对于超声波提取次数进行改进。做一个单因素试验，提取次数分别设定为1、2、3次。

5、枸杞多糖的抗氧化性研究

1）、枸杞多糖的还原性的测定

取2.5 ml多糖样品于试管中, 依次加入2.5m l 2. 5mol/L磷酸盐缓冲液( phosphatebu ffer saline, PBS, pH 6. 6)和2. 5m l 1%六氰合铁酸钾溶液(K3 Fe(CN )6 ), 50℃下保温20 min 后快速冷却, 再加入25m l 10%三氯醋酸溶液( TCA ), 以3 000 r /m in 的转速离心10m in, 取上清液2.5 ml,依次加入2. 5 m l蒸馏水, 0. 5 ml 0. 1%、三氯化铁溶液( FeCl3), 充分混匀, 静置10m in后, 在700 nm下测定其吸光度值(以蒸馏水代替样品的混合液作参比溶液), 吸光度值越高还原力越强。

2）、枸杞多糖清除超氧阴离子自由基的能力

采用邻苯三酚自氧化法, 取4. 50ml 0.1mol/L Tris-HCl缓冲液( pH 8. 2), 依次加入1.00ml乙二胺四乙酸钠( EDTA )溶液, 1.00m l样品溶液, 2.40 ml水, 混匀, 于25℃水浴中反应10min, 再加入100ul 9 mmol/L 邻苯三酚, 加入时计时, 混匀, 准确反应60 m in后,

加入50ul 2mol/L HCl溶液, 终止反应, 在325 nm处测定吸光度值As。空白管以1.00m l蒸馏水代替1.00 ml样品, 操作方法同样品管, 可测得空白管的吸光度Ac。

清除率(% )=（Ac-As）/Ac×100

As: 含有待测物的反应液于325 nm的吸光度值

Ac: 不含有待测物的反应液于325 nm 的吸光度值

参考文献

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