脑胶质瘤干细胞的体外培养与生物学特性观察

山东医药２００７年第４７卷第１５期　・论著・　脑胶质瘤干细胞的体外培养　与生物学特性观察　车树圣　，孟庆海¨，金澎　，李洛　，刘福生　（１青岛大学医学院附属医院，山东青岛２６６００３；２北京天坛医院）　【摘要】　目的体外培养人脑胶质瘤干细胞并观察其生物学特性。方法应用无血清培养技术，从手术中获　取的人脑胶质瘤组织培养得到肿瘤干细胞，诱导其分化后与原肿瘤组织细胞进行比较。应用细胞免疫荧光技术鉴　定肿瘤干细胞表面标志物。结果分别在间变性星形细胞瘤和胶质母细胞瘤中培养得到悬浮生长的肿瘤干细胞　球，其能在体外自我更新、增殖，形成新的克隆性细胞球，保持连续稳定的传代，能表达神经干细胞表面标志物　ＣＤ１３３。在含血清培养基中能够分化为与原肿瘤组织相似的贴壁生长的细胞。结论人脑胶质瘤中存在一定量的　肿瘤干细胞，能够自我更新增殖、诱导分化、表达干细胞标志物ＣＤ１３３。为探讨脑胶质瘤的发病机制奠定了基础。　【关键词】脑肿瘤；肿瘤干细胞；细胞培养　【中图分类号】Ｒ７３９．４　【文献标识码】Ａ　【文章编号】１００２－２６６Ｘ（２００７）１５－０００１－０２　Ｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｓ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｂｒａｉｎ　ｇｌｉｏｍａ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ＣＨＥ　Ｓｈｕ—ｓｈｅｎｇ　，ＭＥＮＧ　Ｑｉｎｇ—ｈａｌ，　，ⅣＰｅｎｇ，ＬＩ　Ｌｕｏ，ＬＩＵ　Ｆｕ—ｓｈｅｎｇ　（１　Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｑｉｎｇｄａｏ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｑｉｎｇｄａｏ　２６６００３・Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：［Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ］Ｔｏ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｈｕｍａｎ　ｂｒａｉｎ　ｇｌｉｏｍａ　ｔｕｍｏｒ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｏｂｓｅｒｖｅ　ｔｈｅｉｒ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ．［Ｍｅｔｈｏｄｓ］Ｇｌｉｏｍａ　ｔｉｓｓｕｅ　ｆｒｏｍ　ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｉｃａｌ　ｏｐｅｒａｔｉｏｎ　ｗｅｒｅ　ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ｓｉｎｇｌｅ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｉｎ　ｓｅｒｕｍ　ｆｒｅｅ　ｍｅｄｉｕｍ．Ｔｈｅｉｒ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｃｏｕｒｓｅ　ｏｆ　ｃｅｌｌ　ｓｐｈｅｒｅｓ　ｗｅｒｅ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ．Ｔｈｅ　ｔｕｍｏｒ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｔｕｍｏｒ　ｔｉｓｓｕｅ．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＣＤ１３３　ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｓｔａｉｎｉｎｇ－［Ｒｅｓｕｌｔｓ］Ｂｒａｉｎ　ｔｕｍｏｒ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｓｐｈｅｒｅｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　ＣＤ１３３　ｗｅｒｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ａｎｄ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｆｒｏｍ　ａｎａｐｌａｓｔｉｃ　ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ　ａｎｄ　ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ　ｔｉｓｓｕｅ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｔＯ　ｓｅｌｆ—ｒｅｎｅｗ　ａｎｄ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅ．Ｔｈｅｙ　ｃｏｕｌｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉａｔｅ　ｉｎｔｏ　ｃｅｌｌｓ　ｓｉｍｉｌａｒ　ｔＯ　ｔｈａｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｔｕｍｏｒ　ｔｉｓｓｕｅ　ｉｎ　ｓｅｒｕｍ　ｍｅｄｉｕｍ．［Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ］　Ｔｕｍｏｒ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｗｈｉｃｈ　ｃａｎ　ｓｅｌｆ—ｒｅｎｅｗ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓ　ＣＤ１３３　ｅｘｉｓｔ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｇｌｉｏｍａ．Ｔｈｉｓ　ｆｉｎｄｉｎｇ　ｈｅｌｐ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｂｒａｉｎ　ｇｌｉｏｍａ　ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ・　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｂｒａｉｎ　ｔｕｍｏｒ；ｔｕｍｏｒ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ；ｃｅｌ１　ｃｕｌｔｕｒｅ　肿瘤干细胞是肿瘤起源、复发和转移的关键细　例脑胶质瘤患者第１次行手术治疗的胶质瘤组织，　胞。目前为止，人们已成功的从造血系统恶性肿瘤、　其中间变性星形细胞瘤３例，多形性胶质母细胞瘤４　乳腺癌组织［１　］中分离并培养出各自的肿瘤干细胞。　例。均于术中取肿瘤深部无囊变、无坏死的瘤组织块　２００５～２００６年，我们对人脑胶质瘤组织进行分离培　置于盛有Ｈａｎｋ　Ｓ液的小瓶中备用。　养并观察其肿瘤干细胞的生物学特性。　１．２方法　１材料与方法　１．２．１　肿瘤干细胞的分离租培养　在平皿中用　１．１　材料ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）培养基、胎牛血清、　Ｈａｎｋ　Ｓ液冲洗肿瘤组织块２～３次，无菌条件下用眼　２　Ｂ２７、表皮生长因子（ＥＧＦ）、成纤维细胞生长因子　科剪剪成约１　ｍｍ。大，吸管反复吹打，悬液过４００目　（ｂＦＧＦ）、红细胞裂解液、兔抗人ＣＤ１３３抗体、二抗异　细胞筛后１　０００　ｒ／ｍｉｎ离心５　ｍｉｎ。离心管中留２　ｍ１　硫氰酸荧光素（ＦＩＴＣ）标记羊抗兔免疫球蛋白（Ｉｇ）、　上清液，加入４　ｍ１红细胞裂解液轻轻吹打作用　羊血清封闭液、苏木素一伊红。肿瘤标本均为我院７　３　ｍｉｎ，１　０００　ｒ／ｍｉｎ离心５　ｍｉｎ，除去上清液。用含有　生长因子的无血清培养基重新悬浮为单细胞悬液，　［基金项目］山东省自然科学基金重大课题资助项目（Ｚ２ＯＯ６ＣＯ２）。　以１×１０　／ｍｌ接种于含有２　Ｂ２７、ＥＧＦ（２０　ｂｔｇ／Ｌ）及　＊通讯作者　ｂＦＧＦ（２０／ｚｇ／Ｉ　）的ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养基中，３７℃、　１　维普资讯 http://www.cqvip.com

山东医药２００７年第４７卷第１５期　５　ＣＯ　条件下培养。每２～３　ｄ给予半量换液，原代　肿瘤中含量很少，原代培养比较困难。我们体会：①　实验标本，以提高肿瘤干细胞分离培养的成功率；②　肿瘤的恶性程度越高，原代肿瘤干细胞球出现的时　培养７～１０　ｄ可见大量悬浮细胞球出现。以后每７　ｄ　应选择肿瘤深部元坏死、元钙化、未电凝的瘤组织为　将细胞球吹散为单细胞悬液进行传代培养。　１．２．２　肿瘤干细胞的诱导分化　取第５代的肿瘤　干细胞球，离心后除去原培养基，用含有１Ｏ　胎牛血　间越早，形成细胞球的速度越快；⑧恶性度较高、质　地软的标本分离细胞时不需用胰酶消化，以减少对　细胞的损伤；④细胞悬液用红细胞裂解液破坏红细　清的ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养基，接种于放置有多聚赖氨酸　包被盖玻片的小平皿中，观察肿瘤干细胞的分化情　况。在接种３　ｄ后取出盖玻片行苏木素一伊红染色，　显微镜下观察并与原肿瘤组织病理切片比较。　１．２．３　肿瘤干细胞表面标志物ＣＤ１３３的检测　取　生长状况良好的传代细胞球悬浮于含有１Ｏ　胎牛血　清的ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养基，接种到预先放置有多聚赖　氨酸包被盖玻片的６孔板中，约４　ｈ后可见细胞球贴　附于盖玻片上。取出玻片，ＰＢＳ洗涤３遍，４　多聚甲　醛固定３０　ａｒｉｎ，正常羊血清封闭。兔抗人ＣＤ１３３一抗　４℃孵育过夜，ＦＩＴＣ标记的羊抗兔二抗３７　Ｃ孵育　６０　ｒａｉｎ，荧光显微镜下观察。　２结果　２．１　肿瘤干细胞生长情况　接种细胞１或２　ｄ后，　镜下观察可见大量贴壁生长、形态多样的肿瘤细胞　和体积较大、悬浮生长的单细胞。７　ｄ后可见由２～５　个细胞组成大小不等的悬浮细胞球，１０　ｄ后见细胞　球明显增多，形状规则，由数量不等的圆形细胞组　成。将细胞球吹散后传代培养，大部分７　ｄ后形成新　的细胞球。多形性胶质母细胞瘤组织比间变性星形　细胞瘤组织中肿瘤干细胞出现的时间早数量多。　２．２　肿瘤干细胞的诱导分化　肿瘤干细胞球在含　血清培养基中３～４　ｈ后贴壁生长，２４　ｈ后周围伸出　扁平突起，以后逐渐增多并与周围细胞球的突起交　互成网，７　ｄ左右铺满瓶底。第３天见被吹散的单个　肿瘤干细胞分化为形态不规则的胶质细胞、神经元　样细胞。ＨＥ染色显示细胞核较大，核质比例高，具有　肿瘤细胞的特性。与原肿瘤组织标本的ＨＥ染色比　较，肿瘤干细胞分化后的子代细胞中大部分与胶质　瘤细胞相似。　２．３　干细胞表面ＣＤ１３３的表达　对贴壁４　ｈ的细　胞球应用细胞免疫荧光技术，用ＦＩＴＣ标记的二抗行　抗ＣＤ１３３染色。荧光显微镜下见肿瘤球呈明亮的绿　色荧光。提示该肿瘤干细胞表面表达ＣＤ１３３。　３讨论　脑胶质瘤发病机制不明、疗效欠佳。近年来，有　学者提出了肿瘤干细胞学说＿＿３］。肿瘤干细胞在肿瘤　的生长、侵袭过程中发挥重要作用。我们分别从７例　人脑胶质瘤（ＷＨＯⅢ～Ⅳ级）组织中分离培养得到　了聚集成球生长的肿瘤干细胞，发现肿瘤干细胞在　２　胞，可给肿瘤细胞提供较好的生存环境。　肿瘤干细胞表现出一般干细胞的生物学特性　］，　能够自我更新和增殖。本实验中细胞球吹散后大部　分细胞能够增殖形成新的细胞球，少量细胞不再增　殖逐渐失活变成碎片，在含血清培养基中能够诱导　分化，子代细胞表现为胶质细胞和神经元样细胞，但　是细胞均不成熟，能够表达干细胞表面标志物，免疫　荧光染色呈强阳性。有研究者提出，脑内存在少量正　常的神经干细胞，能够向肿瘤组织中迁移Ｌ５］。这就需　要对从胶质瘤体外培养得到的肿瘤干细胞与正常的　神经干细胞进行鉴别。但是，目前还没有发现肿瘤干　细胞特异性标志物。本实验中将肿瘤干细胞诱导分　化后，子代细胞不具有成熟胶质细胞和神经元特征，　细胞异质性明显并且与原肿瘤组织中的胶质瘤细胞　相似。初步证明了从脑胶质瘤中分离培养出的干细　胞是肿瘤干细胞而不是神经干细胞。　脑肿瘤干细胞的研究尚处于探索阶段，其细胞　的起源、特异性标志物、生物学行为、增殖分化的信　号传导途径等机制还不是很清楚。但是，脑肿瘤干细　胞的研究已成为肿瘤研究领域中的热点之一，通过　进一步研究可发现其特异性抗原，制备携带药物的　抗体可有效的杀死肿瘤的“种子”细胞，肿瘤组织在　失去肿瘤干细胞后，其余肿瘤细胞会逐步凋亡，肿瘤　组织也将随之消退，而且这种消退不易复发。探索肿　瘤干细胞的增殖分化过程中的控制基因和信号途　径，可诱导其向正常的胶质细胞和神经元分化，为研　究脑胶质瘤的发病机制及治疗提供依据。　［参考文献］　［１］Ｂｏｎｎｅｒ　Ｄ，Ｄｉｃｋ　ＪＥ．Ｈｕｍａｎ　ａｃｕｔｅ　ｍｙｅｌｏｉｄ　ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｉｓ　ｏｒｇａｎｉｚｅｄ　ａｓ　ａ　ｈｉｅｒａｒｃｈｙｔｈａｔ　ｏｒｉｇｉｎａｔｅｓ　ｆｒｏｍ　ａ　ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ　ｈｅｍａ￣ｏｐｏｉｅｔｉｃ　ｃｅｌｌ［Ｊ］．　Ｎａｔ　Ｍｅｄ，ｌ　９９７，３（７）：７３０—７３７．　［２］Ｍａｒｘ　Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ　ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｍｕｔａｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｍａｙ　ｓｅｅｄ　ｃａｎｃｅｒＩ－Ｊ］．　Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００３，３０１（５６３８）：ｌ３０８一ｌ３ｌ０．　１－３３　Ｒｅｙａ　Ｔ，Ｍｏｒｒｉｓｏｎ　ＳＪ．Ｃｌａｒｋｅ　ＭＦ，ｅｔ　ａ１．Ｃａｎｃｅｒ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ，ｃａｎｃｅｒ　ａｎｄ　ｃａｎｃｅｒ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２００１，４１４（６８５９）：１０５—１１１．　［４］Ｇａｇｅ　ＦＨ．Ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｎｅｕｒａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００，２８７　（５４５７）：１４３３一ｌ４３８．　［５３　Ｍａｓｓａｒｄ　Ｃ，Ｄｅｕｔｓｃｈ　Ｅ，Ｓｏｒｉａ　ｊｃ．Ｔｕｍｏｕｒ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ—ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．．ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｒ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　Ｄ］．Ａｎｎ　Ｏｎｃｏｌ，２００６，１　７　（１１）：１６２０—１６２４．　（收稿日期：２００７—０３—０３）