第５１卷第６期 ２ ０ １ ５年６月 ｄｏｉ：１０．１ １７０７／ｊ．１００１・７４８８．２０１５０６１２ 林 业 科 学 Ｖｏ１．５１．ＮＯ．６ ＳＣＩＥＮＴＩＡ ＳＩＬＶＡＥ ＳＩＮＩＣＡＥ Ｊｕｎ．，２ ０ １ ５ 一种适于ＰＣＲ和ＬＡＭＰ检测的松木中松材线虫 ＤＮＡ快速提取方法木 苟大平 王曦茁 汪来发 田国忠 朱天辉 郭民伟 雅安６２５０１４；２．中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所 （１四川农业大学林学院国家林业局森林保护学重点实验室 北京１０００９１） 摘要： 【目的】本研究旨在探索快速、简便地直接从病木中提取松材线虫ＤＮＡ的方法。【方法】运用Ｃｈｅｌｅｘ一 １００结合异硫氰酸胍蛋白变性缓冲液建立新的高效快速提取微量木块中线虫ＤＮＡ的方法，并通过普通ＰＣＲ与环 介导等温扩增（ＬＡＭＰ）对提取的ＤＮＡ进行检测验证。【结果】建立了提取线虫ＤＮＡ的新方法Ｃｈｅｌｅｘ一１００法，并对 影响提取效率的Ｃｈｅｌｅｘ．１００浓度、冻融时间和煮沸时间进行了优化。Ｃｈｅｌｅｘ一１００法最适Ｃｈｅｌｅｘ一１００终浓度为１．５％ （Ｗ／Ｖ），最适冻融时间为５ ｍｉｎ，最适煮沸时间为８ ｍｉｎ。与传统的ＣＴＡＢ法和蛋白酶Ｋ法比较，Ｃｈｅｌｅｘ一１００法提取 的ＤＮＡ得率高，相同条件下，该方法提取的ＤＮＡ浓度远远大于常规方法。３种方法的ＯＤ 。比值从大到小依次 为ＣＴＡＢ法＞蛋白酶Ｋ法≥Ｃｈｅｌｅｘ一１００法，Ｃｈｅｌｅｘ－１００法的ＯＤ ： 。值显著低于ＣＴＡＢ法，而略低于或等同于蛋白酶 Ｋ法，但这并不影响对提取的ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增。采用Ｃｈｅｌｅｘ一１００法提取松木中松材线虫的ＤＮＡ，结合常规的 ＰＣＲ和ＬＡＭＰ检测，检测灵敏度高，特异性强，稳定性好；提取的松材线虫ＤＮＡ的７５倍稀释液再稀释３２倍后进行 ＰＣＲ扩增，扩增产物电泳依然有清晰的条带。用新方法提取病木中线虫的ＤＮＡ后进行检测，所有带病松木样品的 检测结果均呈阳性，而健康黑松、马尾松、油松木屑及盘多毛孢样品的检测结果均呈阴性。此外，该提取方法简便 快速，２０ ｒａｉｎ内即可完成整个ＤＮＡ的提取；经济方便，试剂保藏无特殊要求，单个样品提取耗费低于３．５元。【结 论】Ｃｈｅｌｅｘ－ｌ００法是一种快速有效的提取松木中松材线虫ＤＮＡ的方法，此方法结合ＰＣＲ和ＬＡＭＰ检测技术将进一 步提高松材线虫的检测效率、灵敏度和准确性，可为松材线虫的野外检测提供可靠的技术依据。 关键词： 松材线虫；ＤＮＡ提取；Ｃｈｅｌｅｘ一１００ 中图分类号：￥７６３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００１—７４８８（２０１５）０６—０１００—１ｌ Ａ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｒａｐｉｄｌｙ Ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ＤＮＡ Ｏｆ Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｉｎｆｅｓｔｅｄ Ｐｉｎｅ Ｗｏｏｄ ｆｏｒ ＰＣＲ ａｎｄ ＬＡＭＰ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｇｏｕ Ｄａｐｉｎｇ Ｗａｎｇ Ｘｉｚｈｕｏ Ｗａｎｇ Ｌａｉｆａ Ｔｉａｎ Ｇｕｏｚｈｏｎｇ Ｚｈｕ Ｔｉａｎｈｕｉ Ｇｕｏ Ｍｉｎｗｅｉ （１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ，Ｓｉｃｈｕａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｙａ’ａｎ ６２５０１４；２．Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔａｔｅ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔ Ｅｃｏｌｏｇｙ，Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，ＣＡＦ Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００９ １） Ａｂｓｔｒａｃｔ： 【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】Ｉｔ ｉｓ ｃｒｕｃｉａｌ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｉｎｅ ｗｏｏｄ ｎｅｍａｔｏｄｅ（ＰＷＮ）ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｅｃｏｎｏｍｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｎｆｅｓｔｅｄ ｗｏｏｄ ｓａｍｐｌｅｓ ｂｙ Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ．Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ａｉｍｓ ａｔ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｒａｐｉｄｌｙ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ＤＮＡ ｏｆ Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｎｆｅｓｔｅｄ ｐｉｎｅ ｗｏｏｄ．【Ｍｅｔｈｏｄ】Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ，ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｔｏ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｅｘｔｒａｃｔ ｔｈｅ ｎｅｍａｔｏｄｅ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｎｆｅｓｔｅｄ ｗｏｏｄ ｃｈｉｐｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ Ｃｈｅｌｅｘ一１００ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ａｌｋａｌｉｎｅ ｇｕａｎｉｄｉｎｅ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ．Ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ＤＮＡ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）ａｎｄ ｌｏｏｐ—ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）．【Ｒｅｓｕｌｔ】Ｔｈｅ Ｃｈｅｌｅｘ一１００ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｅｘｔｒａｃｔ ｔｈｅ ｎｅｍａｔｏｄｅ ＤＮＡ ａｎｄ ｔｈｅ ｆａｃｔｏｒｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｃｈｅｌｅｘ一１００ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｆｒｅｅｚｉｎｇ ａｎｄ ｂｏｉｌｉｎｇ ｔｉｍｅ，ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｗｅｒｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ Ｃｈｅｌｅｘ一１００ ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｗａｓ １．５％（Ｗ／Ｖ），ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｔｈａｗｉｎｇ ｔｉｍｅ ｗａｓ ５ ｍｉｎ，ａｎｄ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｂｏｉｌｉｎｇ ｔｉｍｅ ｗａｓ ８ ｍｉｎ．Ｔｈｅ ＤＮＡ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｃｈｅｌｅｘ－１００ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ＣＴＡＢ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ ｍｅｔｈｏｄ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｒａｔｉｏｓ ｏｆ ＯＤ ２∞／２８０ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｗａｓ ｉｎ ａ ｄｅｓｃｅｎｄｉｎｇ ｏｒｄｅｒ ｏｆ ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ＞Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ≥Ｃｈｅｌｅｘ一１００ ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ 收稿日期：２０１４—０１—１７；修回日期：２０１４—０６—０８。 基金项目：国家高技术研究发展计划课题（２０１２ＡＡ１０１５０３）。 朱天辉为通讯作者。 第６期 苟大平等：一种适于ＰＣＲ和ＬＡＭＰ检测的松木中松材线虫ＤＮＡ快速提取方法 １０１ ＯＤ２６０／２８ｏ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｃｈｅｌｅｘ一１ ００ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ，ｂｕｔ ｓｌｉｇｈｔｌｙ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ，ｏｒ ｅｑｕａｌ ｔｏ ｔｈａｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ ｍｅｔｈｏｄ，ｈｏｗｅｖｅｒ ｔｈｅ ｌｏｗ ＯＤ２６０／２８０ ｖａｌｕｅ ｄｉｄ ｎｏｔ ａｆｆｅｃｔ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ＤＮＡ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｓｔｒｉｐ ｏｆ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ７５×３２ ｔｉｍｅｓ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｍａｔｏｄｅ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ Ｃｈｅｌｅｘ一１００ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｓｔｉｌｌ ｃｌｅａｒ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｈｓ ｏｆ ＰＣＲ ａｎｄ ＬＡＭＰ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＰＷＮ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｃｈｅｌｅｘ－１００一ｅｘｔｒａｃｔｅｄ—ＤＮＡ ｗａｓ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ｓｐｅｃｉｆｉｃ，ａｎｄ ｓｔａｂｌｅ．Ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｔｈｅ ｅｎｔｉｒｅ ｉｎｆｅｓｔｅｄ ｗｏｏｄ ｓａｍｐｌｅｓ ｂｙ ＰＷＮ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｐｏｓｉｔｉｖｅ，ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅ ｈｅａｌｔｈｙ ｐｉｎｅ ｓａｍｐｌｅｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｐｉｎｕｓ ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ， Ｐ．ｍａｓｓｏｎｉａｎａ，Ｐ．ｔａｂｕｌｉｆｏｒｍ ａｎｄ Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｅ，ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｎｅｇａｔｉｖｅ．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｔｈｅ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｒａｐｉｄ，ｗｉｔｈ ｗｈｉｃｈ ｏｎｌｙ ２０ ｍｉｎｕｔｅｓ ａｒｅ ｎｅｅｄｅｄ ｗｉｔｈｏｕｔ ａｎｙ ｏｔｈｅｒ ｓｐｅｃｉａｌ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ，ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｓｔ ｗａｓ ｏｎｌｙ ３．５ ｙｕａｎ ｐｅｒ ｓａｍｐｌｅ．【Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ】Ｔｈｅ Ｃｈｅｌｅｘ一１００ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｖａｌｕａｂｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ＰＷＮ—ｉｎｆｅｓｔｅｄ ｗｏｏｄ ｓａｍｐｌｅｓ．ｉｔ ｃａｎ ｆｕｒｔｈｅｒ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ．ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｃｙ ｏｆ ｔｈｅ ＰＷＮ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｏｇｅｔｈｅｒ ｗｉｔｈ ＰＣＲ ａｎｄ ＬＡＭＰ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ＰＷＮ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｕｎｄｅｒ ｆｉｅｌｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ；ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；Ｃｈｅｌｅｘ一１００ 松材线虫病（Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）发病迅 够结合影响下一步分析的其他外源物质，并能通过 速，传播范围广，是一种毁灭性的森林病害，被多个 结合金属离子而防止ＤＮＡ降解（陈辉等，２００４），被 国家列为重要森林植物检疫对象。松材线虫的检测 广泛运用于血痕（周月琴等，２００３；巴华杰等， 和鉴定是松材线虫检疫的重要手段。近年来，基于 ２００７；杨电等，２００８）、细菌（钱雪琴等，２００８；胡晓 ＰＣＲ的分子生物学技术（王明旭，２００４；陈凤毛等， 红等，２００８）、真菌（陈吉良等，２０１１；兰茗清等， ２０１２；夏彦飞等，２００９）的实时荧光定量ＰＣＲ（葛建 ２０１２）和放线菌（周双清等，２０１０）等微生物和微小 军等，２００５；王明旭等，２００５；陈凤毛等，２００７； 动物（Ｍｕｓａｐａ ｅｔ ａ１．，２０１３）ＤＮＡ的提取。用Ｃｈｅｌｅｘ一 Ｆｒａｎｔ）ｏｉｓ ｅｔ ａ１．，２００７；郭立新等，２０１１；Ｙｅ ｅｔ ａ１．， １００法提取线虫基因组ＤＮＡ，尤其直接从木块中提 ２０１３）、环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）（Ｋｉｋｕｃｈｉ ｅｔ 取松材线虫ＤＮＡ尚未见报道。本文以Ｃｈｅｌｅｘ １００ ａ１．，２００９）等被越来越广泛地运用于松材线虫的检 法提取或直接从病木中提取松材线虫ＤＮＡ，作为 测和鉴定。获得一定数量和质量的线虫基因组是进 ｒＤＮＡ－ＩＴＳ序列ＰＣＲ扩增和ＬＡＭＰ扩增的模板，以 行准确高效分子检测的前提条件。传统的方法是经 期得到特异性强、明亮清晰的ＰＣＲ检测条带或肉眼 贝尔曼漏斗法从感染松材线虫的木片中分离出线 可直接观察的试验结果，旨在探索建立一种高效、快 虫，再通过ＳＤＳ法、ＣＴＡＢ法或蛋白酶Ｋ法提取线虫 速的提取松材线虫ＤＮＡ的方法。 ＤＮＡ（张奇等，２００８；王姝颖，２００９；Ｆｒａｎｃｏｉｓ ｅｔ ａ１．， ２００７），然而，这些方法较为耗时，不适于野外检测。 １ 材料与方法 因此，建立一种直接从病木中高效提取线虫ＤＮＡ的 １．１试验材料 方法极为必要。Ｔａｋｅｕｃｈｉ等（２００５；２００９）、王新荣 １．１．１ 生物材料 采集１８个地点松材线虫感病 等（２００９）、胡月清（２００６）和Ｋａｎｅｔａｎｉ等（２０１１）分别 植株木样（表１）。选取当年死亡的松树，在伐倒 运用ＣＴＡＢ法、ＳＤＳ酚仿抽提法和蛋白酶Ｋ法直接 树干的基部、中部和树冠基部３个部位截取５ｃｍ 从感病木块或松褐天牛体内提取松材线虫ＤＮＡ。 左右厚度的圆盘放入采样袋中，带回实验室。样 这些方法虽然省去了收集线虫的步骤，但仍存在一 品经贝尔曼漏斗于室温（２５℃）条件下分离２４ ｈ， 些问题：ＣＴＡＢ法和ＳＤＳ法需要经过反复的酚仿抽 进行显微镜下的形态鉴定和ＩＴＳ区、１ ８Ｓ基因测序 提，步骤繁琐，并且ＤＮＡ在转移过程中有损失并伴 鉴定。人工挑取纯化后接种到盘多毛孢 有大片段破碎；而蛋白酶Ｋ法虽然避免了这一问 （Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ）马铃薯葡萄糖琼脂培养 题，却同样需要１ ｈ以上的温育反应，比较耗时，或 基上，４℃冰箱保藏。选取木样树皮以内心材以外 者需要借助昂贵的试剂盒。 ３—５ ｃｍ的圆环１０ ｇ，用斧头劈成１～２ ｍｍ厚度的 Ｃｈｅｌｅｘ一１００是一种可与多价金属离子结合的螯 木片，作为试验的木块。取６ ｇ木块置于室温下采 合型离子交换树脂，其悬液在碱性环境（ｐＨ＝８．０～ 用贝尔曼漏斗法分离，２４ ｈ后，线虫悬液用线虫计 １１）和１００℃的条件下，可导致细胞膜破裂和ＤＮＡ 数皿进行计数，每个样品重复３次，取平均值。剩 变性并释放出来（步嵘等，１９９９）。Ｃｈｅｌｅｘ．１００还能 余４ ｇ木块用于ＤＮＡ提取。 ｌ０２ 林业科学 ５１卷 １．１．２ 化学试剂 ５％（ ）Ｃｈｅｌｅｘ一１００；异硫氰 １０，１００和１ ０００倍的梯度稀释，稀释液进行ＰＣＲ检 酸胍碱性缓冲液：３ ｍｍｏｌ・Ｌ～ＣＨ Ｎ ・ＨＳＣＮ， ５０ ｍｍｏｌ・Ｌ～Ｔｒｉｓ—ＨＣ１（ｐＨ ８．０），２０ ｍｍｏｌ・Ｌ 测以确定最适的Ｃｈｅｌｅｘ－１００浓度。 １．３．２ 冻融时间对ＤＮＡ提取的影响 采用１．３．１ 节中筛选出的Ｃｈｅｌｅｘ．１００最适浓度，设置不同的冻 融时间，即３，４，５和６ ｍｉｎ（冰煮时间相同），提取线 虫ＤＮＡ。ＤＮＡ提取液分别进行１０，１００和１ ０００倍 的梯度稀释，稀释液进行ＰＣＲ检测以确定最佳冻融 时间。 ＥＤＴＡ（ｐＨ ８．０），１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ一１００；ＣＴＡＢ提取缓冲 液：２．０％（Ｗ／Ｖ）ＣＴＡＢ，１．４ ｍｍｏｌ・Ｌ～ＮａＣ１，１００ ｍｍｏｌ・Ｌ～Ｔｒｉｓ—ＨＣ１（ｐＨ ８．０），２０ ｍｍｏｌ・Ｌ ＥＤＴＡ （ｐＨ ８．０），１％（ ）Ｂ一巯基乙醇；ＩＳＯＨＡＩＲ ＤＮＡ 提取试剂盒，购自日本Ｎｉｐｐｏｎ ｇｅｎｅ。 １．２ Ｃｈｅｌｅｘ－１００法的初步建立 吸取５ Ｌ的松材线虫悬浮液（约含线虫５０头， １．３．３ 煮沸时间对ＤＮＡ提取的影响采用之前确 定的Ｃｈｅｌｅｘ．１００最适浓度、最佳冻融时间，设置不同 分离于安徽合肥病死马尾松），放入１．５ ｍＬ离心管 中，加入异硫氰酸胍提取缓冲液（３ ｍｍｏｌ・Ｌ ＣＨ Ｎ ・ＨＳＣＮ，５０ ｍｍｏｌ・Ｌ～Ｔｒｉｓ—ＨＣ１（ｐＨ ８．０），２０ ｍｍｏｌ－Ｌ ＥＤＴＡ（ｐＨ ８．０），１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ一１００）４０ 的煮沸时间，即４，６，８和１０ ｍｉｎ，提取线虫ＤＮＡ。 ＤＮＡ提取液分别进行１０，１００和１ ０００倍的梯度稀 释，稀释液进行ＰＣＲ检测以确定最佳煮沸时间。 １．４ Ｃｈｅｌｅｘ－１００法与ＣＴＡＢ法和蛋白酶Ｋ法的 比较 １．４．１ 提取方法 １）ＣＴＡＢ法 参照Ｙｕｋｏ ｏ，Ｌ，枪头搅拌混匀，冰上放置１０ ｍｉｎ，沸水煮ｌ０ ｍｉｎ，然后加入５％（ 重复３次。 １．３ Ｃｈｅｌｅｘ一１００法的优化 １．３．１ Ｃｈｅｌｅｘ一１００浓度对ＤＮＡ提取的影响 在 ）Ｃｈｅｌｅｘ－１００ ４０ ｔｚＬ，枪头搅 拌混匀，沸水煮１０ ｒａｉｎ，吸取上清液用于ＰＣＲ检测， Ｔａｋｅｕｃｈｉ等（２００５；２００９）的方法。称取含有松材线 虫的木块５０ ｍｇ，置于２ ｍＬ离心管中，加入６００ Ｌ 预热的ＣＴＡＢ提取缓冲液［２．０％（ ）ＣＴＡＢ， ） １．４ ｔｏｏｌ・Ｌ～ＮａＣ１，１００ ｍｍｏｌ・Ｌ～Ｔｒｉｓ．ＨＣＩ（ｐＨ １．２节的基础上，在其他条件不变的情况下，用终浓 度分别为１．０％，１．５％，２．０％和２．５％（Ｗ／Ｖ）的 Ｃｈｅｌｅｘ．１００提取线虫ＤＮＡ。ＤＮＡ提取液分别进行 ８．０），２０ ｍｍｏｌ・Ｌ ＥＤＴＡ（ｐＨ ８．０），１％（ Ｂ一巯基乙醇］漩涡混匀，６０ ｃｌＣ温育３０ ｍｉｎ，加入等 体积的酚氯仿异戊醇（２５：２４：１）抽提，然后４℃下 第６期 苟大平等：一种适于ＰＣＲ和ＬＡＭＰ栓测的松木中松材线虫ＤＮＡ快速提取方法 １０３ １４ ４００ ｒ・ｍｉｎ 离心１５ ｍｉｎ，吸取上清，再加入３／４ 体积的异丙醇，缓慢颠倒混匀，室温静置２０ ｍｉｎ，４ ｃＣ下１４ ４００ ｒ・ｍｉｎ 离心１５ ｍｉｎ，倒掉上清，再用 ７０％的乙醇洗涤２次，待彻底干燥后用１／１０倍的 ＴＥ溶解ＤＮＡ，每个样品重复３次。 ２）蛋白酶Ｋ法 参照日本ＩＳＯＨＡＩＲ ＤＮＡ提取 试剂盒（购自Ｎｉｐｐｏｎ ｇｅｎｅ）说明书以及Ｋａｎｅｔａｎｉ等 （２０１１）的方法：首先在２ ｍＬ离心管中加入１ ｍＬ的 ＤＮＡ提取缓冲液『１００ ｍｍｏｌ・Ｌ～ＮａＣ１、１０ ｍｍｏｌ・Ｌ Ｔｒｉｓ．ＨＣ１（ｐＨ８．０）、１ ｍｍｏｌ・Ｌ ＥＤＴＡ］；再添加４０ Ｌ含有蛋白酶Ｋ的Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ和５０ Ｌ Ｅｎｚｙｍｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＩＳＯＨＡＩＲ Ｎｉｐｐｏｎ ｇｅｎｅ），充分搅拌混匀；在 离心管溶液中加入收集的５０ ｍｇ含有松材线虫的木 片，５５℃孵育２０ ｍｉｎ，然后９４℃孵育１０ ｍｉｎ，吸取 上清液用于ＰＣＲ检测，每个样品重复３次。 ３）Ｃｈｅｌｅｘ－１００法 称取５０ ｍｇ含有线虫的木 块，放人２ ｍＬ离心管中，加入异硫氰酸胍提取缓冲 液［３ ｍｏｌ・Ｌ～ＣＨ Ｎ ・ＨＳＣＮ，５０ ｍｍｏｌ・Ｌ～Ｔｒｉｓ．ＨＣ１ （ｐＨ ８．０），２０ ｍｍｏｌ・Ｌ ＥＤＴＡ（ｐＨ ８．０），１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ一１００］４００ ＩｘＬ，枪头搅拌混匀，冰上放置５ ｍｉｎ，沸水煮５ ｍｉｎ，然后加入５％（ｗ／ｖ）Ｃｈｅｌｅｘ一１００ ２００ Ｌ，枪头搅拌混匀，沸水煮８ ｍｉｎ，吸取上清液用 于ＰＣＲ检测，每个样品重复３次。 １．４．２ ＤＮＡ含量测定和统计分析 应用核酸测定 仪（紫外分光光度仪）在２６０和２８０ ｎｍ下测定ＤＮＡ 样本的ＯＤ： 。、ＯＤ：舳吸光度值，计算所提取样本的纯 度和含量。ＤＮＡ纯度以ＯＤ 。／ＯＤ：。。值为依据； ＤＮＡ含量（ｎｇ・ Ｌ ）＝ＯＤ ６。×５０×稀释倍数。使 用ＳＰＳＳ软件（ＳＰＳＳ１９．０）对数据进行统计分析。数 据采用平均值±标准差表示，组间差异采用方差分 析检验，并采用ｔ检验进行两两比较，Ｐ＜０．０５为差 异显著。 １．５ ＰＣＲ与ＬＡＭＰ验证 １．５．１ 验证方法 １）ＰＣＲ扩增 提取的样品 ＤＮＡ通过普通ＰＣＲ扩增进行验证。引物选用胡月 清等（２００６）、王姝颖（２００９）设计的松材线虫特异引 物，上游弓Ｉ物Ｐ１５５（５ ．ＣＴＡｃＧＴＧｃＴＧＴＴＧＴＴＧＡ ＧＴＴＧＧＣ．３ ），下游引物Ｐ５３８（５ 一ＴＧＧＴＧＣＣＴ ＡＡＣＡＴＴＧＣＧＣＧＡ一３ ）（由北京赛百盛公司合成）。 ２５ Ｌ的ＰＣＲ反应体系为：１２．５ Ｌ的ＰＣＲ ＭＩＸ （购白天根），上下游引物各１ Ｌ，１ Ｌ的ＤＮＡ模 板以及９．５ Ｌ的ｄｄＨ Ｏ。ＰＣＲ反应程序为：９４℃ 预变性３ ｍｉｎ；９４℃变性１ ｍｉｎ，５３ ｃＣ退火３０ Ｓ， ７２℃延伸４５ Ｓ，３５个循环；７２ ｏＣ再延伸１０ ｍｉｎ。取 ４ Ｌ ＰＣＲ扩增产物在１％的琼脂糖凝胶中１４０ Ｖ电 泳３０ ｍｉｎ，紫外灯下观察并拍照。 ２）ＬＡＭＰ扩增 采用Ｃｈｅｌｅｘ．１００法（步骤见 １．４．１节）提取病木块中的松材线虫ＤＮＡ，ＤＮＡ提 取液稀释１０倍后，取２ Ｌ直接用于ＬＡＭＰ反应。 引物选用Ｋｉｋｕｃｈｉ等（２００９）设计的ＩＴＳ区ＬＡＭＰ引 物组，ＬＡＭＰ反应方法参照荣研ｌｏｏｐａｍｐ ＤＮＡ扩增 试剂盒。建立一个２５ Ｌ的反应体系，包含２．５ Ｌ１０×扩增缓冲液，２ ＩｘＬ ｄＮＴＰ（２．５ ｍｍｏ］・Ｌ ）， １ ＩｘＬ Ｔａｑ酶（５Ｕ・ Ｌ一 ），２ Ｌ Ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡ，弓Ｉ物 Ｆ３和Ｂ３各５ ｐｍｏｌ，引物ＦＩＰ和ＢＩＰ各４０ ｐｍｏｌ，引物 ＬｏｏｐＦ ２０ ｐｍｏｌ，ＤＮＡ链置换酶１ Ｌ和１ Ｌ的荧光 检测试剂（Ｅｉｋｅｎ Ｃｈｅｍｉｃａ１）。反应混合液６３℃水浴 ６０ ｍｉｎ，最后８０℃下温育５ ｍｉｎ。ＬＡＭＰ扩增产物的 检测通过反应溶液颜色变化（是否发出荧光）肉眼 观察判断。 １．５．２灵敏性、特异性和稳定性验证 １）灵敏 性验证 采用Ｃｈｅｌｅｘ．１００法、ＣＴＡＢ法和蛋白酶Ｋ 法提取的ＤＮＡ样品通过梯度稀释ＤＮＡ提取液后， 再进行ＰＣＲ来分析ＤＮＡ提取质量和灵敏性。称取 ５０ ｍｇ不含松材线虫的马尾松木块，放人挑有１０条 松材线虫的２ ｍＬ离心管中，涡旋搅拌混匀，采用３ 种提取方法提取线虫ＤＮＡ。提取的ＤＮＡ经核酸测 定仪测定后稀释到相同浓度，然后进行２ 倍梯度稀 释，分别稀释了２，４，８，１６，３２和６４倍的ＤＮＡ提取 液作为ＰＣＲ扩增模板进行ＰＣＲ检测。 ２）特异性验证 采用Ｃｈｅｌｅｘ．１００法提取松材 线虫和拟松材线虫的感病木块（表１）、健康马尾松 （采自安徽合肥）、健康黑松（采自北京）、健康油松 （采自中国林业科学研究院）木块和盘多毛孢（源自 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所） 的ＤＮＡ，ＤＮＡ提取液分别进行ＰＣＲ扩增验证和 ＬＡＭＰ扩增，重复３次。 ３）稳定性验证分别称取５０ ｍｇ健康马尾松、 黑松和油松木块，放人挑有１０条松材线虫的２ ｍＬ 离心管中，涡旋搅拌混匀，采用Ｃｈｅｌｅｘ一１００法提取松 材线ＤＮＡ，ＤＮＡ提取液分别通过ＰＣＲ检测验证和 ＬＡＭＰ扩增，重复１０次。不含松材线虫的健康马尾 松、黑松和油松木块ＤＮＡ提取液作为阴性对照。 ２ 结果与分析 ２．１ Ｃｈｅｌｅｘ－１００法的建立 采用Ｃｈｅｌｅｘ．１００法（１．２节）提取松材线虫悬液 中线虫ＤＮＡ，吸取０．５ Ｌ ＤＮＡ提取液作为模板进 行ＰＣＲ扩增，扩增产物进行１％的琼脂糖凝胶电泳。 采用ＣＴＡＢ法（同１．４．１节）提取２０ Ｌ（约２ ０００ 第６期 苟大平等：一种适于ＰＣＲ和ＬＡＭＰ检测的松木中松材线虫ＤＮＡ快速提取方法 １０９ 且结果稳定（图８，９；表３）。 ＤＮＡ提取是许多分子检测技术的第一步，许多 试验失败的原因可追溯到该步骤，该阶段提取的 ＤＮＡ产量不足、ＤＮＡ质量差、干扰物质多或ＤＮＡ部 分降解等可直接影响检测的结果（Ｙａｘｓｉｅｒ ｅｔ ａ１．， ２０１１）。因此，本文探索建立了一种简便高效的提 取松材线虫悬液和木块中线虫ＤＮＡ的方法即 Ｃｈｅｌｅｘ一１００法，运用该方法提取的线虫ＤＮＡ用于 ＰＣＲ和ＬＡＭＰ等检测时灵敏度高，特异性强，结果 稳定可靠，充分满足普通ＰＣＲ和ＬＡＭＰ等分子检测 需求。此外，本方法所需实验设备简单，试剂药品的 保藏使用对温度也无特殊要求，无需操作人员具有 特别的专业知识，极适合于现场检测以及基层检测 推广。 参 考 文 献 巴华杰，刘冰泉，马 骏，等．２００７．Ｃｈｅｌｅｘ－１００法提取滤纸血痕 ＤＮＡ影响因素的比较．法医学杂志，２３（５）：３４７—３４８． （Ｂａ Ｈ Ｊ，Ｌｉｕ Ｂ Ｑ，Ｍａ Ｊ，ｅｔ ａ１．２００７．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｆａｃｔｏｒｓ ｏｆ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｌｏｏｄｓｔａｉｎ ｏｎ ｔｈｅ ｆｉｌｔｅｒ ｐａｐｅｒ ｗｉｔｈ Ｃｈｅｌｅｘ．１００ ｍｅｔｈｏｄ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２３（５）： ３４７—３４８．［ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ］） 步嵘，王耀平，叶元康．１９９９．以Ｃｈｅｌｅｘ １００为介质抽提ＤＮＡ．中 华病理学杂志，２８（５）：３７９—３８０． （Ｂｕ Ｒ，Ｗａｎｇ Ｙ Ｐ，Ｙｅ Ｙ Ｋ．１９９９．Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｂｙ Ｃｈｅｌｅｘ－１００ ｍｅｔｈｏｄ．Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２８（５）：３７９—３８０．［ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ］） 陈风毛，叶建仁，吴小芹．２００７．松材线虫实时ＰＣＲ检测技术．南 京林业大学学报：自然科学版，３１（４）：１２１—１２４． （Ｃｈｅｎ Ｆ Ｍ，Ｙｅ ｊ Ｒ，Ｗｕ Ｘ Ｑ．２００７．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｏｆ Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ ｕｓｉｎｇ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎａｎｊｉｎｇ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｅｄｉｔｉｏｎ，３１（４）：１２ｌ一１２４． ［ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ］） 陈凤毛，叶建仁，吴小芹，等．２０１２．松材线虫ＳＣＡＲ标记与检测技 术林业科学，４８（３）：８８—９４． （Ｃｈｅｎ Ｆ Ｍ，Ｙｅ Ｊ Ｒ，Ｗｕ Ｘ Ｑ，ｅｔ ａ１．２０１２．ＳＣＡＲ Ｍａｒｋｅｒ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｏｆ Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ．Ｓｃｉｅｎｔｉａ Ｓｉｌｖａｅ Ｓｉｎｉｃａｅ，４８（３）：８８—９４．［ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ］） 陈辉，刘永波，谢庆瑞，等．２００４．有机酚法和Ｃｈｅｌｅｘ １００法提取 不同组织微量ＤＮＡ效果比较．郑州大学学报：医学版，３９（６）： ９８８—９９１． （Ｃｈｅｎ Ｈ，Ｌｉｕ Ｙ Ｂ，Ｘｉｅ Ｑ Ｒ，ｅｔ ａ１．２００４．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐｈｅｎｏｌ／ｃｈｌｏｒｏ ｆｏｒｍ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ｃｈｅｌｅｘ－１００ ｍｅｔｈｏｄ ｏｎ ｍｉｃｒｏ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ： Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，３９（６）：９８８—９９１．［ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ］） 陈吉良，黄小龙，吴安迪，等．２０１１．一种快速高效提取病原真菌 ＤＮＡ作为ＰＣＲ模板的方法．菌物学报，３０（１）：１４７—１４９． （Ｃｈｅｎ Ｊ Ｌ，Ｈａｎｇ Ｘ Ｌ，Ｗｕ Ａ Ｄ，ｅｔ ａ１．２０１１．Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｆｕｎｇｕｓ ＤＮＡ ｆｏｒ ＰＣＲ．Ｍｙｃｏｓｙｓｔｅｍａ，３０（１）： １４７—１４９．［ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ］） 付月君，张志云，柴宝峰．２００３．从棉铃虫体中提取总ＲＮＡ的一种 有效方法．生物技术通报，（５）：４Ｏ一４２． （Ｆｕ Ｙ Ｊ，Ｚｈａｎｇ Ｚ Ｙ，Ｃｈａｉ Ｂ Ｆ．２００３．Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ａｒｍｉｇｅｒａ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ．（５）： ４Ｏ一４２．［ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ］） 葛建军，曹爱新，刘先宝，等．２００５．应用ＴａｑＭａｎ—ＭＧＢ探针进行松 材线虫的实时荧光定量检测技术研究．植物病理学报，３５（６）： ５２—５８． （Ｇｅ Ｊ Ｊ，Ｃａｏ Ａ Ｘ，Ｌｉｕ Ｘ Ｂ，ｅｔ ａ１．２００５．Ｑｕａｎｔｉｔｙ ａｓｓａｙ ｏｆ Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ ｗｉｔｈ ＴａｑＭａｎ—ＭＧＢ ｐｒｏｂｅ． Ａｃｔａ Ｐｈｙｔ０ｐａｔｈｏｌ。ｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ，３５（６）：５２—５８．［ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ］） 郭立新，段维军，顾建锋．２０１１．木质包装中松材线虫的实时荧光 ＰＣＲ检测．植物保护，３７（５）：１２９—１３４． （Ｇｕｏ Ｌ Ｘ，Ｄｕａｎ Ｗ Ｊ，Ｇｕ Ｊ Ｆ．２０１１．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ ｆｒｏｍ ｗｏｏｄｓ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ．Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，３７（５）：１２９—１３４．［ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ］） 胡月清．２００６．枯萎松树线虫种类鉴定及松材线虫检测技术．广州： 华南农业大学硕士学位论文． （Ｈｕ Ｙ Ｑ．２００６．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｍａｔｏｄｅｓ ｉｎ ｄｅａｄ ｏｒ ｄｙｉｎｇ Ｐｉｎｕｓ ｍａｓｓｏｎｉａｎａ ａｎｄ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｏｆ Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ．Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ：ＭＳ ｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｓｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ．［ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ］） 胡晓红，彭惠民，刘昕，等．２００８．ＰＣＲ及Ｒｅａ１．ｔｉｍｅ ＰＣＲ评价细 菌ＤＮＡ提取方法．重庆医科大学学报，３３（２）：１５５—１５９． （Ｈｕ Ｘ Ｈ，Ｐｅｎｇ Ｈ Ｍ，Ｌｉｕ Ｘ，ｅｔ ａ１．２００８．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｂａｃｔｅｒｉａ ｆｏｒ ＰＣＲ ａｎｄ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，３３（２）：１５５—１５９．［ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ］） 兰茗清，刘林，杨静，等．２０１２．直接、快速地从罹病小麦叶片 中提取条锈菌基因组ＤＮＡ的方法．云南农业大学学报，２７ （６）：７９８—８０１，８１３． （Ｌａｎ Ｍ Ｑ，Ｌｉｕ Ｌ，Ｙａｎｇ Ｊ，ｅｔ ａ１．２０１２．Ｄｉｒｅｃｔ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｓｔｒｉｆｉｏｒｍｉｓ ｆ． ｐ．ｔｒｉｔｉｃｉ ｆｒｏｍ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｈｅａｔ ｌｅａｖｅｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｙｕｎｎａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２７（６）：７９８—８０１，８１３． ［ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ］） 李想，杨奇志，张飞雄．２００４．一种小量提取植物总ＲＮＡ的有效 方法．生物技术通报，（２）：４９—５１． （Ｌｉ Ｘ，Ｙａｎｇ Ｑ ｚ，Ｚｈａｎｇ Ｆ Ｘ．２００４．Ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｌａｎｔ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，（２）：４９—５ １．［ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ］） 罗心静．２００３．全血基因组ＤＮＡ的快速提取及其应用 长沙：中南 大学硕士学位论文． （Ｌｕｏ Ｘ Ｊ．２００３．Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｐｉｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ．Ｃｈａｎｇｓｈａ：ＭＳ ｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｓｏｕｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ．［ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ］） 钱雪琴，张 军，沈 芳．２００８．Ｃｈｅｌｅｘ．１００法和碱性裂解法提取细 菌ＤＮＡ的比较．中国卫生检验杂志，１８（８）：１５６５—１５６６， （Ｑｉａｎ ｘ Ｑ，Ｚｈａｎｇ Ｊ，Ｓｈｅｎ Ｆ．２００８．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｂｙ Ｃｈｅｌｅｘ・１００ ａｎｄ ａｌｋａｌｉ ｓｐｌｉｔ．Ｃｈｉｎｓｅｓ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１８（８）：１５６５—１５６６．［ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ］） 王明旭．２００４．松材线虫分子生物学检测技术研究进展．湖南林业 科技，３１（２）：１—３． （Ｗａｎｇ Ｍ Ｘ．２００４．Ｓｔｕｄｙ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｏｆ １１０ 林业科学 ５１卷 ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｎ ｐｉｎｅ ｗｏｏｄ ｎｅｍａｔｏｄｅ， Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ．Ｈｕｎａｎ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３１（２）：１—３． ［ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ］） 王明旭，朱水芳，罗 宽．２００５．松材线虫ｒＤＮＡ—ＩＴＳ２的ＴａｑＭａｎ探 针实时荧光ＰＣＲ检测．林业科学，４１（２）：８２—８５． （Ｗａｎｇ Ｍ Ｘ，Ｚｕ Ｓ Ｆ，Ｌｕｏ Ｋ．２００５．Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ＰＣＲ ｗｉｔｈ ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ ｆｏｒ ｒＤＮＡ－ＩＴＳ２ ｏｆ Ｐｉｎｅ Ｗｏｏｄ Ｎｅｍａｔｏｄｅ （Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）．Ｓｃｉｅｎｔｉａ Ｓｉｌｖａｅ Ｓｉｕｉｃａｅ，４１（２）： ８２—８５．［ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ１） 王永，张莉，兰青阔，等．２００８．Ｃｈｅｌｅｘ一１００快速提取用于转基 因检测ＤＮＡ模板的研究．生物技术通报，（２）：１４３—１４６． （Ｗａｎｇ Ｙ，Ｚｈａｎｇ Ｌ，Ｌａｎ Ｑ Ｋ，ｅｔ ａ１．２００８．Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｒａｐｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｃｒｏｐｓ ｂｙ Ｃｈｅｌｅｘ－１００．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ１ｏｇｙ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，（２）：１４３—１４６．［ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ］） 王姝颖．２００９．几种松树寄生线虫的致病性及其ＩＴＳ序列分析．南 京：南京林业大学硕士学位论文． （Ｗａｎｇ Ｓ Ｙ．２００９．Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｓｅｖｅｒａｌ ｐｉｎｅ ｐａｒａｓｉｔｉｃ ｎｅｍａｔｏｄｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ＩＴＳ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｎａｎｊｉｎｇ：ＭＳ ｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｎａｎｊｉｎｇ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ．［ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ］） 王新荣，朱孝伟，胡月清，等．２００９．松墨天牛携带的松材线虫ＰＣＲ 检测技术．林业科学，４５（７）：７０—７５． （Ｗａｎｇ Ｘ Ｒ，Ｚｈｕ Ｘ Ｗ，Ｈｕ Ｙ Ｑ，ｅｔ ａ１．２００９．Ａ ＰＣＲ—ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ ｆｒｏｍ Ｍｏｎｏｃｈａｍｕｓ ａｈｅｒｎａｔｕｓ． Ｓｃｉｅｎｔｉａ Ｓｉｌｖａｅ Ｓｉｎｉｃａｅ，４５（７）：７０—７５．［ｉｎ Ｅｎｇｌｉｓｈ］） 夏彦飞，李红梅，王暄，等．２００９．病木样本松材线虫ＤＮＡ检测 方法研究．江苏农业科学，（１）：３５—３８． （Ｘｉａ Ｙ Ｆ，Ｌｉ Ｈ Ｍ，Ｗａｎｇ Ｘ，ｅｔ ａ１．２００９．ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｉｎｅ ｗｏｏｄ ｓａｍｐｌｅｓ．Ｊｉａｎｇｓｕ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，（１）：３５—３８．［ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ］） 杨电，刘超，李越，等．２００８．Ｃｈｅｌｅｘ．１００提取生物检材ＤＮＡ 实时ＰＣＲ定量研究中国法医学杂志，２３（１）：２９—３１． （Ｙａｎｇ Ｄ，Ｌｉｕ Ｃ，Ｌｉ Ｙ，ｅｔ ａ１．２００８．Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｑｕａｎｔｉ ｃａｔｉ０ｎａ１ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ Ｃｈｅｌｅｘ－１００ ｍｅｔｈｏｄ．Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２３（１）：２９—３１．［ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ］） 张奇，孙丹，张楚菁，等．２００８．松材线虫鉴定方法的研究与比 较．南开大学学报：自然科学版，４１（５）：４３—４９． （Ｚｈａｎｇ Ｑ，Ｓｕｎ Ｄ，Ｚｈａｎｇ Ｃ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｅｈｕ ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ． Ａｃｔａ Ｓｃｉｅｎｔｉａｒｕｍ Ｎａｔｕｒａｌｉｕｍ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｎａｎｋａｉｅｎｓｉｓ：Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｅｄｉｔｉｏｎ，４１（５）：４３—４９．［ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ］） 周月琴，朱伟，刘志萍，等．２００３．用Ｃｈｅｌｅｘ．１００快速提取微量血 痕中的ＤＮＡ．复旦学报：医学版，３０（４）：３７９—３８０． （Ｚｈｏｕ Ｙ Ｑ，Ｚｈｕ Ｗ，Ｌｉｕ Ｚ Ｐ，ｅｔ ａ１．２００３．Ａ ｑｕｉｃｋ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｂｙ Ｃｈｅｌｅｘ一１００ ｆｒｏｍ ｔｒａｃｅ ｂｌｏｏｄｓｔａｉｎｓ．Ｆｕｄａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，３０（４）：３７９—３８０．［ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ］） 周双清，黄小龙，黄东益，等．２０１０．Ｃｈｅｌｅｘ一１００快速提取放线菌 ＤＮＡ作为ＰＣＲ扩增模板．生物技术通报，２：１２３． （Ｚｈｏｕ Ｓ Ｑ，Ｈｕａｎｇ Ｘ Ｌ，Ｈｕａｎｇ Ｄ Ｙ，ｅｔ ａ１．２０１０．Ａ ｒａｐｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ａｅｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ ｂｙ Ｃｈｅｌｅｘ・１００．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，２：１２３．［ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ］） Ｆｒａｎｃｏｉｓ Ｃ，Ｃａｓｔａｇｎｏｎｅ Ｃ，Ｂｏｏｎｈａｍ Ｎ，ｅｔ ａ１．２００７．Ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ＤＮＡ ａｓ ａ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ＴａｑＭａｎ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｉｎｅｗｏｏｄ ｎｅｍａｔｏｄｅ，Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， ８（６）：８０３～８０９． Ｋａｎｅｔａｎｉ Ｓ，Ｋｉｋｕｅｈｉ Ｔ，Ａｋｉｂａ Ｍ，ｅｔ ａ１．２０１１．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ ｆｒｏｍ ｏｌｄ ｄｉｓｃｓ ｏｆ ｄｅａｄ Ｐｉｎｕｓ ａｒｍａｎｄｉｉ ｖａｒ．ａｍａｍｉａｎａ ｔｒｅｅｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｎｅｗ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ．Ｆｏｒｅｓｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， ４１（５）：３８７—３９１． Ｋｉｋｕｅｈｉ Ｔ，Ａｉｋａｗａ Ｔ，Ｏｅｄａ Ｙ，ｅｔ ａ１．２００９．Ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｐｒｅｃｉｓｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｐｉｎｅｗｏｏｄ ｎｅｍａｔｏｄｅ Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ ｂｙ ｌｏｏｐ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇ，９９（１ ２）：１ ３６５—１ ３６９． Ｍｕｓａｐａ Ｍ，Ｋｕｍｗｅｎｄａ Ｔ，Ｍｋｕｌａｍａ Ｍ，ｅｔ ａ１．２０１３．Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｃｈｅｌｅｘ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｓｐｐ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ，９（７１）：３７９１—３２８１． Ｐｅｒｔ Ｂ，Ｓｅｋｉｚａｗａ Ａ，Ｓａｍｕｒａ Ｏ，ｅｔ ａ１．２０００．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｌｅ ａｎｄ ｆｅｍａｌｅ ｆｅｔａｌ ｉｎ ｍａｔｅｒｎａｌ ｐｌａｓｍａ ｂｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｈｏｒｔ ｔａｎｄｅｍ ｒｅｐｅａｔ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０６（１）：４５—４９． Ｔａｋｅｕｃｈｉ Ｙ，Ｋａｎｚａｋｉ Ｎ，Ｆｕｔａｉ Ｋ．２００５．Ａ ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ－ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｐｉｎｅ ｗｏｏｄ ｎｅｍａｔｏｄｅ，Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ， ｒｆｏｍ ｐｉｎｅ ｗｏｏｄ．Ｎｅｍａｔｏｌｏｇｙ，７（５）：７７５—７８２． Ｔａｋｅｕｅｈｉ Ｙ，Ｆｕｔａｉ Ｋ．２００９．Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｉｎｅ ｗｏｏｄ ｎｅｍａｔｏｄｅ，Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ（Ｓｔｅｉｎｅｒ＆Ｂｕｈｎｅｒ），ｉｎ ｗｏｏｄ ｏｆ Ｐｉｎｕｓ ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ ｗｉｔｈ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ． Ｎｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３９（１）：９—１６． Ｗａｌｓｈ Ｐ Ｓ，Ｍｅｔｚｇｅｒ Ｄ Ａ，Ｈｉｇｕｅｈｉ Ｒ．１９９１．Ｃｈｅｌｅｘ １００ ａｓ ａ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｓｉｍｐｌｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｆｏｒ ＰＣＲ—ｂａｓｅｄ ｔｙｐｉｎｇ ｆｒｏｍ ｆｏｒｅｎｓｉｃ ｍａｔｅｒｉａ１．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１０（４）：５０６—５１３． Ｙａｘｓｉｅｒ Ｄ Ａ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ Ｃ，Ｌｅｄｙ Ｘ Ｌ，ｅｔ ａ１．２０１１．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｐａｒａｆｆｉｎ—ｅｍｂｅｄｄｅｄ ｔｉｓｓｕｅｓ Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｉａ Ａｐｌｉｃａｄａ，２８（１）：４４—４７． Ｙｅ Ｗ Ｍ．Ｇｉｂｌｉｎ—Ｄａｖｉｓ Ｒ Ｍ．２０１３．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｐｉｎｅ—ｗｏｏｄ ｎｅｍａｔｏｄｅ Ｂｕｒｓａｐｈｅ＆ｎｃｈａｓ ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ （Ｎｅｍａｔｏｄａ： ＰａｒａｓｉｔａｐｈｅＩｅｎｃｈｉｄａｅ）． Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ，８（１１）：ｅ７８８０４．１—１４． （责任编辑朱乾坤）
