结直肠癌组织中VEGF-C、VEGFR-3的表达及意义

江建军;裴永彬;刘云;张丽静;赵增仁

【摘 要】Objective: To investigate the relationship between the expressions of vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C), vascular endothelial growth factor receptor-3 (VEGFR-3), lymphangiogenesis and lymph node metastasis in colorectal cancer. Methods: The immunohistochemical SP method was used to detect the expression levels of VEGF-C and VEGFR-3 protein in 50 colorectal cancer tissue samples, 20 colorectal adenoma tissue samples and 20 normal tissue samples. Meanwhile, lymphatic vessel density (LVD) was evaluated with lymphatic endothelium-specific marker, lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor-1 (LYVE-1). Results: The positive rates of VEGF-C and VEGFR-3 proteins were 44% (22/50) and 36% (18/50) in colorectal cancer, respectively. However, VEGF-C and VEGFR-3 expressions were not found in colorectal adenoma tissue and normal tissue samples. There were significant differences in expressions of VEGF-C and VEGFR-3 proteins between patients with and without lymph node metastasis (P < 0.001). There were no significant differences in expressions of VEGF-C and VEGFR-3 proteins between different age, gender, TNM stage,Dukes stage, Broder stage, histological type and invasion depth groups (P > 0.05). The values of LVD were significantly higher in VEGF-C-positive and VEGFR-3-positive groups than those of VEGF-C-negative and VEGFR-3-negative groups (P < 0.001). Multivariate analysis revealed that VEGF -C -positive and VEGFR -3 - positive expressions were independent

factors associated with lymph node metastasis in colorectal cancer. Conclusion: This study suggested that the expression of VEGF-C and VEGFR-3 contributed to the lymphangiogenesis and lymph nodal metastasis in colorectal cancer. VEGF-C and VEGFR-3 may serve as a new target of biological therapy in colorectal cancer.%目的:探讨结直肠癌(CRC)组织中血管内皮生长因子-C(VEGF-C)、血管内皮生长因子受体-3(VEGFR-3)的表达与新生淋巴管及淋巴结转移的关系.方法:选取CRC组织50例,结直肠腺瘤组织20例,正常小肠组织20例,采用免疫组织化学SP法检测样本中VEGF-C、VEGFR-3蛋白的表达,用淋巴管内皮透明质酸受体-1(LYVE-1)特异标记淋巴管计数各样本的淋巴管密度(LVD).结果:VEGF-C、VEGFR-3蛋白在CRC组织中的表达率分别为44％(22/50)、36％(18/50),而在腺瘤组织及正常小肠黏膜组织中均不表达;在有无淋巴结转移的患者中VEGF-C及VEGFR-3蛋白的表达差异均有统计学意义(P＜0.01),不同年龄、性别、TNM分期、Duke分期、Broder分级、肿瘤浸润深度、组织学类型VEGF-C及VEGFR-3蛋白的表达差异均无统计学意义(P＞0.05).在VEGF-C、VEGFR-3 表达阳性CRC组织的LVD高于阴性组(P＜0.001);多因素Logistic回归分析提示VEGF-C和VEGFR-3蛋白阳性表达是CRC发生淋巴结转移的独立危险因素.结论:CRC组织中VEGF-C、VEGFR-3蛋白的高表达与新生淋巴管的形成及发生淋巴结转移有关,VEGF-C、VEGFR-3可能作为CRC患者生物治疗的新靶点.

【期刊名称】《天津医药》 【年(卷),期】2012(040)010 【总页数】6页(P990-994,后插5)

【关键词】结直肠肿瘤;癌;淋巴管;血管内皮生长因子C;受体,血管内皮生长因子;淋巴结转移

【作 者】江建军;裴永彬;刘云;张丽静;赵增仁

【作者单位】050051 河北省人民医院普外科;河北医科大学第一医院普外科;河北医科大学第一医院普外科;河北医科大学第一医院普外科;河北医科大学第一医院普外科

【正文语种】中 文

淋巴结转移是影响结直肠癌（colorectal cancer,CRC）患者预后的最重要因素。研究发现一些促血管生成相关因子也参与了新生淋巴管的生成，而新生淋巴管在恶性肿瘤发生淋巴结转移过程中起到了“桥梁”作用[1]。本文通过研究淋巴管新生相关因子血管内皮生长因子-C（vascular endothelial growth factor-C,VEGF-C）和血管内皮生长因子受体-3（vascular endothelial growth factor receptor-3,VEGFR-3）在结直肠肿瘤蛋白中的表达，探讨其与淋巴管生成及淋巴结转移的关系，以期为制定该类患者的综合治疗方案提供理论依据。 1 资料与方法

1.1 一般资料 选取我院普外科2007年2月—2011年11月手术切除的CRC组织标本50例（CRC组），其中男25例，女25例，平均年龄 （64.38±11.51）岁；按照国际抗癌协会UICC和TNM分期标准，TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期16例，Ⅲ+Ⅳ期34例。Duke分期：A+B期13例，C+D期37例。Broder分级：Ⅰ级15例，Ⅱ级14例，Ⅲ+Ⅳ级21例。病理类型：管状腺癌32例，黏液状腺癌10例，未分化腺癌8例。浸润深度：侵入黏膜层10例，侵入肌层29例，侵透浆膜层11

例。发生淋巴结转移20例，无淋巴结转移转移30例。另取我院病理科同期存档肠镜下切除的腺瘤组织病理蜡块标本20例（腺瘤组），其中男10例，女10例，平均年龄（62.10±14.93）岁。 选取我院行肠切除的非CRC患者正常小肠黏膜组织标本20例作为阴性对照组，其中男 9例，女 11例，平均年龄（65.90±9.49）岁。3组性别（χ2=0.156）、年龄（F=0.516）差异无统计学意义（P ＞ 0.05）。 1.2 试剂与仪器 羊抗人VEGF-C及VEGFR-3多克隆抗体购自北京中杉生物技术有限公司，淋巴管内皮透明质酸受体-1 （lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor-1,LYVE-1）单克隆抗体购自美国Abcam公司（编号ab36993），SP免疫组化试剂盒购自河北博海生物工程有限公司。

1.3 方法 将每例石蜡标本制成4张4 μm厚的切片，1张行HE染色明确病理类型，另3张行免疫组织化学SP法染色，分别检测VEGF-C、VEGFR-3及LYVE-1蛋白的表达。免疫组化具体步骤如下：切片于60℃烤箱放置4 h后脱蜡至水。3%过氧化氢孵育10 min以消除内源性过氧化物酶活性，PBS冲洗5 min×3次。Tris-EDTA抗原修复液修复后晾至室温，PBS冲洗5 min×3次。滴加山羊血清封闭，37℃温箱中孵育10 min。倾去血清，滴加兔抗人、鼠抗人VEGF-C、VEGFR-3、LYVE-1单克隆抗体 （一抗， 工作液浓度分别为1∶150、1∶150、1∶80）4℃过夜，以PBS代替一抗作为阴性对照。弃去一抗，PBS冲洗5 min×3次，滴加生物素化羊抗兔IgG（二抗），37℃温箱中孵育25 min。弃去二抗，PBS冲洗5 min×3次，滴加链霉素抗生物素蛋白标记的过氧化物酶，37℃温箱中孵育25 min，PBS冲洗5 min×3次。DAB显色，室温下控制显色时间及程度。自来水充分冲洗，苏木素复染、盐酸乙醇分化后梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，显微镜下观察结果。所有染色切片均由从事病理学专业5年以上的病理医师单盲阅片，并经两位病理主任医师审核。

1.4 评分及计数规则 首先将染色强度打分：0分为无染色，1分为淡黄色，2分为

棕黄色，3分为棕褐色，染色深浅与背景色相对比。再将阳性细胞所占百分比打分，0分为阴性，1分为阳性细胞≤10%，2分为 11%～50%，3分为 51%～75%，4分为＞75%。染色强度与阳性细胞百分比得分乘积>3分记为免疫反应（+），否则为记为（-）。 根据“热点”理论[2]，在淋巴管表达较集中的区域选取5个高倍视野（×200）分别计数淋巴管数目，然后计算出平均数即为该样本的淋巴管密度（lymphatic vessel density,LVD）。

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行分析，计量资料用±s表示，2组比较应用t检验，多组间比较采用方差分析。计数资料用例（%）表示，组间比较用卡方检验，多因素分析用Logistic回归分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。 2 结果

2.1 结直肠癌组织染色结果 见表1。VEGF-C及VEGFR-3蛋白在是否发生淋巴结转移结直肠癌患者中的表达差异有统计学意义（P＜0.01），而不同发病年龄、性别、TNM分期、Duke分期、Broder分级、肿瘤浸润深度、组织学类型的CRC样本中VEGFC及VEGFR-3蛋白的表达差异无统计学意义 （P＞0.05）。VEGF-C及VEGFR-3蛋白在CRC组织中的表达呈棕黄色，定位于肿瘤细胞胞质中，见图1、2。在肿瘤内部与周边间质中，LYVE-1在阳性表达的淋巴管内皮细胞中呈棕褐色，管腔内不含红细胞，见图3。

Table 1 Correlation of VEGF-C and VEGFR-3 expressions with

clinicopathologic features in patients with colorectal cancer表 1 CRC组织中VEGF-C、VEGFR-3蛋白的表达与临床病理参数之间的关系 例（%）**P<0.01年龄＜60岁≥60岁性别男 女TNM分期Ⅰ+Ⅱ期Ⅲ+Ⅳ期Duke分期A+B期C+D期Broder分级Ⅰ级Ⅱ级Ⅲ+Ⅳ级组织学类型管状腺癌黏液腺癌未分化癌浸润深度黏膜层肌层浆膜及外层淋巴结转移有 无16 34 25 25 16 34 13 37 15 14 21 32 10 8 10 29 11 20 30 VEGF-C蛋白阳性7（43.8）15（44.1）10（40.0）12

（48.0）9（56.3）13（38.2）7（53.8）15（40.5）5（33.3）5（35.7）12（57.1）14（43.8）5（50.0）3（37.5）4（40.0）11（37.9）7（63.6）18（90.0）4（13.3）0.001 0.325 1.433 0.691 2.555 0.284 2.220

28.626**VEGFR-3蛋白阳性6 （37.5）12（35.3）9（36.0）9（36.0）6（37.5）12（35.3）6（46.2）12（32.4）3（20.0）4（28.6）11（52.4）13（40.6）4（40.0）1（12.5）5（50.0）7（24.1）6（54.5）15（75.0）3（10.0）0.023 0.000 0.023 0.786 4.448 4.448 4.264 22.005**n临床参数 χ2 χ2

2.2 结直肠腺瘤及正常黏膜组织染色结果 20例结直肠腺瘤样本及20例正常肠黏膜样本中均未见到VEGF-C、VEGFR-3阳性染色。但可见到LYVE-1阳性表达的淋巴管（黑箭头指示），并且与血管伴行（红箭头指示），见图 4、5。 2.3 VEGF-C、VEGFR-3的表达与 LVD的关系 VEGF-C和VEGFR-3蛋白阳性组的LVD均明显高于阴性组，2组之间差异有统计学意义 （P<0.05），见表 2。 Table 2 Correlation between VEGF-C and VEGFR-3 expressions and LVD in colorectal cancer表 2 CRC组织中 VEGF-C、VEGFR-3蛋白的表达与LVD的关系 （个）*P<0.05VEGF-C蛋白（+）（-）t n 22 18 LVD 9.21±4.14 4.15±2.41 5.09*VEGFR-3蛋白（+）（-）t n 18 32 LVD 10.13±3.89 4.26±2.40 6.61* 2.4 结直肠癌组织中淋巴结转移与临床病理参数之间的关系 在CRC患者中，Broder分级越高发生淋巴结转移的可能性越大；VEGF-C与VEGFR-3蛋白阳性表达的CRC患者较蛋白阴性表达的患者更容易发生淋巴结转移，差异有统计学意义 （P＜0.05或P＜0.01），见表3。以是否发生淋巴结转移为因变量（0=无转移，1=转移），以 Broder分级（1=Ⅰ级，2=Ⅱ级，3=Ⅲ+Ⅳ级）、VEGF-C 和 VEGFR-C蛋白表达情况（两者均以0=阴性，1=阳性）为自变量进行多因素Logistic回归分析，结果发现VEGF-C和VEGFR-C蛋白阳性表达是CRC患者发生淋巴结转移的独立危险因素，见表4。

3 讨论

美国全球癌症统计分析报告显示2008年全球共有超过1200万人被诊断为CRC，其中60.87万人死于该病，CRC已成为女性第二大，男性第三大危险因素[3]。未发生淋巴结转移的CRC患者手术切除治愈率可达90%以上，而已发生淋巴结转移的晚期患者5年生存率降至68%以下 [4]。本研究通过检测CRC组织中新生淋巴管相关因子VEGF-C、VEGFR-3的表达，再一次证实了其与淋巴结转移之间确有密切联系，为CRC患者分子靶向治疗提供依据。

Table 3 The relationship between lymph node metastasis and other clinicopathologic features表3 淋巴结转移与临床病理参数之间的关系 例（%）*P<0.05，**P<0.01性别TNM分期Duke分期Broder分级浸润深度VEFG-C蛋白VEFGR-3蛋白男 女Ⅰ+Ⅱ期Ⅲ+Ⅳ期A+B期C+D期Ⅰ级Ⅱ级Ⅲ+Ⅳ级黏膜层肌层浆膜及外层（+）（-）（+）（-）25 25 16 34 13 37 15 14 21 10 29 11 22 28 18 32有7（28.0）13（52.0）9（56.3）11（32.4）8（61.5）12（32.4）3（20.0）4（28.6）13（61.9）3（30.0）10（34.5）7（63.6）18（81.8）2（7.1）15（83.3）5（15.6）无18（72.0）12（48.0）7（43.7）23（67.6）5（38.5）25（67.6）12（80.0）10（71.4）8（38.1）7（70.0）19（65.5）4（36.4）4（18.2）26（92.9）3（16.7）27（84.4）3.000 2.589 3.396 7.239*0.417 28.626**22.005**临床参数 淋巴结转移n χ2

Table 4 Logistic regression analysis of lymph node metastasis in colorectal cancer表4 淋巴结转移的多因素Logistic回归分析指标VEGF-C VEGFR-3 Broder分级常数项β 4.144 2.971 0.954 1.408 Wald χ2 10.879 5.454 2.278 0.649 P 0.001 0.020 0.131 0.649 OR 62.5 19.6 2.6 4.1 OR95%CI 5.539～728.841 1.639～234.422 0.752～8.955

目前已证实 VEGF-C、VEGF-D与 VEGFR-3结合能通过调节MEK/ERK和

PI3K/Akt途径，促进淋巴细胞的增殖和迁移，促进新生淋巴管生长，并能在肿瘤局部形成微转移灶。本研究显示VEGF-C、VEGFR-3蛋白仅在CRC组织中表达，而在结直肠腺瘤及正常小肠黏膜组织中不表达，在有无淋巴结转移的CRC组织中VEGF-C、VEGFR-3蛋白的表达差异有统计学意义，而其他临床病理参数不影响其表达。Noda等[5]发现VEGF-C的高表达是直肠癌局部复发的独立危险因素，并且还发现VEGF-C蛋白阳性的CRC患者预后相对较差。因此笔者认为CRC肿瘤微环境中VEGF-C、VEGFR-3的高表达是促进淋巴结转移的相关因素。国内也有学者报道在淋巴管内皮细胞中VEGF-C与VEGFR-3相互作用，可增加淋巴管浸润、淋巴结转移的能力，联合检测VEGF-C等因子在CRC患者中的表达对判断预后以及制定治疗策略有重要价值[6]。

目前，国内对CRC患者的临床病理分型主要使用改良的Duke分期及国际TNM分期，发生淋巴结转移者至少是ⅢA或ⅢC期，淋巴结转移越多，分期越高，患者预后越差。本研究利用LYVE-1作为淋巴管内皮特异性标志物，检测到在VEGF-C、VEGFR-3蛋白阳性表达的CRC样本中LVD显著增高，说明VEGF-C、VEGFR-3是促淋巴管生长因子。结直肠腺瘤及正常肠黏膜组织黏膜层腺体周围也可见到LYVE-1特异性标记的淋巴管，间质中还可见到微血管，内含红细胞。在不同种类、不同部位的肿瘤组织中，关于新生淋巴管与淋巴结转移关系的研究结果不尽相同。有研究发现宫颈癌LVD明显高于正常宫颈组织，LVD与淋巴结转移有关，但肿瘤内部比肿瘤周边LVD数量要少，且各自形态也不一样，LVD可作为预后不良的指标[7]。Chen等[8]研究证实LVD是直肠癌局部复发的独立危险因素，LVD越高，预后越差。但也有学者报道在结直肠腺癌组织中LVD与淋巴结转移无关[9]。结直肠腺瘤癌变率与肿瘤大小有关，据统计腺瘤直径＜1 cm，癌变率＜2%；腺瘤直径＞3 cm，癌变率超过40%。家族性腺瘤性息肉病患者50岁以前几乎100%恶变，中位恶变年龄为 36岁 [10]。本研究没有观察到 VEGF-C、VEGFR-3蛋白在结直

肠腺瘤样本中的表达，观察到的淋巴管是否为新生淋巴管，还需进一步研究证实。 关于淋巴管起源主要有两种学说，一是认为淋巴管来自原始静脉上的淋巴管初级囊泡，二是认为淋巴管起源于间质中的淋巴管胚细胞。最近国内学者报道转移相关蛋白1（MTA1）可通过调节CRC细胞中VEGF-C的表达促进新生淋巴管的生成[11]。Su等[12]研究发现激活VEGF-C/VEGFR-3轴可增加CRC肿瘤内部或周边的LVD，有利于淋巴结转移。Duff等[13]研究发现肿瘤边缘VEGF-C与VEGF-D表达失调主要通过新生淋巴管及原有淋巴管生长促进淋巴结转移。最近有人通过干扰VEGF-C mRNA的表达，阻断新生淋巴管生成，从而抑制CRC小鼠模型自身淋巴结转移以及原发肿瘤的生长[14]。笔者推测肿瘤细胞侵入淋巴管的途径可能是：首先在分子水平上通过分泌VEGF-C，在不同时期、不同部位与VEGFR-3结合并激活，引起淋巴管内皮细胞增生、迁移及重塑，其次在组织水平上新生淋巴管的生成为肿瘤细胞进入淋巴管创造了必要的微环境。以上均提示新生淋巴管在CRC进展过程中起到重要作用，有学者提出将其作为可靠的生物学标志及观察预后的指标[15]。尽管新生淋巴管形成的确切机制尚不明确，但鉴于抗血管生成所获得的巨大成功和淋巴管生成与肿瘤转移密切的相关性，有理由相信通过抑制淋巴管的生成抑制淋巴转移将在抗肿瘤治疗中发挥巨大的潜力。 参考文献

【相关文献】

[1]Ramin S,Marc G,Achen A,et al.Lymphatic vessels in cancer metastasis:bridging the gaps[J].Carcinogenesis,2006,27(9):1729-1738.

[2]Ohno M,Nakamura T,Kunimoto Y,et al.Lymphagenesis correlates with expression ofvascularendothelialgrowth factor-C in colorectal cancer[J].Oncol Rep,2003,10(4):939-943. [3]Ahmedin J,Freddie B,David F,et al.Global Cancer Statistics[J].CA Cancer J Clin,2011(61):69-90.

[4]Rozen P,Young G,Levin B,et al.Colorectal Cancer in Clinical Practice[M].London:Taylor and Francis,2006:192pp.

[5]Noda E,Maeda K,Inoue T,et al.Predictive value of vascular endothelial growth factor-C expression for local recurence of rectal carcinoma[J].Oncology,2007,17(2):1327-1331. [6]Zhang CH,Hao L,Wang L,et al.Elevated IGFIR expression regulating VEGF and VEGF-C predicts lymph node metastasis in human colorectal cancer[J].BMC Cancer,2010,10(7):184-195.

[7]Zhang SQ,Yu H,Zhang LL.Clinical implications of increased lymph vessel density in the lymphatic metastasis of early-stage invasive cervical carcinoma[J].BMC Cancer,2009,9(64):100-105.

[8]Chen WR,Chen MG,Liao ZQ,et al.Lymphatic vessel density as predictive marker for the local recurrence of rectal cancer[J].Dis Colon Rectum,2009,52(3):513-519. [9]Naik VR,Jaafar H,Seng CE.Lymphatic channel density in colorectal adenocarcinoma[J].Indian J Pathol Microbiol,2010,53(1):12-14. [10]万德森.结直肠癌[M].北京:北京大学医学出版社,2008:81-91.

[11]Du B,Yang ZY,Zhong XY,et al.Metastasis-associated protein 1 induces VEGF-C and facilitates lymphangiogenesis in colorectal cancer[J].World J Gastroenterol,2011,17(9):1219-1226.

[12]Su JL,Yen CJ,Chen PS,et al.The role of the VEGF-C/VEGFR-3 axis in cancer progression[J].Br J Cancer,2007,96(12):541-545.

[13]Duff SE,Jeziorska M,Kumart S,et al.Lymphatic vessel density,microvessel density and lymphangiogenic growth factor expression in colorectal cancer[J].Colorectal Disease,2007,9(9):793-800.

[14]He XW,Liu T,Yu X,et al.Vascular endothelial growth factor-C siRNA delivered via calcium carbonate nanoparticle effectively Inhibits lymphangiogenesis and growth of colorectal cancer in vivo[J].Cancer Gene Ther,2009,24(2):249-259.

[15]Masayuki N,Subramaniam R,Omar MR,et al.Lymphangiogenesis:A new player in cancer progression[J].World J Gastroenterol,2010,16(32):4003-4012.