维普资讯 http://www.cqvip.com ２５２ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ中国人兽共 ｏｆ患 Ｚｏｏｎｏｓｅｓ 病学报 ２００７，２３（３） 文章编号：１００２—２６９４（２００７）０３—０２５２—０４ ３种结核分枝杆菌复活促进因子基因的克隆、 原核表达与纯化鉴定 徐蕾，王瑜伟，朱道银 摘要：目的构建结核分枝杆菌复活促进因子Ｂ（ｒｐｆＢ）、Ｄ（ｒｐｆＤ）、Ｅ（ｒｐｆＥ）的原核表达质粒，并在大肠杆菌中表达和 纯化。方法 采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）以结核分枝杆菌Ｈ３７Ｒｖ基因组ＤＮＡ为模板扩增出ｒｐｆＢ（１ ｏ８９ｂｐ），ｒｐｆＤ（４６５ｂｐ）和 ｒｐｆＥ片段（５１９ｂｐ），并连接在ｐＥＴ３２ａ（＋）载体上，重组质粒用酶切和ＤＮＡ测序鉴定后，转化到大肠杆菌ＢＬ２１中，经ＩＰＴＧ 诱导表达了ｒｐｙＢ，ｒｐｆＤ和ｒｐｆＥ ３种蛋白；利用Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ鉴定重组蛋白后，纯化目的蛋白。结果 双酶切鉴定所切下的 片段大小与预计相符，测序结果与文献报道一致。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ鉴定均发现分别在６１ｋＤａ、３９ｋＤａ、 ４１ｋＤａ处有特异性蛋白条带。结论 成功构建了３种重组表达质粒ｐＥＴ３２ａ（＋）一ｒｐｆＢｖ、ｐＥＴ３２ａ（＋）一ｒｐｆＤｖ、ｐＥＴ３２ａ（＋）一 ｒｐｆＥｖ，并获得了３种高纯度的重组蛋白，为以后的深入研究奠定了基础。 关键词：结核分枝杆菌；ｒｐ，；克隆；表达；纯化 中图分类号：Ｒ３７８．９１ 文献标识码：Ａ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｉｏｎ－ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ ｆｒｏｍ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＸＵ Ｌｅｉ，ＷＡＮＧ Ｙｕ—ｗｅｉ，ＺＨＵ Ｄａｏ—ｙｉｎｇ （Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ ４０００１６，Ｃｈｉｎａ） ＡＢＳＴＲＡＣＴ：Ｔｏ ｅｘｐｒｅｓｓ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｙ ｔｈｅ ｇｅｎｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｉｏｎ－ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ Ｂ（ｒｐｆＢ），Ｄ（ｒｐｆＤ），Ｅ（ｒｐｆＥ）ｏｆ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，ｔｈｅｓｅ ｇｅｎｅｓ ｗｅｒｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ＰＣＲ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３ ７Ｒｖ ｓｔｒａｉｎ，ａｎｄ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｐＥＴ３２ａ（＋）ｖｅｃｔｏｒ，ｔｈｅｎ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ Ｅ ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０．Ａｆｔｅｒ ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ｂｙ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ａｎｄ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ。 ｔｈｅ ｃｏｎａｔｒｕｃｔｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２ １ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｅｒｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｆｔｅｒ ｉｎ— ｄｕｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＩＰＴＧ．Ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｇｈｙ．Ｔｈｅ ｅｘ— ｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ３ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ＲｐｆＢ，ＲｐｆＤ ａｎｄ ＲｐｆＥ ｗｅｒｅ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｐｕｒｉｔｙ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ＷＯＵｌｄ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｕｔｕｒｅ ｓｔｕｄ— ｌｅａ ｆｏｒ ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｉｏｎ－ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ． ＫＥＹ ＷＯＲＤＳ：Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ；ｒｐｆ；ｃｌｏｎｅ；ｅｘｐｅｓｓｉｏｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ 结核分枝杆菌（ＭＴＢ）感染机体后可在巨噬细 定的联系。我们克隆表达并纯化该家族的３个蛋 胞内长期存活而不被机体的免疫系统清除，维持相 白，力图了解ｒｐｆ与ＭＴＢ进入持留状态和在持留 对静止而又具有活化潜能的持留（ｐｅｒｓｉｓｔ）状态，造 状态下活化是否相关。 ，进而为寻找抑制其进入持 成宿主的潜伏感染ｎ 。目前，全球约三分之一的人 留状态或杀灭持留菌的方法奠定基础。 口有ＭＴＢ的潜伏感染，这也是结核病化疗疗程过 １材料和方法 长和效果不佳的主要原因。结核病细菌学复发机制 １．１ 材料 的研究表明，结核病复发的根源在于治疗开始时存 １．１．１ 质粒与菌株结核分枝杆菌菌株Ｈ３７Ｒｖ、大 在或治疗过程中产生的持留菌∞ 。 肠杆菌Ｔｏｐｌ０株和ＢＬ２１株、表达质粒ｐＥＴ３２ａ 结核分枝杆菌复活促进因子（Ｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｉｏｎ－ （＋）均为本实验室保存。 ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ，ｒｐｆ）是拥有５个成员的蛋白家 １．１．２主要试剂ＴａｑＰｌｕｓ ＤＮＡ聚合酶、Ｔ４ ＤＮＡ 族。研究表明，它们与ＭＴＢ尤其是处于生长迟缓 通讯作者ｌ朱逆银，Ｅｍａｉｌｌｉｍｍｚｈｕ＠ｔｏｍ．ｃｏｍ 期的ＭＴＢ的增殖相关［３］，推测其与持留菌也有一 作者单位：重庆医科大学微生曲学与免疫学教研室。重庆４０００１６ 维普资讯 http://www.cqvip.com ２００７，２３（３） Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｚｏｏｎｏｓｅｓ 中国人兽共患病学报 ２５３ 连接酶、限制性内切酶ＢａｍＨ Ｉ和ＨｉｎｄＩＩＩ购自 ＴａＫａＲａ公司；细菌基因组提取试剂盒、质粒纯化抽 提试剂盒、胶回收和ＰＣＲ产物纯化试剂盒均购自 上海华舜生物公司。异丙基硫代一Ｂ—Ｄ－半乳糖苷 （ＩＰＴＧ）为Ｓｉｇｍａ公司产品。抗Ｈｉｓ抗体和Ｎｉ— ＮＴＡ亲和纯化试剂盒购自Ｎｏｖａｇｅｎ公司。ＰＣＲ引 物序列由上海生物工程公司合成，重组质粒上目的 基因的序列测定由上海生物工程公司完成。 １．２方法 １．２．１引物的设计根据ＧｅｎＢａｎｋ报道的ｒｐｆＢ、 ｒｐｆＤ、ｒｐｆＥ的基因序列分别设计３对引物，并引入 酶切位点，酶切位点前均加入保护性碱基。引物序 列如下（小写部分为酶切位点）： ｒｐｆＢ上游引物（Ｐ１）：５ ＣＡＡｇｇａｔｃｃＡＴＧＴＴ— ＧＣＧＣＣＴＧＧＴＡＧＴＣＧＧＴＧ（’＿３， 下游引物（Ｐ２）：５’一ＴＡＴａａｇｃｔｔＴＣＡＧＣＧＣＧ— ＣＡＣＣＣＧＣＴＣＧＴ一３’ ｒｐｆＤ上游引物（Ｐ３）：５ ＧＴＡｇｇａｔｃｃＡＴＧＡ－ ＣＡＣＣＧＧＧＴＴＴＧＣＴＴＡＣＴ一３’ 下游引物（Ｐ４）：５’一ＧＴＴａａｇｃｔｔＴＣＡＡＴＣＧＴＣ— ＣＣＴＧＣＴＣＣ（、．３， ｆＥ上游引物（Ｐ５）：５’－ＣＡＴｇｇａｔｃｃＴＴ— ＧＡＡＧＡＡＣＧＣＣＣＧＴＡＣＧＡＣＧＣＴＣＡＴＣＧＣ一３， 下游引物（Ｐ６）：５，．ＡＴＡＴａａｇｃｔｔＴＣＡＧＣ— ＡＧ一３’ Ｐ１、Ｐ３、Ｐ５引入ＢａｍＨＩ酶切位点，Ｐ２、Ｐ４、Ｐ６ 引入ＨｉｎｄＩＩＩ酶切位点。 １．２．２结核分枝杆菌基因组ＤＮＡ的提取 取少 量分枝杆菌Ｈ３７Ｒｖ株接种罗氏培养基中，３７。Ｃ培 养４周。按细菌基因组提取试剂盒说明书进行基因 组ＤＮＡ的提取。 １．２．３ ｒｐｆＢ、ｒｐｆＤ、ｒｐｆＥ ３种基因的克隆及表达 质粒的构建基因的扩增、克隆方法参见分子克隆 第３版。３种ＰＣＲ产物回收后，经ＢａｍＨＩ和 Ｈ ，ｌｄｌＩＩ双酶切并胶回收，分别与用同样酶消化的 质粒ｐＥＴ３２ａ（＋）连接。 １．２．４重组质粒的鉴定 ３种连接产物经分别转 化Ｔｏｐｌ０后，挑选单菌落提质粒为模板，按上述体 系做ＰＣＲ和电泳鉴定；阳性克隆再用ＢａｍＨＩ和 ＨｉｎｄｌＩＩ双酶切重组质粒，以琼脂糖凝胶电泳检测 鉴定；最后进行ＤＮＡ测序分析。 １．２．５重组质粒的表达 将测序正确的重组质粒 转化大肠杆菌ＢＬ２１株中，分别挑取阳性克隆接种 于２ ｍｌ含氨苄青霉素的ＬＢ培养液中，３７￣Ｃ振荡过 夜，分别取ｉ００ ｌ菌液加到加入２ ｍｌ含氨苄青霉素 的ＬＢ培养液中，３７℃振荡培养２～３ ｈ，再加入 ＩＰＴＧ使其终浓度为２ ｍｍｏｌ／Ｌ，诱导４ ｈ，进行１２ ＳＤＳ—ＰＡＧＥ，考马斯亮蓝染色，并通过凝胶薄层扫描 测定其表达量。 １．２．６表达产物的鉴定 按上述方法诱导的３种 重组蛋白表达后进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，再将电泳凝胶上 的蛋白转移至ＰＶＤＦ膜上，用５ 的脱脂奶封闭２ ｈ，加抗组氨酸的特异性单抗４℃孵育过夜，以０．２ ｍｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳＴ洗涤后，加羊抗鼠ＩｇＧ室温作用１ ｈ，以ＤＡＢ显色观察结果。 １．２．７重组蛋白表达形式的分析按前述方法诱 导重组蛋白的表达并收集菌体，以３ ｍｌ／ｇ湿菌比例 加入超声缓冲液重悬，用３６ 强度的超声在冰浴中 碎菌（功率３６０Ｗ，总时间３０ ｍｉｎ，其中超声破碎３ｓ， 间隔３ｓ），离心后分别收集上清和沉淀（即包涵体）， 以ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析重组蛋白表达形式。 １．２．８ ３种重组蛋白的纯化 将上述制备好的包 涵体重悬Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（０．５ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，２Ｏ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ—Ｃｌ，５ ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑，８ ｍｏｌ／Ｌ尿素， ｐＨ７．９）中，冰浴搅拌１ｈ，使包涵体完全溶解；离心 后将上清加入到Ｎｉ—ＮＴＡ ａｇａｒｏｓｅ柱上，并分别用 Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｗａｓｈｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（０．５ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣ１， ２０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－Ｃ１，６０ ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑，８ ｍｏｌ／Ｌ尿 素，ＰＨ７．９），Ｅｌｕｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（０．５ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ。２Ｏ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ—Ｃ１，１ ｍｏｌ／Ｌ咪唑，８ ｍｏｌ／Ｌ尿素， ｐＨ７．９）对目的蛋白进行洗脱，分步收集。取各管收 集液１５ ｌ进行ＳＤＳ—ＰＡＧＥ鉴定，将含有目的蛋白 的各管合并。 １．２．９表达蛋白的复性 采取逐步降低尿素浓度 的方法，除去蛋白溶液中的尿素，使变性的蛋白在此 过程中自然复性，在４℃下分别用含６ ｍｏｌ／Ｌ、４ ｍｏｌ／Ｌ、２ ｍｏｌ／Ｌ、１ ｍｏｌ／Ｌ尿素的缓冲液进行梯度 透析４ｈ，透析完毕将蛋白质溶液置于一２０￣Ｃ保存。 ２ 结 果 ２．１ ＰＣＲ扩增产物琼脂糖电泳结果通过设计的 ＰＣＲ引物，从结核分枝杆菌Ｈ３７Ｒｖ基因组ＤＮＡ中 扩增出ｒｐｆＢ、ｒｐｆＤ、ｒｐｆＥ ３种基因片段分别是 １ ０８９ ｂｐ、４６５ ｂｐ、５１９ ｂｐ，与预期值大小相符，见 图１。 ２．２ ３种重组质粒双酶切电泳检测结果 ｒｐｆＢ， ｒｐｆＤ和ｒｐｆＥ基因片段分别与ｐＥＴ３２ａ（＋）ｖｅｃｔｏｒ 连接后的重组质粒命名为ｐＥＴ３２ａ（＋）一ｒｐｆＢｖ、 ｐＥＴ３２ａ（＋）－ｒｐｆＤｖ、ｐＥＴ３２ａ（＋）一ｒｐｆＥｖ。以重组 质粒为模板进行ＰＣＲ，并挑选阳性克隆进行 ＢａｍＨＩ单酶切和ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄｌＩＩ双酶切，电泳图 维普资讯 http://www.cqvip.com ２５４ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊ ０ｕｒ【】ａ１ ｏｆ Ｚｏｏｎｏｓ￣ ：１ａ国人兽共患病学报 ２Ｏ０７．２３（３） 中可看到３种重组质粒单酶切后分别产生６ ９８９ ｂｐ、６ ４ｌ９ ｂｐ、６ ３６５ ｂｐ大小的线性片段，双酶切后 则分别产生１ ０８９ ｂｐ、５１９ ｂｐ、４６５ ｂｐ的小片段和５ ９００ ｂｐ的大片段（与ｐＥＴ３２ａ（１＿）空载大小相符）． 见图２。 诱导分别感染了ｐＥ Ｆ３２ａ（＋）一ｒｐｆＢｖ、ｐＥＴ３２ａ（一）一 ｒｐｆＤｖ、ｐＥ １＂３２ａ（十）ｒｐｆＥｖ的Ｂｌ ２１菌４ １１后，进行 ｌ２ ＳＤＳ—ＰＡＧＥ，发现在６ｉ．４ ｋＤａ、４】．０ ｋＤａ、３９．０ ｋＤａ处可见表达的新蛋白带（ｐＥＴ硫氧还蛋白约２２ ｋＤａ），同预计大小相吻合，见图３ 经凝胶薄层扫 描，测得重组ｒｐｆＢ、ｒｐｆＤ、ｒｐｆＥ表达带的蛋白分 别占菌体总蛋白量的３１ 、２９ 、２９．３ 。将表达 蛋白与抗组氨酸的特异性单克隆抗体做免疫印迹， 发现６１．４ ｋＤａ、４１．０ ｋＤａ、３９．０ ｋＤａ处各有一条带， 见图４ 对表达蛋白的可溶性分析证明．３种融合表 达产物主要都以不可溶的包涵体形式存在。 围１ ＰＣＲ扩增的Ｒｐｌｌｌ、ＲｐｆＤ、ＲｐｆＥ基因 Ｆｉｇ．１ ＰＣＲ ｐｒｏｄｌａｃｔｓ ｏｆ ＲｐｆＢ、ＲｐｆＤ、ＲｐＦＥ ｇｅｎｅ １：ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ（ＤＬ２０００）｝ ２—３：ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ＲｐｆＥ ４．５．ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ＲｐｆＤ ６．７ｊＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ＲｐｆＢ ８：ｃｏｎｔｒｏ【（一）Ｓ 图３ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴定诱导表达的３种重组蛋白 Ｆｉｇ．３ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉ￣ ｌ ２：ＢＬ２１ ｗｉｔｈ ｐＥＴ３２ａ 一）一Ｒｐ［ｍｖ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＩＰＴＧｆ。ｒ ４ｈ ３－－４：ＢＬ２１ ｗｉｔｈ ｐＥＦ３２ａ 卜）一ＲｐｆＥｖ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＩＰＴＧｆｏｒ ４ｈ ５：ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒ（ｆｒｏｍ ｔｌＰ １ｏ ｄｏｗｎ）：９７．４ｋＤａ，６６． ２ｋＤａ，４３．０ｋＤａ，３１．０ｋＤａ．２２．０ｋＤａ．１４．０ｋＤａ ６／ｌ０：ＢＩ ２ｌ ｉｎｄｕｃｅｄ ｈｙ ＩＰＴＧ ｆｏｒ ４ｈ ７：ＢＬ２１ ｗｈｈ ｐＥ］‘３２ａ（＋）ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＩＰＴＧ ｆｏｒ ４ｈ ８—９：ＢＬ２１ ｗｉｔｈ ｐＥＴ３２ａ（＋）～ＲｐｆＢｖ ｉｎｄｕｖｅｄ ｂｙ 圈２ ３种重组质粒的酶切鉴定 Ｆｉｇ．２ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｂｙ ｅｎ． ｄｏｅｎｚｙｍｓｅ １ＰＴＧｆｏｒ Ｊ，ｈ ｌ【ｐＥＴ３２ａ（十）ＲｐｆＢｖ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｂｙ ＢａｍＨＩ ２ ｉ ｐＥＴ３２ａ（＋）一ＲｐｆＤｖ ｄｉｇｅｓｌｅｄ ｂｙ ＢａｍＨ１ ３；ｐＥＴ３２ａ（＋）一ＲｐｆＥｖ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｂｙ Ｂ ｍＨＩ ４／９：ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ【ＤＬ２０００） ５／ｉ０ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ（１５０００） ６ ｐＥＴ３２ａ（＋）一ＲｐｆＢｖ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｂｙ Ｂ口 ＨＩ ａｎｄ ＨｉｎｄｌｌＩ ７．ｐＥＴ３２ａ（４－）ＲｐｆＦｖ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｂｙ ＢａｍＨ１ ａＩ１ｄ ＨｉｎｄＩＩＩ ８．ｐＮＩ ２ａ（＋）一Ｒｐｆ［Ｎ，ｄｉｇｅｓｔｏｄ ｂｙ Ｂ４ Ｈｌ ａｎｄ Ｈｉ ＴｄＵＩ ２．３ 重组质粒的测序鉴定 将３种表达质粒 ｐＥＴ３２ａ（一）ｒｐｆＢｖ、ｐＥＴ３２ａ（＋）ｒｐｆＤｖ、ｐＥＴ３２ａ 图４ ３种重组蛋白的Ｗ￣：ｔｅｒｎ—ｈｌｏｔ鉴定 Ｆｉｇ．４ Ｗ幅ｔｅｒ ｂｌ０ｌ ＦＥｓｕＩｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ （一）一ｒｐｆＥｖ样品进上海生物工程公司测序，双向测 序结果显示：测序结果分别与ｎｃｂｉ上ｒｐｆＢ、ｒｐｆＤ、 ｒｐｆＥ的编码序列比较完全一致 １ｊＢＬ２ Ｌ ｗｉｔｈ ｐＥ＇ｌ ３２ａ（一）一ＲｐｆＥｖ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＩＰＴＧ ２：ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒ ３｛ＢＬ２１ ｗｉｔｈ ｐＥＴ３２ａ（＋ 一ＲｐｆＢｖ ｉｎｄｕｃｅｄ ｈｙ ＩＰＴＧ ２．４重组质粒的表达及其产物的鉴定用ＩＰＴＧ ４：ＢＬ２１ ｗｉｔｈ ｐＥＴ３２ａ（上）－－ＲｐｆＤｖ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＩＰＴＧ 维普资讯 http://www.cqvip.com Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａ１ ｏｆ Ｚｏｏｎ０ｓｅｓ 中国人兽共患病学报 ２５５ ２．５表达蛋白的亲和层析纯化和复性 从重组菌 ３讨论 中制备的包涵体经洗涤溶解后．上到Ｎｉ—ＮＴＡ金属 鳌合亲和层析柱中，洗脱下目的蛋白经ｌ２ ＳＤＳ ＰＡＧＥ证明了这种纯化方法的有效性．见图５—７， 薄层扫描分析重组蛋白纯度均可达９０ 以上 将 分步收集液中吉目的蛋白的各营台并，缓慢逐步降 低透析液中尿素的浓度，使变性的蛋白在此过程中 Ｏｖｔｉｎａ等首先发现生长繁殖期的藤黄微球菌 分泌的一种蛋白质能使处于休眠期的同类菌复苏并 在培养基上形成菌落，故把该蛋白质称为“复苏促进 因子” ，ｐｒ也可以刺激其它几种富含Ｇ／Ｃ的革兰 阳性菌的生长，包括鸟分枝杆菌．母牛分枝杆菌 （ＢＣＧ），堪萨斯分枝杆菌，耻垢分枝杆菌和Ｍ＇Ｉ、Ｂ： 同时又发现这些革兰阳性菌有７个基因的预计产物 自然复性，复性后的目的蛋白经冻干保存，以便于进 步的研究工作。 与上述Ｔｐｆ的 一末端域十分相似，其中５个基因来 自ＭＴＢ，它们都能分泌砷，的同源蛋白，而这些蛋 白具有呻，相似的功能，以此类推把这些由结核杆 菌分泌的同源蛋白称为“结核分枝杆菌复活促进因 子家族”“ 。 该家族ｊ个成员分别是ｒｐ，Ａ、ｒｐ，＿Ｂ、印，ｃ、 ｒｐｆＤ和ｒｐ ，其中ｒｐｆＢ、ｒｐｆＤ和ｒｐｆＥ有具有 很高的特异免疫应答能力和很好的免疫原性。 图５ ｒｐｆＢ蛋白纯化后的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析 Ｆｉｇ．５ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ａｎＭ￣＇ｓｉｓ． ｏｆ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｌ ｐ￣ｔｅｍ Ｖｌａｄｉｍｉｒ等 将ｒｐｆＥ蛋白（含有ｒｐｆ家族典型的 同源保守区）接种Ｃ５７ＢＬ／６小鼠后．再用ＭＴＢ毒 ３：ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒ ５—８：ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｆｔｅｒ ｐｕｒｉｆｉｅｄ 株（Ｈ３７Ｒｖ）攻击＋发现这些小鼠比未接种小鼠肺和 脾的荷菌量减少，存活时间也延长，对机体起保护作 用。最近报道 ，ｒｐｆｓ的表达可能调节ＭＴＢ的 ＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿●＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿●。。。。。。。。。。。。。。。。＿。＿ —。’’。。。。。。。。。。。—— ｋ ． Ｌ１ １ ｌ诵２ １ Ｉ１ 增殖，而且ｒ∞佃基因敲除的ＭＴＢ株在慢性结核病 小鼠模型中存在活化缺陷｛可见它与结核潜伏感染 的活化有着密切的联系。 在本试验中，我们选择的ｐＥＴ３２ａ（一）是一种 融合表达质粒，其特点除了能够在外源蛋白Ｎ端编 码６个组氨酸残基外，还能够编码硫氧还原蛋白 【．．． — ．． ．．．．．．．．．．．．．．．一图６ ｒｐｆＤ蛋白纯化后的ＳＤＳ—ＰＡＧＥ分析 Ｆｉｇ．６ ＳＤ￣ＰＡＧＥ ｏｆ ＲｐｆＤ ａｆｌｅｒ ｐｕｒｉｄｉｅｄ （Ｔｒｘ）与外源蛋白融合表达，使重组蛋白分子量变 大，不易被细菌内的蛋白酶阵解，从而提高表达产物 的稳定性；同时，外源蛋白与 Ｆｒｘ之间还具有肠激 酶和凝血酶的识别位点，可 方便的切下Ｔｒｘ，使重 组蛋白的构象及活性与天然目的蛋白更接近，本研 究中还利用抗组氨酸的特异性单抗与重组蛋白做免 疫印记武验，对表达的目的噩白进行初步鉴定 同 ｌ一４：ｅｌｕｔｅ ｓｏ】ｕｔｉｏｎ（Ｅ１一Ｅ４） ５：ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒ ８ 时，我们还利用重组蛋白上的组氨酸标签可以和 Ｎｉ Ｎ ＦＡ亲和层析柱上的金属镍结台的原理，使目 的蛋白在流经柱床时被特异地吸附，再利用咪唑置 换，洗脱下目的蛋白，从而对重组蛋白进行纯化 本研究掏建了编码ＭＴＢ Ｈ３７Ｒｖ株砷厂Ｂ、 ｒｐｆＤ、ｒｐｆＥ ３种蛋白的重组表达质粒，并获得了较 高纯度的蛋白。借助它们可以探讨ｒｐｆ蛋白家族 田７ ｒｐｆＥ蛋白纯化后ＳＤ￣ＰＡＧＥ分析 Ｆｉｇ．７ ＳＤ￣ＰＡＧＥ ａｎｎ ｂ ｏｆ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ 与结核持留菌及潜伏感染活化之间的关系，为新型 抗结核药的研制和新的结核病治疗方案的制定奠定 基础 （下转第２５８页） ５—７：ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｆｔｅｒ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ８：ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒ 维普资讯 http://www.cqvip.com ２５８ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ中国人兽共 ｏｆ Ｚｏｏｎｏｓｅｓ 患病学报 ２００７，２３（３） 蛋白（或者这些蛋白中的某个或某几个成分）有可能 综上所述，我们认为，结核分枝杆菌Ｒｖ２４５０蛋 会被宿主的免疫系统所识别，而作为亚单位疫苗的 白有可能作为基因工程疫苗或亚单位疫苗的候选组 备选组分。 分，值得进一步深入研究。 机体抗结核杆菌的免疫，主要依赖于Ｔ细胞及 参考文献： 其分泌的相关细胞因子的协助。 。Ｔｈｌ型细胞以分 Ｃ１３Ｄｙｅ Ｃ，Ｗａｔｔ ＣＪ，Ｂｌｅｅｄ Ｄ．Ｌｏｗ ａｃｃｅｓｓ ｔｏ ａ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｔｈｅｒａ— 泌ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＦＮ一了和ＴＮＦ－ｅ为特征，主要参与 Ｐｙ：ａ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ１ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｃｏｎｔｒｏ１ ＣＪ］．Ｂｕｌ１ Ｗｏｒ１ｄ Ｈｅａｈｈ Ｏｒｇａｎ，２００２，８０（６）：４３７—４４４． 细胞介导的免疫应答，在抵御细胞内致病因子方面 Ｃ２３ Ｆｉｎｅ ＰＥ．Ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ １３（３Ｇ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｄ ｆｏｒ 起着重要作用。而Ｔｈ２型细胞以分泌ＩＬ＿４、ＩＬ－５、 ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｉｍｍｕｎｉｔｙ［Ｊ］．Ｌａｎｃｅｔ，１９９５，３４６（８９８６）｛ ＩＬ－６、ＩＬ－１０为特征，主要参与体液免疫应答，在抵 １３３９—１３４５． Ｃ３３薛莹，姜鸿，高雪，等．结核分枝杆菌Ｒｖ２４５０基因的克隆、表达及 御细胞外致病因子方面发挥作用，并与细胞内病原 纯化ＣＪ３．第四军医大学学报，２００４。２５（１９）１７７８—１７８１． 体所致疾病的进展相关。本实验中，我们检测了结 Ｃ４］Ｍｕｋａｍｏｌｏｖａ ＧＶ，Ｋａｐｒｅｌｙａｎｔｓ ＡＳ，Ｙｏｕｎｇ ＤＩ，ｅｔ ａ１．Ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ 核分枝杆菌Ｒｖｌ００９蛋白免疫小鼠的体液免疫和细 ａｕｔｏｃｒｉｎｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＣＪ３．Ｍｏ１ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１，２００２，４６（３）：６２３—６３５． 胞免疫的相关指标。结果显示，免疫组小鼠体内特 Ｃ５３Ｍｕｋａｍｏｌｏｖａ ＧＶ，Ｋａｐｒｅｌｙａｎｔｓ ＡＳ，Ｙｏｕｎｇ ＤＩ，ｅｔ ａ１．Ａ ｂａｃｔｅｒｉａ１ 异性的抗体滴度为１：１ ６００，证实免疫成功。免疫 ｃｙｔｏｋｉｎｅ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１９９８，９５（１５）ｔ 小鼠脾淋巴细胞悬液中ＩＦＮ一７的水平为１３５０±３４ ８９１６－８９２１． Ｃ６３Ｍａｒｔｉｎ ＣＧ，Ｎｉｃｈｏｌａｓ ＨＫ，Ａｎｇｈａｒａｄ ＰＤ，ｅｔ ａ１．Ｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｉｏｎ— ｐｇ／ｍｌ，明显高于生理盐水对照组，表明Ｒｖｌ００９蛋 ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ ｐｏｓｓｅｓｓ ａ １ｙｓｏｚｙｍｅ－ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎ ＣＪ］．Ｔｒｅｎｄｓ 白可诱导有效的细胞免疫应答；ＩＬ一１０的含量为５１２ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ，２００４，２９（１）：７－１０． ±１５ ｐｇ／ｍｌ，也明显高于生理盐水对照组７４±７ Ｐｇ／ Ｃ７３ Ｓａｓｓｅｔｔｉ ＣＭ，Ｂｏｙｄ ＤＨ，Ｒｕｂｉｎ ＥＪ．Ｇｅｎｅｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｍｙｃｏｂａｃ— ｔｅｒｉａ１ ｇｒｏｗｔｈ ｄｅｆｉｎｅｄ ｂｙ ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ＣＪ３．Ｍｏ１ Ｍｉ— ｍｌ，ＢＣＧ免疫组为４６７＿－４－１１ ｐｇ／ｍｌ。虽然，ＩＬ－ＩＯ是 ｃｒｏｂｉｏ１，２００３，４８（１）：７７—８６． 促进ＭＴＢ感染的一个因素，但实际上，在ＭＴＢ感 ［８］Ｍｕｋａｍｏｌｏｗａ ＧＶ，Ｔｕｒａｐｏｖ ＯＡ，Ｙｏｕｎｇ ＤＩ．ｅｔ ａ１．Ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ 染的过程中，Ｔｈｌ型细胞介导的免疫应答和Ｔｈ２型 ａｕｔｏｃｒｉｎｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＣＪ３．Ｍｏ１ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１，２００２，４６（３）：６２３—６３５． 细胞介导的免疫应答之间的相互平衡才是最关键 Ｃ９３ Ｓｔｅｎｇｅｒ Ｓ，Ｍｏｄｌｉｎ ＲＬ．Ｔ ｃｅｌｌ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅ— 的。以Ｒｐｆ样蛋白免疫小鼠后，ＩＬ一１０水平的增高 ｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．ＣＪ３．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１，１９９９，２（１）：８９—９３． 不能单纯地认为对机体不利；相反，这种增高有可能 Ｃ１０］Ｒｏｉａｓ Ｍ，０ｌｉｖｉｅｒ Ｍ，Ｇｒｏｓ Ｐ，ｅｔ ａ１．ＴＮＦ口ａｎｄ ＩＬ－１０ ｍｏｄｕｌａｔｅ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ ｖｉｒｕｌｅｎｔ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏ— 是对Ｔｈｌ型细胞介导的细胞免疫应答和Ｔｈ２型细 ｓｉｓ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ＣＪ］．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏ１，１９９９，１６２（１０）： 胞介导的免疫应答问的相互平衡起一种调节作 ６１２２—６１３１． 用ｎ∞。ＩＬ－１２含量与生理盐水对照组水平相当（１１２ 收稿日期：２００６—０７—１３：修回日期：２００６—１卜３０ ±１３ｐｇ／ｍ１），ＢＣＧ免疫组为４３２±１２ｐｇ／ｍｌ。 （上接第２５５页） ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ１ ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２００４，２９（１）：７—１０． 参考文献： Ｃ７３ Ｓｅｒｇｅｙ Ｂ，Ｍｕｋａｍｏｌｏｖａ ＧＶ，Ｖａｓｉｌｉｙ Ｐ，ｅｔ ａ１．Ｃｕｈｕｒａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ＣＩ］Ｎｕｅｒｍｂｅｒｇｅｒ Ｅ，Ｂｉｓｈａｉ ＷＲ，Ｇｒｏｓｓｅｔ ＪＨ．Ｌａｔｅｎｔ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｉｎ— Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｃｅｌｌｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｍｕｒｉｎｅ ｍａｃｒｏｐｈａ— ｆｅｃｔｉｏｎＣＪ］．Ｓｅｍｉｎ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ，２００４，２５（３）：３１７—３３６． ｇｅｓ；ｆｌ ｂａｃｔｅｒｉａ１ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｒｅｃｏｖｅｒｙＣＪ３．ＦＥＭＳ Ｉｍ— Ｃ２３宋文虎。肖成志，宋礼章．结核病学进展［Ｍ］．北京；光明日报出版 ｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａ１ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０００，２９（８）：２３３—２４０． 社。１９９５：１８３． Ｃ８３ Ａｄｒｉｅ ＪＣ，Ｅｄｓｍｏｎｄ ＭＣ，Ｍａｒｙ ＫＨ，ｅｔ ａ１．Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒ－ Ｃ３３Ｖｈｄｉｍｉｒ ＶＹ。Ｔａｔｉａｎａ ＫＫ，Ｅｌｖｉｒａ ＩＲ，ｅｔ ａ１．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｐｆ ｃｕｌｏｓｉｓ ＷｈｉＢ３ ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ ＲｐｏＶ ｔｏ ａｆｆｅｃｔ ｈｏｓｔ ｓｕｒｖｉｖａ１ ｂｕｔ ｉｓ Ｆａｍｉｌｙ Ｉ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｇａｉｎｓｔ ｄｉｓｐｅｎｓａｂｌｅ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｒｏｗｔｈ［Ｊ］．ＰＮＡＳ，２００２，９９（５）： Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｉｎ ＭｉｃｅＣＪ３．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２００３，７１（８）： ３１４７—３１５２． ４７８９—４７９４． Ｃ９３Ｍｕｋａｍｏｌｏｖａ ＧＶ，Ｏｂｏｌｂｅｋ ＡＴ，Ｋｏｎｓｔａｎｔ＇ｉｒ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｒｐｆ Ｃ４３Ｇａｌｉｎａ Ｖ．Ｍｕｋａｍｏｌｏｖａ Ｇ ｖ．Ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ａｕｔｏｃｒｉｎｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃ— ｇｅｎｅ ｏｆ ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ １ｕｔｅｕｓ ｅｎｃｏｄｅｓ ａｎ ｅｓｓｅｎｔｉａ１ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｔｏｒｓ ｉｎ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ｆａｃｔｏｒＣＪ３．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇＹ，２００２，４６（３）：６１１－６２１． ２００２。４６（３）：６２３—６３５． Ｃ１０３ＪｏＡａｎ ＭＴ，Ｋａｉｘｉａ Ｍ．Ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃ“一 ［５］Ｇａｌｉｎａ Ｖ，Ｍｕｋａｍｏｌｏｖａ ＧＶ，Ａｒｓｅｎｙ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ａ ｂａｃｔｅｒｉａ１ ｃｙｔｏ— ｌｏｓｉｓ Ｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｖ１００９ Ｇｅｎｅ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ Ｄｅ一 ｋｉｎｅＣＪ３．Ｍｉｃｒｏｂｉｌｏｇｙ，１９９８。９５（１５）：８９１６—８９２１． １ａｙｅｄ Ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＣＪ３．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃ６３Ｍａｒｔｉｎ ＣＧ。Ｎｉｃｈｏｌａｓ ＨＫ，Ａｎｇｈａｒａｄ ＰＤ，ｅｔ ａ１．Ｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｉｏｎ— Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２００６，７４（５）：２９８５・２９９５． ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ ｐｏｓｓｅｓｓ ａ １ｙｓｏｚｙｍｅ－ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎＣＪ３．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ 收稿日期：２００６－０８－０８；修回日期：２００６一ＩＩ一２８